המחברים מודים אנג&#39;לה Busta לקבלת סיוע בדג זברת בעלי. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומי לבריאות (AG-020,591 לSVB ו1K08AR054835 לJJD).

הערה: כל ההליכים כרוכים בדג זברה צריכה להתבצע בהתאם להנחיות רלוונטיות, תקנות וגופים הרגולטוריים. כל נהלי השימוש בבעלי החיים המוצגים במאמר זה אושרו על ידי אוניברסיטת מישיגן הוועדה על השימוש וטיפול של בעלי חיים (UCUCA). 1. הפוך לולאות תפר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים כדי להפריד תפר הלא סטרילית (USP 10 / ניילון monofilament 0, 3 רובדי) לשלושה גדילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מתחיל לקשור קשר בוהן כפול באחד מהגדילים. לעצור לפני הידוק הקשר לחלוטין כדי להפוך את לולאה (~ קוטר 1 מ&quot;מ) קטנה במקום קשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש במספריים כדי לחתוך תפר עודף מזנבות הלולאה. דוגמה ללולאה סיימה מוצגת באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את הלולאה בצד הדביק של פוסט זה הערה לשימוש מאוחר יותר. לולאות התפר תהיה בשימוש כדי להחזיק את הזחלים במקום במהלך בדיקת כוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבי 1.1-1.4 בהתאם לצורך. מאקדואר שתי לולאות תפר לכל זחל שייבחן. </li></ol> 2. הפוך פתרון בדיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע פתרון Tyrodes ידי הוספת 7.977 גרם נתרן כלורי, אשלגן כלורי 0.373 גרם, 0.265 dihydrate סידן כלוריד גרם, 0.102 hexahydrate מגנזיום כלוריד גרם, 0.048 גרם נתרן פוספט monobasic, סודיום ביקרבונט 1.000 גרם, ו0.037 dihydrate מלח חומצת ethylenediaminetetraacetic disodium גרם ל1,000 מ&quot;ל של מים מטוהרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הפתרון עד שהמלחים מתמוססים לחלוטין. פתרון זה יכול להיות מאוחסן במשך חודש ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2.1 מ&quot;ל של 4 מ&quot;ג / מיליליטר tricaine, שהוכן על פי ספר דג הזברה 24, לפתרון Tyrodes מ&quot;ל 47.9 ומערבבים. הגן על פתרון זה מאור על ידי אחסונו בבקבוק זכוכית כהה או בבקבוק זכוכית מכוסה ברדיד אלומיניום. פתרון זה צריך להיות מאוחסן בטמפרטורת חדר ועשה טרי בכל יום. </li></ol> 3. לקשור את זחל Aanesthetized לתוך תא ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"> &lt;li&gt; מקום מנגנון הבדיקה (איור 2) על הבמה של מיקרוסקופ סטריאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חברו את מתמר כוח וכבלים באורך הבקר למנגנון הבדיקה. הפעל את מתמר כוח. הפעל את הבקר האורך כך שהוא נשאר נוקשה. (הערה:.. בקר האורך מספק את היכולת למתוח או לקצר את שריר במהלך הכנת התכווצות עם זאת, תכונה זו של הבקר האורך לא נעשתה שימוש בשיטה שתוארה לעיל על כן, ניתן לחשוב על הבקר האורך של כקובץ מצורף נוקשה נקודה רכוב על מערכת מיקום XYZ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם טפטפת העברה חד פעמי, למלא את תא הניסוי עם פתרון בדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במלקחיים כדי להרים את לולאת תפר על ידי אחד מהזנבות ולתלות אותו על הצינור מתמר כוח. לתלות לולאת תפר שנייה בצינור המחובר לאורך הבקר. (הערה: לופת לולאת תפר בחלק המעוקל יכול שגעון התפר וCAUse זה לשבור בשלבים הבאים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם טפטפת העברה חד פעמי, להעביר זחל דג הזברה לצלחת פטרי קטן מלאות בפתרון בחינה. חכה להרדמה בפתרון הבדיקה (tricaine) ייכנס לתוקף (~ 1 דקות). עם מלקחיים, בעדינות לדחוף את הזנב ולוודא שהוא הרדים את הזחל בחוסר עורר מגע שחייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש פיפטה זכוכית להעביר את הזחל לתא הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על ידי נגע בעדינות את הזחל עם מלקחיים סגורים, להנחות את החלק הקדמי של הזחל דרך לולאת התפר על הצינור מתמר כוח. להנחות את החלק הקדמי של הזחל דרך לולאת התפר על הצינור. אחוז בשני זנבות לולאת תפר עם מלקחיים ולמשוך אותם בו זמנית להדק את לולאת התפר האחורית לצק החלמון או swimbladder (איור 3 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים, להחזיק את זנב לולאת תפר אחד ומושך, גורם זחל למסתובב 90 מעלות מסביב לצינור עד לצד הלטרלי של הפנים הזחלשל מעלה (איור 3). אם הלולאה הודקה מספיק, לא יהיה התנגדות מסוימת למשיכה; הזחל לא צריך להסתובב בקלות. אם הלולאה הייתה להדק יותר מדי, את הזחל לא מסתובב סביב הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במכשיר מיצוב XYZ המצורף לאורך הבקר, להעביר את צינור בקר האורך לאורך ציר ה-X (הגדרות ציר באיור 2 א) ומתחת לתא המטען והזנב של הזחל. השאר רווח בין קצות צינור הבקר ואורך הצינור מתמר כוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להנחות את לולאת התפר על הזנב של הזחל ולהדק את לולאת התפר כפי שתואר לעיל (איור 3 ג). ייתכן שיהיה צורך לסובב