وأيد هذا العمل من قبل الزمالة من معهد هوارد هيوز الطبي والمؤسسة الوطنية للعلوم إلى RG، والأموال التي منحت لSM من قبل المعاهد الوطنية للصحة (المنحة R01-HL98416) وجمعية القلب الأمريكية (المنحة 09BGIA2450014).

1. زراعة أحادي الطبقة خلية في Transwell إدراجات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في العقيمة، ومستوى السلامة الأحيائية 2 خلية غطاء الثقافة، ضع 0.8 ملم المسام transwell PET إدراج في 24 لوحة جيدا (4 آبار في الشرط، لدلالة إحصائية) بالملقط. ويجب تعقيم جميع المواد التي تدخل هود مع الايثانول. </li></ol> ملاحظة: حجم المسام من مرشح يجب أن يكون المحدد في اتفاق لحجم متوسط ​​من NC المستخدمة، للسماح النقل عبر الغشاء. أيضا، للحصول على نتائج ذات دلالة إحصائية، ويتطلب كل حالة تجريبية لا تقل عن أربعة يكرر (الآبار) في نفس التجربة، والحد الأدنى من 3 تجارب مستقلة. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد خلية ثقافة المتوسط ​​تحتوي على DMEM المتوسطة تستكمل مع 4.5 غرام / لتر جلوكوز، 15٪ مصل بقري جنيني، و 1٪ القلم بكتيريا، والحرارة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الإنسان غدية القولون الظهارية (كاتشو-2) الخلايا في خلية متوسطة ومكان200-400 ميكرولتر من الحل خلية في العلوية (القمي) غرفة إدراج transwell، في مناطق ذات كثافة من 1.5 × 10 5 خلية / سم 2. ملء الدنيا (basolateral) غرفة مع 700-900 ميكرولتر من المتوسطة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا الثقافة في 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، و 95٪ الرطوبة ل16-21 يوما، لتحل محل المتوسطة في الغرفة العلوية والسفلية كل 3-4 أيام، وذلك باستخدام وحدات التخزين المشار إليها في الخطوة 1.3. استبدال المتوسطة في الترتيب التالي للحفاظ على الضغط فوق (بدلا من أدناه) أحادي الطبقة الخلية: نضح المتوسطة من مجلس النواب، نضح المتوسطة من مجلس الشيوخ، وملء الغرفة العليا مع متوسطة جديدة، وملء مع مجلس النواب متوسطة جديدة. </li></ol> 2. المصادقة على GI الظهارية نفاذية حاجز طريق بطريق الظهارة المقاومة الكهربائية (طير) والمناعية من منعطفات ضيقة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتخزين على المدى القصير (أقل من 2 أسابيع)، يغرق أقطاب STX100 في المحاليل بالكهرباءنشوئها (0.1-0.15 M بوكل أو كلوريد الصوديوم). توصيل كابل كهربائي إلى منفذ كهربائي على EVOM متر فولت أوم بحيث يكون النظام تماس في الداخل ويتم الاحتفاظ القطب التماثل. للتخزين على المدى الطويل، وشطف مع DH 2 O وتخزين في حالة جافة ومظلمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتعقيم الأقطاب، تزج في الإيثانول لمدة 15 دقيقة والسماح للهواء الجاف لمدة 15 ثانية. بدلا من ذلك، الأقطاب يمكن تخزينها في غطاء فوق البنفسجية. شطف الأقطاب في محلول معقم بالكهرباء (العازلة الفوسفات المالحة، PBS) أو 0.1-0.15 M بوكل كلوريد الصوديوم أو الحل، قبل كل قياس المقاومة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع متر فولت أوم لتعيين الإعداد المقاومة، ضع عموديا الأقطاب في بئر يحتوي على إدراج transwell، مع القطب قصيرة في مجلس الشيوخ والقطب طويلة في مجلس النواب لمس قاع البئر. ما إن تستقر القراءة EVOM، وتسجيل قيمة المقاومة (أوم الواردة في؛ Ω) لكل بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب المقاومة (resistanم تطبيع للمنطقة؛ Ω × سم 2) من عينات عن طريق طرح المقاومة الخلفية (طير من إدراج transwell دون الخلايا) وضرب من قبل مساحة الغشاء. وغالبا ما ذكرت القيم المقاومة في الأدب. (انظر مناقشة) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار القياسات كل 1-2 أيام حتى تقدر طير أدى إلى الحد الأقصى والهضبة، مشيرا إلى تشكيل حاجز النفاذية، والتي تأخذ عادة 2-3 أسابيع من لحظة platting الخلية. قد تتغير قيم هضبة طير والوقت اللازم