Die Autoren danken Angela Busta für die Unterstützung bei Zebrafisch Tierhaltung. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (AG-020591 zum SVB und 1K08AR054835 zu JJD) unterstützt.

Hinweis: Alle Verfahren, die Zebrafisch sollte in Übereinstimmung mit den einschlägigen Richtlinien, Vorschriften und Regulierungsbehörden durchgeführt werden. Alle tierischen Einsatz Verfahren in diesem Artikel gezeigt wurden von der University of Michigan Ausschuss für die Nutzung und Pflege der Tiere (UCUCA) zugelassen. 1. Als Naht Loops <ol><li> Verwenden einer Pinzette auf nicht-sterile Nahtmaterial (USP 10/0 Monofilament Nylon, 3-Schicht) in drei Stränge zu trennen. </li><li> Fangen Sie an, einen doppelten Knoten in einem der Stränge binden. Stoppen Sie vor dem Anziehen der Knoten vollständig auf eine kleine (~ 1 mm Durchmesser)-Schleife anstelle von einem Knoten zu machen. </li><li> Mit einer Schere, um überschüssiges Nahtmaterial aus der Schleife Schwänze abgeschnitten. Ein Beispiel für ein fertig Schleife in Abbildung 1 dargestellt. </li><li> Legen Sie die Schleife auf der klebrigen Seite eines Post-it Note für die spätere Verwendung. Die Nahtschleifen wird verwendet, um die Larven in Kraft während Tests zu halten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1.1-1.4 wie nötig. Make zwei Nahtschleifen für jede Larve, die getestet werden. </li></ol> 2. Als Testlösung <ol><li> Als Tyrodes-Lösung durch Zugabe von 7.977 g Natriumchlorid, 0,373 g Kaliumchlorid, 0,265 g Calciumchlorid-dihydrat, 0,102 g Magnesiumchlorid-Hexahydrat, 0,048 g Natriumdihydrogenphosphat, 1,000 g Natriumbicarbonat und 0,037 g Ethylendiamintetraessigsäure-Dinatriumsalz-Dihydrat in 1000 ml gereinigtes Wasser. </li><li> Rühren Sie die Lösung bis die Salze vollständig gelöst sind. Diese Lösung kann für einen Monat bei 4 ° C gelagert werden </li><li> In 2,1 ml 4 mg / ml Tricaine, hergestellt nach dem Zebrafisch Buch 24, auf 47,9 ml Tyrodes Lösung und mischen. Schützen Sie diese Lösung vor Licht, indem sie in einer dunklen Glasflasche oder in einer Glasflasche mit Aluminiumfolie abgedeckt. Diese Lösung sollte bei Raumtemperatur gelagert werden und machte jeden Tag frisch. </li></ol> 3. Tie Aanesthetized Larve in Experimental Kammer <ol> &lt;li&gt; Legen Sie das Prüfgerät (Abbildung 2) auf der Bühne eines Stereo-Mikroskop. </li><li> Verbinden Sie den Kraftaufnehmer und Länge Controller Kabel an das Prüfgerät. Schalten Sie den Kraftaufnehmer. Schalten Sie den Controller Länge, so dass es starr bleibt. (Hinweis:.. Die Länge Steuerung bietet die Möglichkeit, sich zu strecken oder verkürzen Muskel-Präparat während einer Kontraktion jedoch dieses Merkmal der Länge Controller nicht in dem hier beschriebenen Verfahren verwendet daher kann die Länge der Controller als starre Verbindung angesehen werden Punkt montiert auf ein XYZ positioning system). </li><li> Mit einem Einweg Transferpipette, füllen Sie den experimentellen Kammer mit Testlösung. </li><li> Verwenden einer Pinzette zu holen ein Fadenschleife von einem der Schwänze und hängen Sie es an der Kraft Schallwandlerrohr. Hängen Sie einen zweiten Fadenschleife auf dem Rohr an der Länge Controller. (Hinweis: Greifen eines Fadenschleife auf dem gekrümmten Teil kann knicken die Naht und cause es während der nachfolgenden Schritte zu brechen). </li><li> Mit einem Einweg-Übertragung abpipettiert, eine Zebrafischlarve einer kleinen Petrischale mit Testlösung gefüllt. Warten, bis die Betäubung in der Testlösung (Tricaine) wirksam (~ 1 min) zu nehmen. Mit einer Pinzette vorsichtig schubsen den Schwanz und sicherstellen, dass die Larve betäubt durch einen Mangel an Berührung-evozierte Schwimmen ist. </li><li> Verwenden Sie eine Glaspipette, die Larve der experimentellen Kammer übertragen. </li><li> Durch leichtes Antippen des Larve mit geschlossenen Pinzette, führen den vorderen Teil der Larve durch die Fadenschleife am Kraftaufnehmer Rohr. Führen des vorderen Teils der Larven durch die Fadenschleife auf dem Schlauch. Fassen Sie beide Fadenschleife Schwänze mit Zange und ziehen Sie gleichzeitig die Fadenschleife hinter dem Dottersack oder Schwimmblase (3A) anziehen. </li><li> Mit einer Pinzette, halten eine Fadenschleife Schwanz und ziehen, wodurch die Larven bis 90 ° um das Rohr drehen, bis der lateralen Seite der Larve Gesichts bis (3B). Wenn die Schleife genug angezogen wurde, wird es einige Widerstand gegen den Zug sein, die Larve nicht leicht schwenken. Wenn die Schleife zu fest angezogen wurde, wird die Larve nicht um das Rohr schwenken. </li><li> Mit dem XYZ-Positioniereinrichtung, die an der Länge Controller, bewegen die Länge Controller Rohr entlang der X-Achse (Achse Definitionen in 2A) und unter dem Rumpf und Schwanz der Larve. Lassen Sie Platz zwischen den Enden der Länge Controller Rohr und der Kraft Schallwandlerrohr. </li><li> Führen Sie den Fadenschleife über den Schwanz der Larve und ziehen Sie die Fadenschleife wie zuvor beschrieben (3C). Möglicherweise müssen Sie den hinteren Teil der Larve schwenken, so dass die seitlichen nach oben zeigt. Schneiden Sie die Fadenschleife Schwänze (3D). </li></ol> 4. Position Larve in Experimental Kammer <ol><li> Bewegen Sie die Larve zu einem angemessenen Abstand vom Boden der Kammer, um die Larven zu gewährleisten wkrank im &quot;working distance&quot; von einem inversen Mikroskop objektiv zu sein während der nachfolgenden Schritte. Um dies zu erreichen, verwenden Sie die XYZ-Positionierung Geräte langsam senken die Rohre (mit angeschlossenem Larve) entlang der Z-Achse, bis die Rohre gerade berühren den Boden der Kammer. Dann heben Sie die Rohre bis die Larve ist ein angemessener Abstand vom Boden der Kammer (~ 100 um). </li><li> Mit dem XYZ-Positioniereinrichtung, die an der Länge Controller die Länge Controller Rohr entlang der Y-Achse, um die lange Achse der Larve, wobei die Längsachse des Kraftaufnehmers Rohr auszurichten. </li></ol> 5. Nimm Kraft während einer maximalen Kontraktion Twitch <ol><li> Bewegen der Prüfvorrichtung auf die Bühne eines umgekehrten Mikroskops. </li><li> Einstellen der Temperatur der Kammer auf einen gewünschten Wert. Um zu beginnen, verbinden Sie das Wasserbad Thermostat, Thermometer und Temperaturregler auf der Prüfeinrichtung. Schalten Sie die notwendigen Komponenten und die Einstellung der Temperatur controller, bis das Thermometer meldet den gewünschten Wert ein. Die in diesem Artikel aufgenommen wurden bei 25 ° C gesammelt, aber Messungen können auch bei Raumtemperatur oder bei 28,5 ° C durchgeführt werden </li><li> Schließen Sie die Kabel aus dem Stimulator der Prüfeinrichtung. Schalten Sie das Gerät an den Stimulator aber nicht stimulieren die Larve bis Schritt 5.6. </li><li> Achten Sie darauf, die Larve ist parallel zum Boden der Kammer. Durch eine 40X-Objektiv, kommen den Teil des Larven zwischen den Enden der Rohre. Wenn parallel zum Boden, werden beide Enden der Larve in den Mittelpunkt rücken. Falls erforderlich, passen Sie die Kraft Schallwandlerrohr entlang der Z-Achse, bis beide Enden im Fokus sind. </li><li> Überprüfen Sie, dass die Larve kürzer als optimal ist. Das Videogerät Sarkomerlänge und drehen die Videokamera, so dass die Rillen parallel zu den Seiten des Videobildes sind. Dieses System überwacht Streifung Abstand durch Analysieren Variationen in Pixelintensität entlang jeder horizontalen Reihe von Pixeln innerhalb einer benutzerdefinierten Region von Interesse(ROI). Die Ergebnisse für alle Zeilen innerhalb der ROI werden gemittelt und mit einer Frequenz äquivalent zu der Video-Frame-Rate (≥ 80 sec -1). Die Streifenbildung Abstand wird als Indikator für Sarkomerlänge verwendet. </li><li> Stellen Sie das Mikroskop auf die peripheren Fasern konzentrieren und beachten Sie die angegebenen Sarkomerlänge. Falls erforderlich, verwenden Sie die XYZ Positionierung Gerät, das an der Länge Controller Länge der Larve einstellen (X-Achse), bis die Sarkomerlänge weniger als optimal ist (z. B. 1,90 um). </li><li> Stellen Sie die Reizstrom zu Zuckungskraft optimieren. Um zu beginnen, stellen Sie den Ausgangsstrom auf der Stimulator auf einen niedrigen Betrag (zB 100 mA). Der Stimulator kann manuell oder von einem Computer läuft eine benutzerdefinierte LabVIEW-Programm ausgelöst werden. Elicit ein Zucken der Muskeln Larven mit einem Stromimpuls von 0,2 ms Dauer. </li><li> Verwenden Sie ein Oszilloskop, um die Kraft Ausgang erfassen und messen die Spitze Zuckungskraft Verwendung des Oszilloskops Cursor. Erhöhen Sie den Stromvon 50 mA-Schritten und messen Sie den Gipfel Zuckungskraft an jedem aktuellen Niveau. Warten Sie 30 Sek. zwischen zuckt zur Ermüdung zu verhindern. Wie Reizstrom erhöht, Peak Zuckungskraft erhöht typischerweise zu einem Maximum und nimmt dann allmählich ab. Der Strom, bei dem die Larve erzeugt die größte Kraft ist die optimale Reizstrom. Stellen Sie die aktuelle Amplitude der optimalen Reizstrom. </li><li> Mit dem XYZ Positionierung Gerät, muss die Länge der Larve (und damit Sarkomerlänge), um eine maximale Zuckungskraft entlocken. Wildtyp-Zebrafisch-Larven (3-7 dpf) erzeugen maximale Zuckungskraft bei Sarkomers Längen von 2,10 um oder 2,15 um. Jedoch kann die Sarkomerlänge bis 2,08 um eingestellt werden, um übermäßige Belastung auf die Larven zu verhindern. </li><li> Elicit ein Zucken der Muskeln Larven. Verwenden Sie das Oszilloskop, um die Kraft Reaktion aufzeichnen und speichern den Datensatz für die spätere Analyse. </li></ol> 6. Messen Muskulatur Maße mit Larve bei Optimal Länge <ol&gt; <li> Bewegen Sie den Testgerät zurück an den Stereo-Mikroskop. </li><li> Mit dem Okular Maßstab messen die Höhe der Muskulatur von der Seite betrachtet wird. Dann kümmert sich nicht um die Länge der Larve zu ändern, schwenken die Larve von 90 ° mit den Fadenschleife Schwänze um die Larve aus dem Boden zu sehen. Die Breite der Muskulatur von der Unterseite gesehen. Nehmen Sie die Messungen an einer anatomischen Landmarke (zB urogenitalen Öffnung) (Abbildung 4). </li><li> Schneiden Sie die Naht mit einem Schleifen Mikroklinge die Larve aus der Prüfgeräte freizugeben. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Diese Methode misst Krafterzeugung während einer zuckenden Muskel Funktion in der Rumpfmuskulatur Zebrafischlarven beurteilen. Obwohl tetanische Kontraktionen können in Zebrafisch-Larven hervorgerufen werden (z. B. durch 200 Stimulationspulse / sec für eine Dauer von 0,2 sec), ist die maximale tetanische Kraft nur 10-15% größer als die maximale Zuckungskraft. Deshalb ist die Kraft, die während einer Zuckung erzeugt ein gewisses Maß an Kraft erzeugende Fähigkeit. Twitches werden über tetanische Kontraktionen bevorzugt, da zuckt weniger wahrscheinlich zu verursachen Rippen oder Abrutschen an den Naht Bindungen sind. Um aussagekräftige Daten mit dieser Technik zu erzeugen, sollte maximal Zuckungskraft für jede Larve erreicht werden und die Variabilität zwischen den experimentellen Gruppen sollte minimiert werden. Mit diesen Zielen vor Augen, bieten wir die folgenden Vorschläge. Erstens, achten Sie bei der Bindung der Larve auf den Kraftaufnehmer und die Länge Controller Röhren. Wenn die Nahtschleifen sind zu fest angezogenviel, wird der Faden durch das Muskelgewebe zu schneiden. Wenn die Naht Schleifen nicht fest genug angezogen, wird die Kraft, die von den Larven erzeugt wird, nicht vollständig auf den Kraftaufnehmer übertragen. Beide Situationen, vor allem aber die letzteren, unterschätzen maximale Zuckungskraft. Zweitens kann, da die Prüfung mehrerer experimentellen Gruppen mehrere Stunden dauern (20-30 min / Larve), wechseln zwischen Gruppen, weil Larven werden weiterhin während der Testphase zu entwickeln. Während einige der genannten Geräte ist wichtig für die Messung der maximalen Zuckungskraft (zB Kraftaufnehmer aktuellen Stimulator), sind andere Elemente nicht unbedingt notwendig. Das Video Sarkomerlänge System ist wünschenswert, aber nicht erforderlich. Alternativ kann eine Reihe von Zuckungen verwendet, um eine optimale Länge, wobei die Länge der Larve eingestellt, bis maximal Zuckungskraft erreicht wird, zu finden. Temperatur-Steuersystem ist auch nicht zwingend erforderlich. Temperaturregelung ist kritisch, wenn meaSuring zucken Kinetik, die sehr empfindlich auf Temperatur sind, während maximal Zuckungskraft ist nicht besonders empfindlich auf kleine Änderungen in der Temperatur und konnte bei Raumtemperatur gemessen werden. Beachten Sie, dass unabhängig von der Temperatur in der Kammer während der Kraftmessungen die Larven in der optimalen Wachstumstemperatur von 28,5 ° C aufrechterhalten 24 vor, um zu erzwingen Tests zur genauen Staging. Die Larven werden in einer Lösung, die Tyrodes Tricaine getestet. Wir verwenden 0,02% (w / v) Tricaine, die Konzentration für Anästhesie 24 empfohlen, spontane Kontraktionen durch das Nervensystem hervorgerufen zu beseitigen und somit die Ermüdung während Kraft-Tests. Tricaine erleichtert auch die tie-on Schritt und reduziert die Gesamtkosten Testzeit. Allerdings beobachten wir, dass auch in der Tricaine Testlösung konsequent reduziert die maximale Zuckungskraft um ca. 30%. Ein ähnlicher Effekt ist auch in Kaulquappenschwanzes Muskel beobachtet worden, wo tricaine Kraft reduziert Generation nach neuromuskuläre Übertragung blockiert wurde, was darauf hindeutet, dass Tricaine eine direkte Wirkung auf Muskel-25 hat. Tricaine kann Muskelzelle Erregbarkeit indem Natriumleitfähigkeit durch die Zellmembran zu reduzieren, wie es in Nervenzellen 26 tut. Weitere Optionen zum Blockieren Aktivierung durch Motoneuronen sind d-Tubocurarin und α-Bungarotoxin aber im Gegensatz Tricaine sind diese Verbindungen nicht hautpermeable und muss direkt in den Kopf, Rückenmark, Herz oder 27 injiziert werden. Einzelne Forscher müssen beurteilen, ob Tricaine wünschenswert für ihre spezifische Anwendung ist. Wenn Tricaine in der Testing-Lösung enthalten ist, sollte die Konzentration im Einklang zwischen den Experimenten und Forscher sollten sicherstellen, dass die Wirkung der Tricaine nicht zwischen experimentellen Gruppen variieren. Wir beschreiben diese Methode für Larven so jung wie 3 dpf und so alt wie die 7 dpf. Obwohl Muskelfasern scheinen fu seinnctional so früh wie 17 Stunden nach der Befruchtung, wenn spontane Bewegungen Schwanz 27, die kurze Länge des Schwanzes beginnen vor 3 dpf behindert binden die Larve der Prüfeinrichtungen. Wir in der Regel nicht testen Larve nach 7 dpf da viele Krankheiten Modelle nicht überleben viel länger als diese Zeit. Wird die Prüfung Larven über 5 dpf, sollte die Larven gefüttert werden. Wir haben beobachtet, dass Larven unfed kleineren Muskeln haben und erzeugen weniger maximale Zuckungskraft als fed Larven, wahrscheinlich aufgrund der abnehmenden Dottersack. So kann es wünschenswert sein, Larven zwischen 3-5 dpf testen, um die zusätzliche variable externe Zufuhr zu vermeiden. Zusammenfassend beschreiben wir eine quantitative und zuverlässige Methode zur Messung von Kraft Generation während einer maximalen Kontraktion zucken Zebrafisch Larven Rumpfmuskulatur. Diese Methode kann verwendet werden, um die allgemeine Gesundheit der Zebrafisch Larven Muskel beurteilen und gezielt informiert über Muskelfunktion. Neben der Bereitstellung von Informationen über dieGröße der Kraft Generation kann diese Technik verwendet, um die Kinetik der Kraftentwicklung studieren oder angepasst, um Muskelermüdung 22 studieren werden. Obwohl wir diese Technik für den Einsatz mit dem Wildtyp-Larven zu beschreiben, kann diese Methode für genetisch veränderte oder für Larven Larven mit Medikamenten oder Giftstoffen behandelt werden, um Muskelerkrankung Modelle charakterisieren und bewerten Behandlungen oder die Entwicklung der Muskulatur, Muskel-Verletzungen, oder studieren Muskel-verwandten chemischen Toxizität.