את החלק האחורי של זחל הצד לרוחב, כך שפונה כלפי מעלה. לקצץ את זנבות לולאת התפר (איור 3D). </li></ol> 4. זחל עמדה בתא ניסוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הזחל למרחק מתאים מתחתית התא כדי להבטיח w הזחלחולה להיות בתוך &quot;מרחק עבודה&quot; של מטרת מיקרוסקופ הפוכה במהלך השלבים הבאים. כדי להשיג זאת, להשתמש במכשירי מיצוב XYZ להנמיך את הצינורות (עם זחל מצורף) באיטיות לאורך ציר ה-Z ועד הצינורות פשוט לגעת בחלק התחתון של החדר. לאחר מכן, להעלות את הצינורות עד שהזחל הוא מרחק מתאים מתחתית התא (~ 100 מיקרומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במכשיר מיצוב XYZ המצורף הבקר האורך, להתאים את אורך צינור הבקר לאורך ציר Y כדי ליישר את ציר הזמן של הזחל עם ציר האורך של הצינור מתמר כוח. </li></ol> 5. חיל שיא במהלך התכווצות עווית מקסימלי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את מנגנון הבדיקה לבמה של מיקרוסקופ הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוון את טמפרטורת החדר לערך רצוי. כדי להתחיל, להתחבר סירקולטור המים באמבטיה, מדחום, ובקר טמפרטורה למנגנון הבדיקה. הפעל את כל מרכיבים הדרושים ולשנות את ההגדרה בטמפרטורה contrOller עד המדחום מדווח את הערך הרצוי. הנתונים הכלולים במאמר זה נאספו של 25 מעלות צלזיוס, אבל גם מדידות עשויות להתבצע על RT או על 28.5 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחבר את הכבלים מהממריץ למנגנון הבדיקה. הפעל את כוח ממריץ, אבל לא לעורר את הזחל עד שלב 5.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא את הזחל הוא מקביל לתחתית התא. דרך אובייקטיבי 40X, להציג את החלק של הזחל בין קצוות של הצינורות. אם במקביל לתחתון, בשני הקצוות של הזחל יהיו בפוקוס. במידת צורך, להתאים את הצינור מתמר כוח לאורך ציר ה-Z עד ששני קצותיו נמצאים בפוקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שאורך הזחל הוא קצר יותר מלהיות אופטימלי. הפעל את מערכת אורך sarcomere וידאו ולסובב את מצלמת וידאו כך שהפסים מקבילים לצדדים של מסגרת וידאו. מערכת זו מנטרת את מרווח striation על ידי ניתוח שינויים בעוצמת פיקסל לאורך כל שורה אופקית של פיקסלים בתוך אזור מוגדר משתמש של עניין(החזר על השקעה). את התוצאות עבור כל השורות בתוך את ההחזר על ההשקעה הן ממוצעים ודיווחו בתדירות שווה ערך לקצב פריימים (≥ 80 שניות -1) וידאו. מרווח striation משמש כמדד לאורך sarcomere. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם מיקרוסקופ כדי להתמקד בסיבים היקפיים ולציין את אורך sarcomere המצוין. אם יש צורך, להשתמש במכשיר מיצוב XYZ המצורף הבקר האורך להתאים אורך של הזחל (ציר ה-X) עד שאורך sarcomere הוא פחות מאופטימלי (1.90 מיקרומטר לדוגמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את הגירוי הנוכחי כדי לייעל את כוח העווית. כדי להתחיל, להגדיר את התפוקה הנוכחית על ממריץ לעצמה נמוכה (למשל 100 MA). ממריץ יכול להיות מופעל באופן ידני או על ידי מחשב בו פועל תכנית LabVIEW מותאמת אישית. לעורר עווית של שרירי הזחל עם דופק נוכחי של 0.2 אלפיות שני בזמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש אוסצילוסקופ כדי להקליט את תפוקת כוח ולמדוד את כוח עווית השיא באמצעות הסמנים של אוסצילוסקופ. להגביר את הזרםעל ידי 50 במרווחים תואר שני ולמדוד את כוח עווית השיא בכל רמה נוכחית. לחכות 30 שניות בין פרכוסים כדי למנוע עייפות. כתוצאת מגדילה הנוכחית גירוי, כוח עווית שיא בדרך כלל מגביר למקסימום ולאחר מכן יורד בהדרגה. הנוכחי שבו הזחל מייצר כוח הגדול ביותר הוא גירוי האופטימלי הנוכחי. קבע את משרעת הנוכחית לגירוי האופטימלי הנוכחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במכשיר מיצוב XYZ, להתאים את האורך של הזחל (ובכך, אורך sarcomere) כדי לעורר כוח עווית מרבי. זחלי דג הזברה פראי סוג (3-7 DPF) לייצר כוח מרבי עווית באורכי sarcomere של 2.10 מיקרומטר או מיקרומטר 2.15. עם זאת, אורך sarcomere ניתן להגדיר 2.08 מיקרומטר, כדי למנוע עומס יתר על הזחל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעורר עווית של שרירי הזחל. השתמש אוסצילוסקופ כדי להקליט את תגובת כוח ולשמור את הרשומה לניתוח שלאחר מכן. </li></ol> 6. למדוד ממדים שרירים עם זחל באורך אופטימלי <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את מנגנון הבדיקה חזרה למיקרוסקופ סטריאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוך שימוש בסולם העינית, למדוד את הגובה של השרירים כמו במבט מהצד. לאחר מכן, נזהר שלא לשנות את אורכו של הזחל, הזחל מסתובב ב -90 מעלות באמצעות זנבות לולאת התפר על מנת להציג את הזחל מהתחתית. למדוד את הרוחב של השרירים כפי שנצפה מתחתית. קח את המידות בציון דרך אנטומי (פתיחה ואברי המין למשל) (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את לולאות תפר עם microblade לשחרר את הזחל מציוד הבדיקה. </li></ol>