لتحقيق سلامة الحاجز وفقا لعدد مرور الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتحقق من وجود منعطفات ضيقة في الطبقات الوحيدة الخلية مع ارتفاع طير (تساوي أو تزيد على قيمة العتبة لتشكيل حاجز)، وإصلاح الخلايا عن طريق الحضانة مع البرد بارافورمالدهيد 2٪ لمدة 15 دقيقة. ثم، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع 1 ميكروغرام / مل مكافحة occludin. غسل خلايا مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني واحتضان لهم لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع 7.5 ميكروغرام / مل والأجسام المضادة الثانوية صفت luorescently. استخدام الآبار مع انخفاض طير كعنصر تحكم السلبية لتشكيل حاجز. </li></ol> ملاحظة: كبديل لمكافحة occludin، يمكن استخدام الأجسام المضادة للبروتينات تقاطع ضيق البديلة. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استئصال الغشاء بعناية التصفية الذي يتم إرفاق أحادي الطبقة الثابتة، وجبل على الشرائح للتصوير باستخدام epifluorescence أو المجهري متحد البؤر. </li></ol> 3. تقييم بطريق الظهارة نقل الناقلون المستهدفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية استهداف الأجسام المضادة (الماوس وحيدة النسيلة الأجسام المضادة ضد ICAM-1، ومكافحة ICAM، في هذا المثال) مع 125 الأول، كما هو موضح سابقا 7. استخدام برادفورد مقايسة لتقدير تركيز البروتين وعداد غاما لتحديد 125 I المحتوى على الضد، ثم حساب نشاط محدد في التهم لكل دقيقة (CPM) / ملغ من الأجسام المضادة المسمى. </li></ol> ملاحظة: للسيطرة على النوعية، إعادةالجفت الإجراء من قبل مفتش وسم الفأر، والتي سيتم استخدامها لإعداد البلاغات الوطنية المغلفة غير المستهدفة. لدراسة نقل البضائع العلاجية، كرر الإجراء وصفها البضائع، على سبيل المثال، ألفا غالاكتوزيداز (α غال) في هذا المثال. يمكن استخدام بدائل للعامل الاستهداف، ومراقبة غير محددة، أو البضائع العلاجية. ويمكن أيضا أن تستخدم أساليب بديلة لتسمية المركبات وتقدير تركيز نظرائهم المسمى. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الزوجان المسمى استهداف الأجسام المضادة (المضادة للICAM في مثالنا) على سطح البلاغات الوطنية. في هذا المثال، واحتضان nanobeads البوليسترين (قطر 100 نانومتر) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع I-125 المضادة للICAM للسماح امتصاص السطح، كما هو موضح 7. </li></ol> ملاحظة: للحصول على سيطرة غير محددة استخدام I-125 مفتش. لتتبع نقل البضائع، استخدام مزيج من الأجسام المضادة التي تستهدف و125 البضائع التي تحمل علامات الأول (α غال في مثالنا). <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 13،000 x ج لمدة 3 دقائق وإزالة نظرائهم غير المغلفة في طاف بواسطة الطموح. resuspend الكرية تحتوي على البلاغات الوطنية المغلفة باستخدام 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني قبل pipetting، ويصوتن في انخفاض القوة لتعطيل المجاميع الجسيمات المحتملة (20-30 نبضات قصيرة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لNC توصيف وقياس حجمها، والتشتت المتعدد، وζ المحتملة من الجسيمات المغلفة باستخدام تشتت الضوء الحيوي (اتباع الإرشادات بائع)، وتحديد عدد 125 أنا المسمى استهداف جزيئات الأجسام المضادة (مثل مكافحة ICAM) على سطح الجسيمات باستخدام جاما المرتدة. </li></ol> ملاحظة: يمكن تكرار هذه الأساليب لنظرائهم غير محددة والعلاجية. حجم الجسيمات المغلفة يتراوح حوالي 200 نانومتر. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 125 نكس-I الأجسام المضادة، (على سبيل المثال I-125 المضادة للICAM البلاغات الوطنية؛ 56 نانوكوري / مل) إلى مجلس الشيوخ أعلاه متموجة كاتشو-2 الطبقات الوحيدة مع طير و# 8805؛ 350 Ω × 2 سم (انظر مناقشة) على خلفية (16-21 يوما بعد البذر). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة واحدة أو المزيد من الوقت المطلوب فترات. قياس طير (القسم 2.3) قبل وبعد الحضانة لتقييم آثار البلاغات الوطنية على حاجز النفاذية. </li></ol> ملاحظة: يمكن تكرار هذا الإجراء لنظرائهم غير محددة والعلاجية. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المتوسطة من الغرف العلوية والسفلية وغسلها مرة واحدة مع 0.5 مل DMEM عند 37 درجة مئوية (الغرفة العليا) أو 1 مل درهم 2 O (مجلس النواب). جمع يغسل لقياس مجموع محتوى النظائر المشعة باستخدام عداد غاما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس جزء الخلية، واستئصال تصفية نفاذية، على سبيل المثال باستخدام شفرة حلاقة لخفض حول حواف، واحتضان في أنبوب عداد غاما مع 1٪ تريتون X-100 لمدة 10 دقيقة (للافراج عن محتويات الخلية)، قبل قياس الخلية المرتبطة مجموع النشاط الإشعاعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس 125 أنا أعيدمستأجرة من البلاغات الوطنية أثناء النقل أو بسبب تدهور محتمل، مزيج أول 300 ميكرولتر من العينة (من الكسور العلوي، وانخفاض، أو خلية) مع 700 ميكرولتر من 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني و 200 ميكرولتر حمض الخليك ثلاثي الكلور (TCA). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. وفي الوقت نفسه هذه المرة، وقياس النشاط الإشعاعي شامل لهذه العينة في عداد غاما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الطرد المركزي في TCA 3،000 x ج لمدة 5 دقائق لفصل البروتين سليمة (بيليه) من البروتين المتدهورة أو 125 جزء الأول (طاف). قياس النشاط الإشعاعي من 125 حرة أنا جزء وطرح هذه القيمة من مجموع النشاط الإشعاعي تقاس قبل الطرد المركزي. هذا وسوف توفر كمية البروتين المسمى الذي لا يتحلل. </li></ol> 4. آلية بطريق الظهارة نقل Nanocarriers المستهدفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التسمية الألبومين مع 125 I كما هو موضح في القسم 3.1 والتي أبلغت 7. </li></ol> ملاحظة: الزلال هو 66.5البروتين كيلو دالتون، وبالتالي، وهي مادة كبيرة نسبيا. على الرغم من أن السيطرة صالحة للنقل السلبي من الأجسام الكبيرة (على سبيل المثال 200 نانومتر المستخدمة هنا البلاغات الوطنية)، وينبغي أن تكون بديلا مع أصغر الجزيئات الخاملة التتبع عند دراسة نقل ناقلات المخدرات أصغر (انظر مناقشة). <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم النقل paracellular باستخدام تسرب الزلال paracellular والثقافة كاتشو-2 الطبقات الوحيدة على transwell إدراج كما هو موضح أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى متوسطة الغرفة العليا فوق الخلية أحادي الطبقة، إضافة إما 125 I-الزلال وحده (السيطرة السلبية تظهر على المستوى القاعدي من التسرب)، أو 125 البلاغات الوطنية التي تستهدف الأضداد I-الزلال وغير رديولبلد (كما هو موضح في القسم 3.5). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة الفاصل الزمني المحدد الوقت (ق)، والتي ينبغي أن تتطابق مع تلك درست عند اختبار النقل NC. قياس طير (القسم 2.3) قبل وأثناء وبعد الحضانة، ثم جمع كل الكسور لمجموع 125 أنا وأنا حرة 125 القياسات كما هو مبين. في القسم 3 ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك يصاحب ذلك من السيطرة I-125 الزلال وغير رديولبلد البلاغات الوطنية مفتش يمكن استخدامها كمجموعة تحكم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كعنصر تحكم إيجابية لفتح تقاطعات بين الخلايا، إضافة وسائل الإعلام خلية تحتوي على 5 ملي H 2 O 2 إلى الغرف العلوية والسفلية من إدراج transwell، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم، وقياس طير (القسم 2.3) وإضافة 125 I-الألبومين إلى الغرفة العليا للفترات الزمنية المحددة. قياس طير في نقاط مختلفة في جميع أنحاء الحضانة الوقت لتحديد قيمة الاضمحلال طير الناجمة عن H 2 O 2 الافتتاحية التي يسببها للتقاطعات الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في التجارب المتوازية، وتقييم النقل العابر للخلايا، وتسمى أيضا transcytosis، من 125 نكس أنا المستهدفة التي يحتضنها متموجة كاتشو-2 مع الطبقات الوحيدة إما 50 ميكرومتر monodansylcadaverine (حركة التغيير الديمقراطي؛ المانع من بوساطة بالكلاذرين الإلتقام)، 1 ميكروغرام / مل فيليبين (المانع من caveolar الإلتقام بوساطة)، و 0.5 ميكرومتر فورتمانفي (المانع من فوسفتيدلينوستول 3 كيناز [PI3K]، والمشاركة في macropinocytosis)، أو 20 ميكرومتر [5 - (N-إيثيل-N-الآيزوبروبيل) الأميلوريد] (EIPA، المانع من macropinocytosis وبوساطة CAM الإلتقام 15). </li></ol> ملاحظة: I-125 مفتش البلاغات الوطنية و125 I-الزلال يمكن استخدام ضوابط السلبية لتأثير هذه المثبطات، وغيرها من الأساليب (مثل تقنيات سيرنا) قد توفر تثبيط أكثر انتقائية. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس طير (القسم 2.3) قبل وأثناء وبعد حضانة الخلايا مع مثبطات والمواد رديولبلد، كعنصر تحكم إضافية للتأثير مثبطات على نفاذية أحادي الطبقة. </li></ol>

<ol>
	<li>Deli, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+tight+junction+modulators+to+reversibly+open+membranous+barriers+and+improve+drug+delivery.">Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).</li><li>Mrsny, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+nature:+"Pathogen-Mimetic"+systems+for+mucosal+nano-medicines.">Lessons from nature: "Pathogen-Mimetic" systems for mucosal nano-medicines.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 172-192 (2009).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+and+stimuli-sensitive+pharmaceutical+nanocarriers.">Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 71, 431-444 (2009).</li><li>Sadekar, S., Ghandehari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+transport+and+toxicity+of+PAMAM+dendrimers:+implications+for+oral+drug+delivery.">Transepithelial transport and toxicity of PAMAM dendrimers: implications for oral drug delivery.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 571-588 (2012).</li><li>Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+design+and+characterization+of+ligand-targeted+drug+delivery+systems.">Challenges in design and characterization of ligand-targeted drug delivery systems.</a> J. Control. Release. , 0168-3659 (2012).</li><li>Volkheimer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persorption+of+particles:+physiology+and+pharmacology.">Persorption of particles: physiology and pharmacology.</a> Adv. Pharmacol. Chemother. 14, 163-187 (1977).</li><li>Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-cell+junctions:+happy+together.">Endothelial cell-cell junctions: happy together.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 261-270 (2004).</li><li>Jung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+for+oral+delivery+of+peptides:+is+there+a+role+for+polymers+to+affect+mucosal+uptake.">Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: is there a role for polymers to affect mucosal uptake.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 50, 147-160 (2000).</li><li>Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+drug+permeability+and+prediction+of+drug+absorption+in+Caco-2+monolayers.">Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers.</a> Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).