Junge Zebrafisch (Danio rerio) Larven, 3-7 Tage nach der Befruchtung (DPF), werden zunehmend als nützlich Organismus für Skelettmuskel Forschung anerkannt. Junge Larven Modell menschlichen Muskelerkrankung 1-9 verwendet werden, bewerten Arzneimittel und therapeutische Strategien 10-11, Studie Muskelverletzung 12, verstehen die Entwicklung der Muskulatur 13-16, und zu untersuchen, Muskel-verwandten chemischen Toxizität 17-19. Typische Studien in diesen Bereichen zu untersuchen, inwieweit die gesunden Muskel abnormal wird durch genetische Manipulation oder durch Einwirkung von Schadstoffen gemacht, und einige Studien zu untersuchen, inwieweit die abnorme Muskel auf die Behandlung anspricht. Entscheidend für den Erfolg dieser Studien ist die Fähigkeit, genau zu beurteilen Muskel Gesundheit. Zwar gibt es eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung, um Muskeln Gesundheit in Zebrafisch-Larven zu beurteilen sind, bieten nur wenige direkte Informationen über Muskelfunktion. Muscle Gesundheit wird in der Regel durch appearanc ausgewertete, wie durch histologische Färbung 6,8,11, Immunfärbung 9,15,16,18, Lichtmikroskopie 3,13, Elektronenmikroskopie 3,4,14,16 oder Doppelbrechung 7,9,11 beurteilen, aber diese Techniken bieten morphologische Information. Trunk und Schwanz Verschiebungen und Schwimmen Geschwindigkeit 4,17 auszuwerten Motorik, aber diese sind nicht direkt Maßnahmen der Muskelfunktion, da sie spiegeln auch neuronale Input, Energiestoffwechsel und andere Prozesse. Im Gegensatz dazu messen Krafterzeugung während der Kontraktion eine direkte Beurteilung der Muskelfunktion und stellt ein Maß für die allgemeine Gesundheit Muskel. Hinzugefügt Vorteile dieses Ansatzes sind einfach Datenanalyse und quantitative Ergebnisse. In diesem Video-Artikel stellen wir ein detailliertes Verfahren zur Messung von Kraft Generation von Larven Muskeln, in der Hoffnung, dass mehr Forscher wird diese Methode verwenden, um bestehende Maßnahmen des Muskels Gesundheit in ihrer Forschung zu ergänzen. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, Krafterzeugung während der Kontraktion des Zebrafisch-Larven Rumpfmuskulatur zu messen. Um dieses Ziel zu erreichen, ist ein Zebrafischlarve betäubt und in eine Kammer mit einer Salzlösung gefüllt ist. Das vordere Ende der Raupe wird mit einem Kraftaufnehmer verbunden und das hintere Ende der Raupe wird auf eine Länge Controller verbunden. Muscle Aktivierung wird durch das elektrische Feld Stimulation erreicht, und die Reizstrom und die Länge der Larven werden eingestellt, um maximale Zuckungskraft erzeugen. Eine isometrische Zuckung Kontraktion ausgelöst und die Kraft Reaktion zur Analyse aufgezeichnet. Um klar zu sein, diese Technik nicht zu messen Kräfte, die durch Larven Muskeln beim Schwimmen generiert. Da beide Enden der Larve zum Gerät gebunden und weil die Larve bleibt anästhesiert, kann es sich nicht in Bewegung während des Tests. Darüber hinaus aktiviert Feldstimulation alle Muskelfasern gleichzeitig eine bil induzierenateral Kontraktion, die nicht ist, was natürlich vorkommt 20. Deshalb, anstatt Messung des tatsächlichen Kräfte beim Schwimmen erzeugt, bestimmt dieser Technik die Kraft erzeugenden Fähigkeit der Larven Muskeln. Wir haben diese Technik verwendet, um Muskelschwäche in einem Zebrafisch-Modell der Nemalin Myopathie 21, sowie um die Wirkung von antioxidativen Behandlung von Muskel-Funktion in einem Zebrafisch-Modell der multi-minicore Krankheit 22 bewerten demonstrieren. Andere haben eine ähnliche Technik 23, um die Auswirkungen eines Umweltschadstoff auf die Muskelfunktion 19 untersuchen eingesetzt.