<ol>
	<li>Bassett, D. I., Bryson-Richardson, R. J., Daggett, D. F., Gautier, P., Keenan, D. G., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin+is+required+for+the+formation+of+stable+muscle+attachments+in+the+zebrafish+embryo.">Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo.</a> Development. 130 (23), 5851-5860 (2003).</li><li>Nixon, S. J., Wegner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+as+a+model+for+caveolin-associated+muscle+disease;+caveolin-3+is+required+for+myofibril+organization+and+muscle+cell+patterning.">Zebrafish as a model for caveolin-associated muscle disease; caveolin-3 is required for myofibril organization and muscle cell patterning.</a> Hum. Mol. Genet. 14 (13), 1727-1743 (2005).</li><li>Hall, T. E., Bryson-Richardson, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+candyfloss+mutant+implicates+extracellular+matrix+adhesion+failure+in+laminin+&#945;2-deficient+congenital+muscular+dystrophy.">The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin &#945;2-deficient congenital muscular dystrophy.</a> PNAS. 104 (17), 7092-7097 (2007).</li><li>Hirata, H., Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+relatively+relaxed+mutants+have+a+ryanodine+receptor+defect,+show+slow+swimming+and+provide+a+model+of+multi-minicore+disease.">Zebrafish relatively relaxed mutants have a ryanodine receptor defect, show slow swimming and provide a model of multi-minicore disease.</a> Development. 134, 2771-2781 (2007).</li><li>Dowling, J. J., Vreede, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+myotubularin+function+results+in+t-tubule+disorganization+in+zebrafish+and+human+myotubular+myopathy.">Loss of myotubularin function results in t-tubule disorganization in zebrafish and human myotubular myopathy.</a> PLoS Genet. 5 (2), e1000372 (2009).</li><li>Berger, J., Berger, S., Hall, T. E., Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dystrophin-deficient+zebrafish+feature+aspects+of+the+Duchenne+muscular+dystrophy+pathology.">Dystrophin-deficient zebrafish feature aspects of the Duchenne muscular dystrophy pathology.</a> Neuromuscul. Disord. 20 (12), 826-832 (2010).</li><li>Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+models+for+human+FKRP+muscular+dystrophies.">Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies.</a> Hum. Mol. Genet. 19 (4), 623-633 (2010).</li><li>Wallace, L. M., Garwick, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DUX4,+a+candidate+gene+for+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy,+causes+p53-dependent+myopathy+in+vivo.">DUX4, a candidate gene for facioscapulohumeral muscular dystrophy, causes p53-dependent myopathy in vivo.</a> Ann. Neurol. 69, 540-552 (2011).</li><li>Sztal, T. E., Sonntag, C., Hall, T. E., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epistatic+dissection+of+laminin-receptor+interactions+in+dystrophic+zebrafish+muscle.">Epistatic dissection of laminin-receptor interactions in dystrophic zebrafish muscle.</a> Hum. Mol. Genet. , (1093).</li><li>Kawahara, G., Karpf, J. A., Myers, J. A., Alexander, M. S., Guyon, J. R., Kunkel, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+screening+in+a+zebrafish+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy.">Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy.</a> PNAS. 108 (13), 5331-5336 (2011).</li><li>Berger, J., Berger, S., Jacoby, A. S., Wilton, S. D., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+exon-skipping+strategies+for+Duchenne+muscular+dystrophy+utilizing+dystrophin-deficient+zebrafish.">Evaluation of exon-skipping strategies for Duchenne muscular dystrophy utilizing dystrophin-deficient zebrafish.</a> J. Cell Mol. Med. 15 (12), 2643-2651 (2011).</li><li>Seger, C., Hargrave, M., Wang, X., Chai, R. J., Elworthy, S., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Pax7+expressing+myogenic+cells+in+zebrafish+muscle+development,+injury,+and+models+of+disease.">Analysis of Pax7 expressing myogenic cells in zebrafish muscle development, injury, and models of disease.</a> Dev. Dyn. 240, 2440-2451 (2011).</li><li>Postel, R., Vakeel, P., Topczewski, J., Kn&#246;ll, R., Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+integrin-linked+kinase+is+required+in+skeletal+muscles+for+strengthening+the+integrin-ECM+adhesion+complex.">Zebrafish integrin-linked kinase is required in skeletal muscles for strengthening the integrin-ECM adhesion complex.</a> Dev. Biol. 318 (1), 92-101 (2008).</li><li>Zoeller, J. J., McQuillan, A., Whitelock, J., Ho, S. Y., Iozzo, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+central+function+for+perlecan+in+skeletal+muscle+and+cardiovascular+development.">A central function for perlecan in skeletal muscle and cardiovascular development.</a> J. Cell Biol. 181 (2), 381-394 (2008).</li><li>Kim, H. R., Ingham, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+matrix+protein+TGFBI+promotes+myofibril+bundling+and+muscle+fibre+growth+in+the+zebrafish+embryo.">The extracellular matrix protein TGFBI promotes myofibril bundling and muscle fibre growth in the zebrafish embryo.</a> Dev. Dyn. 238, 56-65 (2009).</li><li>Beqqali, A., Monshouwer-Kloots, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHAP+is+a+newly+identified+Z-disc+protein+essential+for+heart+and+skeletal+muscle+function.">CHAP is a newly identified Z-disc protein essential for heart and skeletal muscle function.</a> J. Cell Sci. 123 (7), 1141-1150 (2010).</li><li>Huang, H., Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity,+uptake+kinetics+and+behavior+assessment+in+zebrafish+embryos+following+exposure+to+perfluorooctanesulphonicacid+(PFOS).">Toxicity, uptake kinetics and behavior assessment in zebrafish embryos following exposure to perfluorooctanesulphonicacid (PFOS).</a> Aquat. Toxicol. 98 (2), 139-147 (2010).</li><li>Sylvain, N. J., Brewster, D. L., Ali, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish+embryos+exposed+to+alcohol+undergo+abnormal+development+of+motor+neurons+and+muscle+fibers.">Zebrafish embryos exposed to alcohol undergo abnormal development of motor neurons and muscle fibers.</a> Neurotoxicol. Teratol. 32 (4), 472-480 (2010).</li><li>Chandrasekar, G., Arner, A., Kitambi, S. S., Dahlman-Wright, K., Andersson-Lendahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+of+the+environmental+pollutant+4-nonylphenol+in+zebrafish.">Developmental toxicity of the environmental pollutant 4-nonylphenol in zebrafish.</a> Neurotoxicol. Teratol. 33 (6), 752-764 (2011).</li><li>Buss, R. R., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+embryonic+red+and+white+muscle+fibers+during+fictive+swimming+in+the+developing+zebrafish.">Activation of embryonic red and white muscle fibers during fictive swimming in the developing zebrafish.</a> J. Neurophysiol. 87 (3), 1244-1251 (2002).</li><li>Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=neb:+a+zebrafish+model+of+nemaline+myopathy+due+to+nebulin+mutation.">neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation.</a> Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).</li><li>Dowling, J. J., Arbogast, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+successful+antioxidant+treatment+in+models+of+RYR1-related+myopathy.">Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy.</a> Brain. 135 (4), 1115-1127 (2012).</li><li>Dou, Y., Andersson-Lendahl, M., Arner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+skeletal+muscle+in+zebrafish+early+larvae.">Structure and function of skeletal muscle in zebrafish early larvae.</a> J. Gen. Physiol. 131, 445-453 (2008).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).</li><li>Herr, V. D., Sonnenburg, D. C., Courogen, P. M., Fiamengo, S. A., Downes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle+weakness+during+tricaine+anesthesia.">Muscle weakness during tricaine anesthesia.</a> Comp Biochem Physiol Part C. 110 (3), 289-296 (1995).</li><li>Frazier, D. T., Narahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricaine+(MS-222):+effects+of+ionic+conductances+of+squid+axon+membranes.">Tricaine (MS-222): effects of ionic conductances of squid axon membranes.</a> Eur. J. Pharmacol. 33 (2), 313-317 (1975).</li><li>Saint-Amant, L., Drapeau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+course+of+the+development+of+motor+behaviors+in+the+zebrafish+embryo.">Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo.</a> J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