</li><li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+(Caco-2)+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability.">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).</li><li>Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+epithelial+cell+culture+in+studies+of+drug+transport.">Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport.</a> Methods Mol. Biol. 188, 233-272 (2002).</li><li>Bareford, L. M., Swaan, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+mechanisms+for+targeted+drug+delivery.">Endocytic mechanisms for targeted drug delivery.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 748-758 (2007).</li><li>Tuma, P. L., Hubbard, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcytosis:+crossing+cellular+barriers.">Transcytosis: crossing cellular barriers.</a> Physiol. Rev. 83, 871-932 (2003).</li><li>Muro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endocytic+pathway+induced+by+clustering+endothelial+ICAM-1+or+PECAM-1.">A novel endocytic pathway induced by clustering endothelial ICAM-1 or PECAM-1.</a> J. Cell Sci. 116, 1599-1609 (2003).</li><li>Shah, P., Jogani, V., Bagchi, T., Misra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Caco-2+cell+monolayers+in+prediction+of+intestinal+drug+absorption.">Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption.</a> Biotechnol. Prog. 22, 186-198 (2006).</li><li>Delie, F., Rubas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+colonic+cell+line+sharing+similarities+with+enterocytes+as+a+model+to+examine+oral+absorption:+advantages+and+limitations+of+the+Caco-2+model.">A human colonic cell line sharing similarities with enterocytes as a model to examine oral absorption: advantages and limitations of the Caco-2 model.</a> Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, 221-286 (1997).</li><li>Kuhnline Sloan, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+and+biological+methods+for+probing+the+blood-brain+barrier.">Analytical and biological methods for probing the blood-brain barrier.</a> Annu. Rev. Anal. Chem. 5, 505-531 (2012).</li><li>Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+three-dimensional,+all-human+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+using+mono-,+co-,+and+tri-cultivation+Transwell+models.">Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models.</a> J. Neurosci. Methods. 199, 223-229 (2011).</li><li>Kasper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flotillin-involved+uptake+of+silica+nanoparticles+and+responses+of+an+alveolar-capillary+barrier+in+vitro.">Flotillin-involved uptake of silica nanoparticles and responses of an alveolar-capillary barrier in vitro.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. , 0939-6411 (2012).</li><li>Ghaffarian, R., Bhowmick, T., Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+nanocarriers+across+gastrointestinal+epithelial+cells+by+a+new+transcellular+route+induced+by+targeting+ICAM-1.">Transport of nanocarriers across gastrointestinal epithelial cells by a new transcellular route induced by targeting ICAM-1.</a> J. Control. Release. 163, 25-33 (2012).</li><li>Hsu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+endothelial+delivery+and+biochemical+effects+of+alpha-galactosidase+by+ICAM-1-targeted+nanocarriers+for+Fabry+disease.">Enhanced endothelial delivery and biochemical effects of alpha-galactosidase by ICAM-1-targeted nanocarriers for Fabry disease.