<table border="1">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>REAGENTS</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Tricaine powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>223506</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0751</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nonsterile-suture</td>
			<td>Ashaway Line &amp; Twine</td>
			<td>S30002</td>
			<td>USP 10/0 monofilament nylon (3 ply)</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>Dumont #5</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-08</td>
			<td>Vannas</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td>MZ8</td>
			<td>Illuminated with Fostec EKE ACE I light source</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Force transducer</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>400A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Length controller</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>318B</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>XYZ positioning devices</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>3936M</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Thermometer</td>
			<td>Physitemp</td>
			<td>BAT-12</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Disposable transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-711-9AM</td>
			<td>Cut end to widen opening and facilitate larva transfer</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-11YZ </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Glass pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-678-8B</td>
			<td>Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>Axiovert 100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Water bath circulator</td>
			<td>Neslab Instruments</td>
			<td>RTE-111</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Alpha Omega Instruments</td>
			<td>Series 800</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Stimulator</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>701C</td>
			<td>High-power, follow stimulator</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Video sarcomere length system</td>
			<td>Aurora Scientific</td>
			<td>900B-5A</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>LabVIEW software</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Oscilloscope</td>
			<td>Nicolet Technologies</td>
			<td>ACCURA 100</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microblade</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10050-00</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Microblade holder</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>10053-13</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Data analysis software (Signo)</td>
			<td>Alameda Applied Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