שיטה זו מודדת דור תוקף במהלך עווית כדי להעריך את תפקוד שריר בשרירי תא מטען של זחלי דג הזברה. למרות התכווצויות tetanic יכולות להיות שהושרו בזחלי דג הזברה (למשל על ידי 200 פעימות גירוי / שני לתקופה של 0.2 שניות), כוח tetanic המרבי הוא רק 10-15% יותר מאשר כוח העווית המרבי. לכן, כוח שנוצר במהלך עווית הוא מידה סבירה של יכולת ייצור כוח. עוויתות עדיפות על התכווצויות tetanic בגלל פרכוסים נוטים פחות לגרום לקריעה או החלקה בקשרי התפר. כדי להפיק נתונים משמעותיים עם טכניקה זו, עווית כוח מרבי צריך להיות מושגת לכל זחל והשונות בין קבוצות ניסוי צריכים להיות ממוזערים. עם מטרות אלה בחשבון, אנו מציעים את ההצעות הבאות. ראשית, לטפל בעת קשירת הזחל למתמר כוח ואת הצינורות באורך הבקר. אם לולאות התפר הם הידק מדיהרבה, התפר יהיה לחתוך את רקמת השריר. אם לולאות התפר לא הידק מספיק, כוח שנוצר על ידי הזחל לא יועבר במלואו למתמר כוח. שני מצבים, אבל בעיקר באפשרות השנייה, אל תזלזלו בכוח העווית מרבי. שנית, מאז בדיקת קבוצות ניסוי מרובות יכול לקחת כמה שעות (20-30 דקות / זחל), חלופיות בין קבוצות בגלל זחלים ימשיכו לפתח במהלך תקופת הבדיקה. בעוד שחלק מהציוד שהוזכר הוא חיוני למדידת כוח העווית המרבית (מתמר כוח למשל, ממריץ נוכחי), פריטים אחרים הם לא הכרחיים. מערכת אורך sarcomere וידאו רצויה אבל לא חובה. כחלופה, ניתן להשתמש בסדרה של פרכוסים למצוא אורך אופטימלי, שבמהלכו אורכו של הזחל מותאם עד עווית כוח מרבי מושגת. מערכת בקרת טמפרטורה היא גם לא הכרחית. בקרת טמפרטורה היא קריטית כאשר מאהקינטיקה עווית Suring, שהם רגישים מאוד לטמפרטורה, ואילו כוח העווית מרבי הוא לא רגיש במיוחד לשינויים קטנים בטמפרטורה ובניתן היה למדוד בטמפרטורת חדר. שים לב שללא קשר לטמפרטורה בתא במהלך בדיקת כוח, יש לשמור את הזחלים בטמפרטורת הצמיחה האופטימלית של 28.5 מעלות צלזיוס 24 לפני לכפות בדיקה להיערכות מדויקת. הזחלים נבדקים בתמיסה המכילה Tyrodes tricaine. אנו משתמשים 0.02% (w / v) tricaine, הריכוז מומלץ להרדמה 24, כדי לחסל את ההתכווצויות ספונטניות עוררו על ידי מערכת עצבים ובכך למנוע עייפות במהלך בדיקת כוח. Tricaine גם מאפשר לקשור על הצעד ומצמצם את זמן בדיקה כולל. עם זאת, אנו צופים שכוללים tricaine בפתרון בדיקת עקביות מפחית את כוח המרבי העווית בכ -30%. השפעה דומה גם נצפתה בשריר זנב ראשן, שם tricaine מצטמצם דור תוקף לאחר שידור התוקפת היה חסום, מה שמרמז שיש tricaine השפעה ישירה על שרירים 25. Tricaine עשוי להפחית את רגישות תאי שריר על ידי הפחתת מוליכות נתרן על פני קרום התא, כפי שהיא עושה בתאי עצב 26. אפשרויות אחרות לחסימת הפעלה על ידי motoneurons הן D-tubocurarine וα-bungarotoxin אבל, שלא כמו tricaine, תרכובות אלה אינן עור חדירה וחייבים להיות מוזרקים ישירות לתוך הראש, בעמוד השדרה, או לב 27. חוקרים בודדים יצטרכו להעריך האם או לא tricaine רצוי עבור היישום הספציפי שלהם. אם tricaine כלול בפתרון הבדיקה, הריכוז צריך להיות עקבי בין ניסויים וחוקרים צריכים לוודא שההשפעה של tricaine אינו משתנה בין קבוצות ניסוי. אנו מתארים שיטה זו לזחלים צעירים כ3 DPF ועתיק כמו 7 DPF כ. אמנם מופיעים סיבי שריר להיות פוnctional מוקדם ככל 17 שעות לאחר הפריה, כאשר תנועות זנב ספונטניות בגין 27, אורכו של הזנב הקצר לפני 3 DPF מעכב קשירת הזחל לציוד הבדיקה. אנחנו בדרך כלל לא לבדוק זחל לאחר 7 DPF מאז מודלים מחלה רבים לא שורדים זמן רב יותר מהזמן הזה. אם בדיקת זחלים מעבר 5 DPF, צריכים להיות מוזנים הזחלים. ראינו כי יש לי זחלים יאכילו שרירים קטנים יותר וליצור כוח עווית פחות ממקסימום הזחלים נמאס, כנראה עקב צמצום השק החלמון. ולכן זה עשוי להיות רצוי לבדוק זחלים בין 3-5 DPF, כדי למנוע את המשתנה הנוסף של האכלה חיצונית. לסיכום, אנו מתארים שיטה כמותית ואמינה למדידת דור תוקף במהלך התכווצות עווית שריר מקסימלי של תא מטען הזחל דג הזברה. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי להעריך את בריאותו הכללית של שריר הזחל דג הזברה ובאופן ספציפי מספקת מידע על תפקוד שרירים. בנוסף לאספקת מידע עלסדר גודל של דור כוח, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי ללמוד את הקינטיקה של דור כוח או להיות מותאם ללמוד שריר עייפות 22. למרות שאנו מתארים טכניקה זו לשימוש עם פראי סוג זחלים, שיטה זו יכולה לשמש לזחלים מהונדסים גנטיים או לזחלים שטופלו בתרופות או toxicants, לאפיין מודלים מחלת שריר ולהעריך את הטיפולים, או ללמוד פיתוח שרירים, פגיעה בשרירים, או רעילות כימית שריר בנושא.