</a> J. Control. Release. 149, 323-331 (2011).</li><li>Schmiedlin-Ren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+enhanced+oral+availability+of+CYP3A4+substrates+by+grapefruit+constituents.+Decreased+enterocyte+CYP3A4+concentration+and+mechanism-based+inactivation+by+furanocoumarins.">Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruit constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins.</a> Drug Metab. Dispos. 25, 1228-1233 (1997).</li><li>Hughes, J., Crowe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+P-glycoprotein-mediated+efflux+of+digoxin+and+its+metabolites+by+macrolide+antibiotics.">Inhibition of P-glycoprotein-mediated efflux of digoxin and its metabolites by macrolide antibiotics.</a> J. Pharmacol. Sci. 113, 315-324 (2010).</li><li>Wielinga, P. R., de Waal, E., Westerhoff, H. V., Lankelma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transepithelial+drug+transport+by+on-line+measurement:+cellular+control+of+paracellular+and+transcellular+transport.">In vitro transepithelial drug transport by on-line measurement: cellular control of paracellular and transcellular transport.</a> J. Pharm. Sci. 88, 1340-1347 (1999).</li><li>Morris, M. C., Deshayes, S., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+from+molecular+mechanisms+to+therapeutics.">Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics.</a> Biol. Cell. 100, 201-217 (2008).</li><li>Kapus, A., Szaszi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+apical+and+paracellular+transport+processes.">Coupling between apical and paracellular transport processes.</a> Biochem. Cell Biol. 84, 870-880 (2006).</li><li>Hood, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+protection+by+PECAM-targeted+delivery+of+a+novel+NADPH-oxidase+inhibitor+to+the+endothelium+in+vitro+and+in+vivo.">Antioxidant protection by PECAM-targeted delivery of a novel NADPH-oxidase inhibitor to the endothelium in vitro and in vivo.</a> J. Control. Release. 163, 161-169 (2012).</li><li>Simone, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+targeting+of+polymeric+nanoparticles+stably+labeled+with+the+PET+imaging+radioisotope+iodine-124.">Endothelial targeting of polymeric nanoparticles stably labeled with the PET imaging radioisotope iodine-124.</a> Biomaterials. 33, 5406-5413 (2012).</li><li>Vercauteren, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers:+optimization+and+pitfalls.">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

استخدام الأساليب التي تمت مناقشتها أعلاه، يمكن تأسيس نموذج خلية لدراسة نقل البلاغات الوطنية المستهدفة عبر الحواجز الخلوية، مثل المثال المنصوص عليها كاتشو-2 الخلايا الظهارية، والتي هي ذات الصلة لتقييم النقل من التجويف GI في الدم في حالة نظم لتقديم الأدوية عن طريق الف...

الحواجز الخلوية في فعل الجسم كبوابة بين البيئة الخارجية والداخلية المقصورات. هذا هو الحال بالنسبة للبطانة الظهارية التي تفصل بين السطح المعرض من الخارج من الجهاز الهضمي (GI) المسالك ومجرى الدم 1-3. كما تمثل الحواجز الخلوية واجهة بين مجرى الدم وحمة والمكونات الخلوية من الأنسجة والأعضاء. هذا هو الحال بالنسبة للبطانة الداخلية البطانية في الأوعية الدموية، مثل حاجز الدم في الرئة، حاجز الدم في الدماغ، الخ. 1 القدرة على اجتياز هذه الحواجز الخلوية في الجسم أمر حاسم للتسليم كفاءة العوامل العلاجية والتشخيصية إلى الدورة الدموية والأنسجة / الأجهزة التي تحتاج إلى التدخل. لتحسين