force measurement during contraction to assess muscle function in zebrafish larvae

Zebrafisch-Larven bieten Modelle der Entwicklung der Muskulatur, Muskel-Erkrankungen und Muskel-bezogene chemische Toxizität, aber verwandte Studien mangelt es häufig an funktionellen Maßnahmen der Muskel Gesundheit. In diesem Video-Artikel zeigen wir eine Methode zur Krafterzeugung während der Kontraktion des Zebrafisch-Larven Rumpfmuskulatur zu messen. Kraftmessungen werden, indem ein narkotisierten Larve in eine Kammer mit einer Salzlösung gefüllt erreicht. Das vordere Ende der Raupe wird mit einem Kraftaufnehmer verbunden und das hintere Ende der Raupe wird auf eine Länge Controller verbunden. Eine isometrische Zuckung Kontraktion wird durch ein elektrisches Feld Stimulation hervorgerufen und die Kraft Reaktion zur Analyse aufgezeichnet. Krafterzeugung während der Kontraktion ein Maß für die allgemeine Gesundheit und speziell Muskel liefert ein Maß für die Muskelfunktion. Obwohl wir diese Technik für den Einsatz mit dem Wildtyp-Larven zu beschreiben, kann dieses Verfahren mit gentechnisch veränderten oder Larven mit Larven mit Medikamenten oder Giftstoffen behandelt werden,zu Muskelerkrankung Modelle charakterisieren und bewerten Behandlungen oder Muskel-Entwicklung, Verletzungen oder chemische Toxizität zu untersuchen.