זחלים צעירים דג הזברה (Danio rerio), 3-7 ימים לאחר ההפריה (DPF), מוכרים יותר ויותר כאורגניזם שימושי למחקר שרירי שלד. זחלים צעירים משמשים למחלת שריר 1-9 האנושית מודל, להעריך תרופות ואסטרטגיות טיפוליות 10-11, מחקר פגיעה בשרירים 12, מבין שריר פיתוח 13-16, ולחקור את הרעילות כימית שרירים הקשורים 17-19. מחקרים אופייניים באזורים אלה לבחון את המידה שבה שריר בריא הוא שניתנו על ידי מניפולציה גנטית חריג או חשיפה לרעלים, וכמה מחקרים לבחון את המידה שבה שריר נורמלי מגיב לטיפול. קריטי להצלחה של מחקרים אלה הוא היכולת להעריך את בריאות שריר בצורה מדויקת. אמנם יש מגוון של שיטות זמינות כדי להעריך את בריאות שרירים בזחלי דג הזברה, מעטים לספק מידע ישיר על תפקוד שרירים. בריאות שריר בדרך כלל מוערכת על ידי appearancדואר, כפי שהוערך על ידי צביעת היסטולוגית 6,8,11, immunostaining 9,15,16,18, מיקרוסקופ אור 3,13, מיקרוסקופית אלקטרונים 3,4,14,16, או שבירה כפולה 7,9,11, אבל טכניקות אלה מספקים מידע מורפולוגי בלבד. תא מטען והתקות זנב ושחייה מהיר 4,17 להעריך תפקוד מוטורי, אבל אלה אינם אמצעים ישירים של תפקוד שרירים שכן הם משקפים גם קלט עצבי, חילוף החומרים של אנרגיה, ותהליכים אחרים. בניגוד לכך, מדידת דור כוח במהלך ההתכווצות מספקת הערכה ישירה של תפקוד שרירים ומייצג מדד לבריאות שרירים כללי. יתרונות נוסף של גישה זו כוללים ניתוח נתונים פשוט, ותוצאות כמותיות. במאמר זה וידאו, אנו מספקים נוהל מפורט למדידת כוח על ידי דור שרירי זחל, בתקווה שחוקרים יותר יהיו להשתמש בשיטה זו כדי להשלים את האמצעים קיימים של בריאות שריר במחקר שלהם. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; המטרה הכללית של שיטה זו היא למדוד דור כוח במהלך ההתכווצות של שריר תא מטען הזחל דג הזברה. כדי להשיג מטרה זו, זחל דג הזברה הוא מורדם ולהציב לתוך חדר מלא בתמיסת מלח. הקצה הקדמי של הזחל קשור למתמר כוח ואת הקצה האחורי של הזחל קשור לאורך הבקר. הפעלת שרירים מושגת על ידי גירוי שדה חשמלי, וזרם הגירוי ואת אורכו של הזחל מותאמים להפקת כוח מרבי עווית. התכווצות עווית איזומטרי היא שהושרו ותגובת כוח נרשמת לניתוח. כדי להיות ברור, טכניקה זו אינה מודדת כוחות שנוצרו על ידי שרירי זחל במהלך השחייה. כי שני הקצוות של הזחל קשורים לציוד ובגלל הזחל נותר מורדם, זה לא יכול ליזום תנועה במהלך בדיקה. יתר על כן, גירוי תחום מפעיל את כל סיבי השריר באותו הזמן כדי לגרום למליארדהתכווצות ateral, וזה לא מה שמתרחש באופן טבעי 20. לכן, במקום למדוד כוחות בפועל נוצרו במהלך חייה, טכניקה זו קובעת את יכולת הפקת כוח של שרירי הזחל. יש לנו להשתמש בטכניקה זו כדי להפגין חולשה בשרירים במודל דג הזברה של nemaline מיופתיה 21, כמו גם להעריך את ההשפעה של טיפול נוגד חמצון בתפקוד שרירים במודל דג הזברה של מחלה רבת MiniCore 22. אחרים השתמשו בטכניקה דומה 23 כדי לבחון את ההשפעות של מזהמים סביבתיים על תפקוד שרירים 19.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tricaine powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonsterile-suture</td>
			<td>Ashaway Line &amp; Twine</td>
			<td>S30002</td>
			<td>USP 10/0 monofilament nylon (3 ply)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>Vannas</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ8</td>
			<td>Illuminated with Fostec EKE ACE I light source</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Force transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>400A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Length controller</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>318B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>XYZ positioning devices</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>3936M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>BAT-12</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>Cut end to widen opening and facilitate larva transfer</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-11YZ </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Axiovert 100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Water bath circulator</td>
			<td>Neslab Instruments</td>
			<td>RTE-111</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Alpha Omega Instruments</td>
			<td>Series 800</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>701C</td>
			<td>High-power, follow stimulator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Video sarcomere length system</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>900B-5A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LabVIEW software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Nicolet Technologies</td>
			<td>ACCURA 100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microblade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microblade holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10053-13</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Data analysis software (Signo)</td>
			<td>Alameda Applied Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae

זחלי דג הזברה לספק מודלים של פיתוח שרירים, מחלות שריר ורעילות כימית שריר בנושא, אך מחקרים הקשורים לעתים קרובות חוסר אמצעים פונקציונליים של בריאות שריר. במאמר זה וידאו, אנו מדגימים שיטה למדידת דור כוח במהלך ההתכווצות של שריר תא מטען הזחל דג הזברה. מדידות כוח הם השיגו על ידי הצבת זחל מורדם לחדר מלא בתמיסת מלח. הקצה הקדמי של הזחל קשור למתמר כוח ואת הקצה האחורי של הזחל קשור לאורך הבקר. התכווצות עווית איזומטרי היא שהושרו על ידי גירוי שדה חשמלי וכוח התגובה היא רשמה לניתוח. דור חיל במהלך ההתכווצות מספק מדד של בריאות שרירים כללית ובאופן ספציפי מספק מדד לתפקוד שרירים. למרות שאנו מתארים טכניקה זו לשימוש עם פראי סוג זחלים, ניתן להשתמש בשיטה זו עם זחלים מהונדסים גנטיים או עם זחלים שטופלו בתרופות או toxicants,כדי לאפיין מודלים מחלת שריר ולהעריך את הטיפולים, או ללמוד פיתוח שריר, פציעה, או רעילות כימית.

בזחלי דג הזברה פראי סוג בריאים, סיבי השריר צריכים להיות מקבילים אחד לשני בלי פערים גדולים ביניהם ויש להם פסים מאליו (איור 5 א). זחלי דג הזברה פראי מסוג שאינו מציגים תכונות אלה, או עם נזק ניכר כגון סיבים מנותקים (איור 5), אמורים להיות מושלכים. עלילת נציג של כוח עווית שיא לעומת גירוי נוכחי לזחל דג הזברה אחת מוצגת באיור 6. לזחלי דג הזברה פראי מסוג שבין 3-7 DPF, הגירוי האופטימלי הנוכחי היא בדרך כלל בין 400-600 מיליאמפר, עם זחלי DPF 3 בדרך כלל דורשים גירוי יותר מאשר נוכחי זחלי DPF 6-7. נתוני כוח הגלם (נאסף במהלך שלב 5.8) יש להיות מעובד ומנותח עם תוכנה לניתוח נתונים. ראשית, נקודת ההתחלה של שיא כוח מוגדרת כאפס. שנית, מתח היציאה של מתמר כוח מומרת לתוקף (מ &#39;N) (ראה הוראות יצרן כדי ליצור עקומת כיול למתמר כוח). תגובת כוח נציג נאספה במהלך התכווצות עווית מקסימלי של זחל אחד מוצגת באיור 7. תוכנת ניתוח הנתונים ניתן להשתמש כדי למדוד את שיא כוח ותכונות אחרות של כוח התגובה. סט נציג נתוני שיא כוח מהתכווצויות עווית מקסימלי מוצג באיור 8 א. ערכים אופייניים שיא עווית כוח למגוון פראי סוג 3-7 DPF זחלי 0.9-1.7 Mn, עם זחלים מבוגרים יותר לייצר יותר כוח מאשר זחלים צעירים. הבדלים בכוח עווית שיא יכולים להיות בגלל תהליכים נורמלים כמו גדילה והתפתחות (איור 8) או תהליכים חריגים כגון גן הפתולוגיה הקשורה למוטציה 21,22. נורמליזציה בשטח חתך שריר (CSA) יכולה לשמש כדי לקבוע את המידה שבה הבדלים בכוח עווית שיא הם פשוט בגלל differe<html> nces בגודל של 21,22 שרירים. ניתן להעריך CSA השריר תוך שימוש בנוסחה: CSA = π (/ 2) (ב / 2), שבו הוא הגובה של השרירים כמו במבט מהצד, B הוא הרוחב של השרירים כפי שנצפה מחלקו התחתון, וחתך אליפטי הנחה. ערכי CSA אופייניים עבור מגוון זחלי DPF 3-7 פראי סוג 0.027-0.034 2 מ&quot;מ, עם זחלי DPF 3-4 בדרך כלל מראים ערכי CSA קטנים יותר מאשר זחלי DPF 5-7. סט נציג נתוני שיא כוח מנורמל מהתכווצויות עווית מקסימליים מוצג בתרשים 8. ערכים אופייניים מנורמלים שיא עווית כוח למגוון פראי סוג 3-7 DPF זחלי 34-51 MN / 2 מ&quot;מ, עם זחלי DPF 4-7 בדרך כלל מראים ערכים גדולים מזחלי DPF 3. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig1.jpg" /> איור 1. לולאת תפר. חיצים מצביעים על זנבות לולאת התפר. ve_content &quot;עבור: לשמור-together.within עמודים =&quot; תמיד &quot;&gt; <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig2.jpg" /> איור 2. () מנגנון בדיקה עם רכיבים שכותרתו. (B) תקריב נוף של תא הניסוי. (א) תא ניסוי עם תחתית שקופה. (ב) מתמר כוח. מיצוב התקנים (ג) הבקר אורך. (ד) XYZ. X, Y, Z והצירים מוגדרים בפינה הימנית העליונה. (ה) מערכת בקרת טמפרטורת ניצול מודולים תרמואלקטרי. צינורות להכיל זרימת מים לקירור של מודולים תרמואלקטרי. (ו) צינור נירוסטה מחובר לכפות מתמר. (ז) צינור נירוסטה מחובר לאורך הבקר. אלקטרודות צלחת מקבילות (ח) microprobe המדחום. (I) Platinum, פורש את אורכו שלקאמרי. צלחות פלטינה הן 2.5 מ&quot;מ גבוה ו0.255 מ&quot;מ עובי. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig3.jpg" /> איור 3. קשירת זחל לתא ניסוי. () זחל קשור בסוף קדמי אבל עדיין לא סובב 90 מעלות. (ב &#39;) לאחר שזחל 90 סובב °. (ג) הזחל קשור בקצה אחורי אך עדיין לא הסתובב. (ד&#39;) לאחר שהזחל זנבות לולאה הסתובבו ותפר הם גזומים. <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig4.jpg" /> איור 4. מדידות להערכת שטח חתך. שרירים כפי שנצפו מ() והצד (ב &#39;) </stron<html> תחתון&gt; גרם. מיקום של הקווים האדומים מציין את מיקומו של הפתח ואברי המין. אורך הקווים האדומים מציין את הגובה והרוחב של השרירים כמו במבט מהצד והתחתון בהתאמה. <img alt="איור 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig5.jpg" /> איור 5. תצוגה לרוחב של שרירי תא מטען זחלי דג הזברה. () רקמה בריאה. (ב &#39;) עם רקמות נזק ניכר. Contractures נובע מפלוגות סיבים מסומנים בכוכביות. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig6.jpg" /> איור 6. עלילת נציג של כוח עווית שיא לעומת גירוי נוכחי. הנוכחית הגירוי האופטימלי היא 500 אמפר. e = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig7.jpg" /> איור 7. שיא כוח נציג להתכווצות עווית אחת. התכווצות זו שהושרו עם דופק גירוי ב0 אלפיות שני. שיא כוח הוא 1.56 Mn. <img alt="איור 8" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig8.jpg" /> איור 8. נתוני כוח נציג 3-7 זחלי DPF. () נתוני שיא כוח מהתכווצויות עווית מקסימליים. (ב &#39;) נתונים שיא כוח מהתכווצויות עווית מקסימליים מנורמל CSA. זחלים בוגרים (6-7 DPF) הואכלו Hatchfry Encapsulon כיתה 0 עם ספירולינה (Argent מעבדות) החלו ב -5 בDPF. אמצעי + סטיות תקן מדווחים עם N = 5 בכל קבוצה. קבוצות שונות באופן משמעותי מזחלי DPF 3 (*) ו4 זחלי DPF (#) מצוינות (ANOVA, p &lt;0.05). העלייה המשמעותית בכוח מנורמל בין 3 ל -4 DPF (ב &#39;) מצביעה על גידול ביכולת הפקת כוח הפנימית במהלך פרק זמן זה, ואילו העלייה בכח בין 4 ל 6-7 DPF () מיוחסת לצמיחה מבוססת על שום לשנות 4 עד 7 DPF בכוח מנורמל.