Bei gesunden Wildtyp-Zebrafisch-Larven sollten die Muskelfasern parallel zueinander ohne große Lücken zwischen ihnen und haben offensichtlich Rillen (5A). Wildtyp-Zebrafisch-Larven, die nicht zeigen diese Merkmale oder mit offensichtlicher Schäden wie freistehende Fasern (5B), muss verworfen werden. Eine repräsentative Darstellung von Peak Zuckungskraft gegenüber Reizstrom für eine einzelne Zebrafischlarve ist in Abbildung 6 dargestellt. Für Wildtyp-Zebrafisch-Larven zwischen 3-7 dpf, ist die optimale Reizstrom typischerweise zwischen 400-600 mA, mit 3 dpf Larven erfordert im Allgemeinen größer als 6-7 Reizstrom dpf Larven. Die rohen Kraft Daten (gesammelt in Schritt 5.8) muss verarbeitet und analysiert werden mit Daten-Analyse-Software. Zuerst wird die Grundlinie der Kraft Aufzeichnung auf Null gesetzt. Zweitens wird die Ausgangsspannung des Kraftaufnehmers umgewandelt zu zwingen (mN) (siehe Herstellerangaben eine Kalibrationskurve für den Kraftaufnehmer zu erzeugen). Eine repräsentative Kraft Reaktion während einer maximalen Kontraktion Zucken einer einzigen Larve gesammelt wird in Abbildung 7 gezeigt. Datenanalyse-Software kann zur Spitzenkraft und andere Merkmale der Kraft Reaktion zu messen. Eine repräsentative Gruppe von Spitzenkraft Daten von maximal zucken Kontraktionen wird in 8A gezeigt. Typische peak Zuckungskraft Werte für Wildtyp-Larven 3-7 dpf Bereich von 0,9 bis 1,7 mN, mit älteren Larven erzeugen mehr Kraft als jüngere Larven. Unterschiede in der Spitze Zuckungskraft kann durch normale Prozesse wie Wachstum und Entwicklung (Abbildung 8) oder krankhafte Prozesse wie Gen-Mutation-Pathologie 21,22. Normalisierung durch Muskel Querschnittsfläche (CSA) kann verwendet werden, um den Grad der Unterschiede in Spitzenzeiten Zuckungskraft sind einfach aufgrund differe bestimmen<html> nces in der Größe der Muskulatur 21,22. Muskel CSA geschätzt werden nach der Formel: CSA = π (A / 2) (B / 2), wobei A die Höhe der Muskulatur als von der Seite betrachtet, ist B die Breite der Muskulatur als sie von unten betrachtet, und einen elliptischen Querschnitt ausgegangen. Typische Werte für CSA Wildtyp-Larven 3-7 dpf Bereich von 0,027 bis 0,034 mm 2, mit 3-4 dpf Larven allgemein zeigt kleinere Werte CSA als 5-7 dpf Larven. Eine repräsentative Gruppe von normierten Spitzenkraft Daten von maximal zucken Kontraktionen wird in 8B gezeigt. Typische normierten Peak Zuckungskraft Werte für Wildtyp-Larven 3-7 dpf Bereich von 34 bis 51 mN / mm 2, mit 4-7 dpf Larven die allgemein größere Werte als 3 dpf Larven. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig1.jpg" /> Abbildung 1. Fadenschleife. Pfeile zeigen auf die Fadenschleife Schwänze. ve_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Abbildung 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig2.jpg" /> Abbildung 2. (A) Prüfgerät mit markierten Komponenten. (B) Close-up Blick auf den experimentellen Kammer. (A) Experimentelle Kammer mit transparentem Boden. (B) Kraftaufnehmer. (C) Länge Controller. (D) XYZ Positionierung Geräte. Die X-, Y-und Z-Achsen sind in der oberen rechten Ecke definiert. (E) Temperatur-Regelsystem Verwendung thermoelektrischen Modulen. Tubing nimmt weniger Wasser zur Kühlung von thermoelektrischen Modulen. (F) Edelstahl-Rohr an Wandler erzwingen. (G) Edelstahl-Rohr auf Länge Controller angeschlossen. (H) Thermometer Mikrosonde. (I) Platinum parallel Platte Elektroden, über die Länge der dieKammer. Platin-Platten sind 2,5 mm hoch und 0.255 mm dick. <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig3.jpg" /> Abbildung 3. Binden Larve in experimentelle Kammer. (A) bei Larve auf vorderen Ende gebunden, aber noch nicht 90 ° schwenkbar. (B) Larve nach geschwenkten 90 °. (C) gebunden Larve auf an hinteren Ende, aber noch nicht geschwenkt. (D) Larve nach geschwenkten und Fadenschleife Schwänze werden abgeschnitten. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig4.jpg" /> Abbildung 4. Messungen zur Querschnittsfläche Schätzung. Muskulatur wie aus dem (A) Seite gesehen und (B) </strong&gt; Boden. Platzierung der roten Balken zeigen die Position der urogenitalen Öffnung. Die Länge der roten Balken geben die Höhe und Breite der Muskulatur, von der Seite und unten jeweils angesehen. <img alt="Abbildung 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig5.jpg" /> Abbildung 5. Seitliche Ansicht Zebrafischlarven Rumpfmuskulatur. (A) Gesundes Gewebe. (B) Tissue mit offensichtlichem Schaden. Kontrakturen aus Faser Abteilungen sind mit einem Stern markiert. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig6.jpg" /> Abbildung 6. Repräsentative Grundstück von Peak Zuckungskraft gegenüber Reizstrom. Die optimale Reizstrom beträgt 500 mA. Abbildung 7. Repräsentative Kraft Rekord für eine einzelne Zuckung Kontraktion. Diese Kontraktion wurde mit einem Reizimpuls bei 0 ms ausgelöst. Die Spitzenkraft ist 1,56 mN. <img alt="Fig. 8" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50539/50539fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50539/50539fig8.jpg" /> Abbildung 8. Repräsentative Kraftdaten 3-7 dpf Larven. (A) Spitzenkraft Daten von maximal zucken Kontraktionen. (B) Spitzenkraft Daten von maximal zucken Kontraktionen CSA normalisiert. Ältere Larven (6-7 dpf) gefüttert wurden Hatchfry Encapsulon Grade 0 mit Spirulina (Argent Laboratories) ab 5 dpf. Means + Standardabweichungen sind mit N = 5 in jeder Gruppe berichtet. Gruppen signifikant verschieden von 3 dpf Larven (*) und 4 dpf Larven (#) angegeben (ANOVA, P &lt;0,05). Der deutliche Anstieg der normierten Kraft zwischen 3 und 4 dpf (B) zeigt einen Anstieg in der intrinsischen erzeugende Fähigkeit während dieser Zeit, während der Anstieg in Kraft, die zwischen 4 und 6-7 dpf (A) ist das Wachstum auf der Grundlage nicht zugeschrieben ändern 4-7 dpf in normalisierten Kraft.