Watch this Scientific Journal Video about Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

מדידות כוח ניתן להשתמש כדי להדגים שינויים בתפקוד שרירים עקב פיתוח, פציעה, מחלה, טיפול או רעילות כימית. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את שיטה למדידת כוח בכיווץ מקסימאלי של שריר תא מטען הזחל דג הזברה.

מדידת כוח במהלך התכווצות כדי להעריך את תפקוד שריר בזחלי דג הזברה

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

force-measurement-during-contraction-to-assess-muscle-function

Research

JoVE Journal

Biology

15.5K Views.  University of Michigan. מדידות כוח ניתן להשתמש כדי להדגים שינויים בתפקוד שרירים עקב פיתוח, פציעה, מחלה, טיפול או רעילות כימית. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את שיטה למדידת כוח בכיווץ מקסימאלי של שריר תא מטען הזחל דג הזברה.

Video: Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

ברזולוציה גבוהה מדידה של התנהגות ריח מונחה על הזחלים תסיסנית

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection של עוברי דג הזברה לנתח פונקציה ג&#39;ין

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Using the optokinetic response to study visual function of zebrafish

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish1-5. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adult zabrafish. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish with our simple custom-built apparatus using a new protocol which is established in our lab. Both our apparatus and step-by-step procedure of OKR in adult zebrafish are illustrated in this video. In addition, the measurements of the larval OKR, as well as the optomotor response (OMR) test of adult zebrafish, are also demonstrated in this video. This OKR assay of adult zebrafish in our experiment may last for up to 4 hours. Such OKR test applied in adult fish will benefit to visual function investigation more efficiently when the adult fish vision system is manipulated.
Su-Qi Zou and Wu Yin contributed equally to this paper.

Optokinetic response has been widely used to assess the visual functions of larval zebrafish. Nevertheless, the standard protocol for larval fish is not yet readily applicable in adults1-5. Here, we introduce how to measure the OKR of adult zebrafish using a new protocol which is established in our lab.

שימוש בתגובה optokinetic ללמוד לתפקד החזותי של דג הזברה

Optokinetic response (OKR) is a behavior that an animal vibrates its eyes to follow a rotating grating around it. It has been widely used to assess the ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Microinjections תוך ורידי של הזחלים דג הזברה לחקר פגיעה כליות חריפה

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

הקרינה מבוסס מדידה הכניסה חנות המופעל הסידן בתאים חיים: מתא הסרטן תרבותי כדי סיב שריר שלד

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Microgavage of Zebrafish Larvae

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe interactions17-25. Experimental approaches for studying intestinal biology often require the in vivo introduction of selected materials into the lumen of the intestine. In the larval zebrafish model, this is typically accomplished by immersing fish in a solution of the selected material, or by injection through the abdominal wall. Using the immersion method, it is difficult to accurately monitor or control the route or timing of material delivery to the intestine. For this reason, immersion exposure can cause unintended toxicity and other effects on extraintestinal tissues, limiting the potential range of material amounts that can be delivered into the intestine. Also, the amount of material ingested during immersion exposure can vary significantly between individual larvae26. Although these problems are not encountered during direct injection through the abdominal wall, proper injection is difficult and causes tissue damage which could influence experimental results. We introduce a method for microgavage of zebrafish larvae. The goal of this method is to provide a safe, effective, and consistent way to deliver material directly to the lumen of the anterior intestine in larval zebrafish with controlled timing. Microgavage utilizes standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment common to most laboratories that perform zebrafish research. Once fish are properly positioned in methylcellulose, gavage can be performed quickly at a rate of approximately 7-10 fish/ min, and post-gavage survival approaches 100% depending on the gavaged material. We also show that microgavage can permit loading of the intestinal lumen with high concentrations of materials that are lethal to fish when exposed by immersion. To demonstrate the utility of this method, we present a fluorescent dextran microgavage assay that can be used to quantify transit from the intestinal lumen to extraintestinal spaces. This test can be used to verify proper execution of the microgavage procedure, and also provides a novel zebrafish assay to examine intestinal epithelial barrier integrity under different experimental conditions (e.g. genetic manipulation, drug treatment, or exposure to environmental factors). Furthermore, we show how gavage can be used to evaluate intestinal motility by gavaging fluorescent microspheres and monitoring their subsequent transit. Microgavage can be applied to deliver diverse materials such as live microorganisms, secreted microbial factors/toxins, pharmacological agents, and physiological probes. With these capabilities, the larval zebrafish microgavage method has the potential to enhance a broad range of research fields using the zebrafish model system.

We present a novel method for microgavage of larval zebrafish utilizing standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment. We demonstrate that microgavage is a safe and efficient technique useful for delivering controlled amounts of diverse materials specifically into the larval zebrafish intestinal lumen.

Microgavage של זחלי דג זברה

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

מדידה של תפקוד של שריר חלק ברקמות מבודדות אמבט-היישומים למחקר פרמקולוגיה

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Microinjection דג הזברה למודל אי-ספיקת כליות חריפה

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

ברזולוציה גבוהה Respirometry להעריך תפקוד מיטוכונדריאלי permeabilized ו תאים שלמים

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...