Watch this Scientific Journal Video about Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae at JoVE.com

Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

Kraftmessungen können verwendet werden, um Veränderungen in Muskel-Funktion aufgrund der Entwicklung, Verletzungen, Krankheit, Behandlung oder chemische Toxizität nachzuweisen. In diesem Video zeigen wir eine Methode, um Kraft während einer maximalen Kontraktion des Zebrafisch-Larven Rumpfmuskulatur zu messen.

Kraftmessung während der Kontraktion zu Muscle Funktion in Zebrafisch-Larven bewerten

Zebrafish larvae provide models of muscle development, muscle disease and muscle-related chemical toxicity, but related studies often lack functional ...

force-measurement-during-contraction-to-assess-muscle-function

Research

JoVE Journal

Biology

15.5K Aufrufe.  University of Michigan. Kraftmessungen können verwendet werden, um Veränderungen in Muskel-Funktion aufgrund der Entwicklung, Verletzungen, Krankheit, Behandlung oder chemische Toxizität nachzuweisen. In diesem Video zeigen wir eine Methode, um Kraft während einer maximalen Kontraktion des Zebrafisch-Larven Rumpfmuskulatur zu messen.

Serie: Force Measurement During Contraction to Assess Muscle Function in Zebrafish Larvae

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Hochauflösende Messung von Odor-Driven Behavior in Drosophila-Larven

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Forschung

Biologie

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Mikroinjektion von Zebrafisch-Embryos, um Gene Function Analyze

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

Intravenöse Mikroinjektionen mit Zebrabärblingembryonen zu Acute Kidney Injury Study

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Microgavage of Zebrafish Larvae

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe interactions17-25. Experimental approaches for studying intestinal biology often require the in vivo introduction of selected materials into the lumen of the intestine. In the larval zebrafish model, this is typically accomplished by immersing fish in a solution of the selected material, or by injection through the abdominal wall. Using the immersion method, it is difficult to accurately monitor or control the route or timing of material delivery to the intestine. For this reason, immersion exposure can cause unintended toxicity and other effects on extraintestinal tissues, limiting the potential range of material amounts that can be delivered into the intestine. Also, the amount of material ingested during immersion exposure can vary significantly between individual larvae26. Although these problems are not encountered during direct injection through the abdominal wall, proper injection is difficult and causes tissue damage which could influence experimental results. We introduce a method for microgavage of zebrafish larvae. The goal of this method is to provide a safe, effective, and consistent way to deliver material directly to the lumen of the anterior intestine in larval zebrafish with controlled timing. Microgavage utilizes standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment common to most laboratories that perform zebrafish research. Once fish are properly positioned in methylcellulose, gavage can be performed quickly at a rate of approximately 7-10 fish/ min, and post-gavage survival approaches 100% depending on the gavaged material. We also show that microgavage can permit loading of the intestinal lumen with high concentrations of materials that are lethal to fish when exposed by immersion. To demonstrate the utility of this method, we present a fluorescent dextran microgavage assay that can be used to quantify transit from the intestinal lumen to extraintestinal spaces. This test can be used to verify proper execution of the microgavage procedure, and also provides a novel zebrafish assay to examine intestinal epithelial barrier integrity under different experimental conditions (e.g. genetic manipulation, drug treatment, or exposure to environmental factors). Furthermore, we show how gavage can be used to evaluate intestinal motility by gavaging fluorescent microspheres and monitoring their subsequent transit. Microgavage can be applied to deliver diverse materials such as live microorganisms, secreted microbial factors/toxins, pharmacological agents, and physiological probes. With these capabilities, the larval zebrafish microgavage method has the potential to enhance a broad range of research fields using the zebrafish model system.

We present a novel method for microgavage of larval zebrafish utilizing standard embryo microinjection and stereomicroscopy equipment. We demonstrate that microgavage is a safe and efficient technique useful for delivering controlled amounts of diverse materials specifically into the larval zebrafish intestinal lumen.

Microgavage der Zebrafischlarven

The zebrafish has emerged as a powerful model organism for studying intestinal development1-5, physiology6-11, disease12-16, and host-microbe ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age are significant public health burdens. We currently understand little about the genetic regulation of muscle health with disease or age. The nematode C. elegans is an established model for understanding the genomic regulation of biological processes of interest. This worm&#8217;s body wall muscles display a large degree of homology with the muscles of higher metazoan species. Since C. elegans is a transparent organism, the localization of GFP to mitochondria and sarcomeres allows visualization of these structures in vivo. Similarly, feeding animals cationic dyes, which accumulate based on the existence of a mitochondrial membrane potential, allows the assessment of mitochondrial function in vivo. These methods, as well as assessment of muscle protein homeostasis, are combined with assessment of whole animal muscle function, in the form of movement assays, to allow correlation of sub-cellular defects with functional measures of muscle performance. Thus, C. elegans provides a powerful platform with which to assess the impact of mutations, gene knockdown, and/or chemical compounds upon muscle structure and function. Lastly, as GFP, cationic dyes, and movement assays are assessed non-invasively, prospective studies of muscle structure and function can be conducted across the whole life course and this at present cannot be easily investigated in vivo in any other organism.

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Skeletal muscle is essential for locomotion and is the bodies&#8217; main protein store. Muscle health measurements within C. elegans are described. Prospective changes to muscle structure and function are assessed using localized GFP and cationic dyes.

Methoden zur subzellulärer Kompartimente der Muskel in Beurteilen<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Die Messung der Smooth Muscle Function in den Isolated Tissue Bath-Anwendungen Pharmakologie Forschung

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Design and Development of Aptamer&#8211;Gold Nanoparticle Based Colorimetric Assays for In-the-field Applications

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Target selective AuNP based color assays have been developed in controlled proof-of-concept laboratory settings. However, these schemes have not been exerted to a point of failure to determine their practical use beyond laboratory settings. This work describes a generic approach to design, develop, and troubleshoot an aptamer-AuNP colorimetric assay for small molecule analytes and using the assay for in-the-field settings. The assay is advantageous because adsorbed aptamers passivate the nanoparticle surfaces and provide a means to reduce and eliminate false positive responses to non-target analytes. Transitioning this system to practical uses required defining not only the shelf-life of the aptamer-AuNP assay, but establishing methods and procedures for extending the long-term storage capabilities. Also, one of the recognized concerns with colorimetric readout is the burden placed on analysts to accurately identify often subtle changes in color. To lessen the responsibility on analysts in the field, a color analysis protocol was designed to perform the color identification duties without the need for performing this task on laboratory grade equipment. The method for creating and testing the data analysis protocol is described. However to understand and influence the design of adsorbed aptamer assays, the interactions associated with the aptamer, target, and AuNPs require further study. The knowledge gained could lead to tailoring aptamers for improved functionality.

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field applications was examined. Additionally, a smart-device colorimetric application (app) was validated and long-term storage of the assay was established for use in the field.

Entwurf und Entwicklung von Aptamer-Gold-Nanopartikeln basierte kolorimetrische Assays für In-the-Feld-Anwendungen

The design and development of an aptamer&#8211;gold nanoparticle (AuNP) colorimetric assay for the detection of small molecules for in-the-field ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

Nephrotoxin Mikroinjektion in Zebrabärbling akuten Nierenschädigung zu Modell

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

Hochauflösende Respirationstest zur Beurteilung mitochondrialen Funktion in permeabilisierten und Intakte Zellen

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...