تقديم وكلاء علاجية أو تشخيصية، هذه المركبات يمكن تحميلها في nanocarriers ميكرومتر الفرعية (NCS). هذه المركبات لتقديم الأدوية يمكن أن تصاغ مع مجموعة متنوعة منكيمياء والهياكل لتحسين القابلية للذوبان في المخدرات، والحماية، والدوائية، وإطلاق سراح، والتمثيل الغذائي 4،5. البلاغات الوطنية يمكن أيضا أن تكون بين functionalized مع تقارب أو استهداف الأنصاف (مثل الأجسام المضادة، الببتيدات السكريات، الأبتامرات، الخ) لتسهيل الانضمام إلى مناطق الجسم التي تتطلب العمل العلاجي 2،6. يمكن استهداف البلاغات الوطنية لمحددات أعرب على سطح الحواجز الخلوية زيادة تسهيل النقل إلى و / أو عبر هذه بطانات 2،6. دور نقل المواد بشكل انتقائي بين بيئتين يتطلب بعض ميزات فريدة من نوعها بين طبقات الخلية. واحدة من هذه الميزة قطبية الخلية، حيث الغشاء القمي التي تواجه التجويف تجاويف يختلف من غشاء basolateral موجهة نحو الخلالي الأنسجة، وفيما يتعلق التشكل الغشاء وتكوين الدهون، والنقل، ومستقبلات 2. يتضمن ميزة أخرى junctio بين الخلايانانوثانية التي تربط الخلايا المجاورة. تنظيم البروتينات التي تشكل منعطفات ضيقة، جزيئات الالتصاق صلي على وجه الخصوص (المربيات)، occludins، وclaudins، تعدل وظيفة حاجز للسماح بشكل انتقائي أو لا نقل المواد بين الخلايا، والمعروفة باسم النقل paracellular، مما يسمح بمرور المواد من التجويف ل مساحة basolateral 3. يمكن الربط من العديد من العناصر الطبيعية والاصطناعية (الكريات البيض، والجزيئات، والجسيمات، ونظم لتقديم الأدوية) إلى الحواجز الخلوية في الجسم تحفز الخلايا افتتاح تقاطع، والتي قد تكون عابرة وغير مؤذية نسبيا أو أكثر لفترة طويلة، وبالتالي غير آمنة مع وصول المواد غير المرغوب فيها عبر حاجز 2،5،7-9. بالتالي، هذا المسار يمكن تقييمها من خلال قياس المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (طير) والسلبي نشر paracellular من الجزيئات (وتسمى هنا تسرب paracellular)، حيث انخفضت مقاومة التيار الكهربائي أو زيادة تسرب paracellular من المعهد الوطني للإحصاءمجمع غ في الفضاء basolateral تشير افتتاح تقاطعات الخلية، على التوالي 5،10،11. لتكمل هذه الأساليب، أي من البروتينات مفرق ضيق المذكورة أعلاه يمكن أن تكون ملطخة لتقييم سلامتها، حيث يجب أن يظهر تلطيخ تتركز على الحدود خلية خلية في جميع أنحاء محيط الخلية 5،10،12. بدلا من ذلك، نظم لتقديم الأدوية التي تستهدف المحددات سطح خلية معينة، مثل تلك المرتبطة حفر المغلفة بالكلاذرين أو invaginations الغشاء على شكل قارورة دعا caveolae، قد يؤدي امتصاص حويصلي في الخلايا عن طريق الإلتقام، وتوفير وسيلة لتوصيل الدواء إلى الخلايا مقصورات 5، 13. بالإضافة إلى ذلك، قد تؤدي إلى الاتجار الإلتقام من الحويصلات عبر خلايا الجسم لاطلاق سراح في الجانب basolateral، وهي ظاهرة تعرف باسم transyctosis، أو النقل العابر للخلايا 14. وبالتالي، معرفة حركية وآلية الإلتقام يمكن أن تستخدم لاستغلال الخلايا والثانية تسليم المخدرات العابر للخلايا، والذي يقدم طريقة آمنة نسبيا والتي تسيطر التسليم مقابل الطريق paracellular. (الإلتقام مثل حالة جزيء التصاق الخلية (CAM) بوساطة) آلية الإلتقام يمكن تقييم مع جهري من الممرات الكلاسيكية (بالكلاذرين وبوساطة caveolin الإلتقام، وmacropinocytosis) أو المسارات غير الكلاسيكية 5،13،15 . في حين غالبا ما درس الاتجار داخل الخلايا في الآبار القياسية أو coverslips، وعدم وجود حجرة basolateral يمنع الاستقطاب الخلية والقدرة على دراسة النقل عبر طبقات الخلية. للتغلب على هذه العقبة، والنقل عبر الطبقات الوحيدة الخلية تمت دراسة طويلة باستخدام transwell إدراج 10،11،16،17، والتي تتكون من العلوي (القمي) غرفة، غشاء نفاذية مسامية حيث تعلق الخلايا وتشكيل أحادي الطبقة ضيقة، وأقل (basolateral) غرفة (الشكل 1). في هذا التكوين، يمكن قياس النقل فيقمي، لbasolateral الاتجاه من خلال إدارة العلاج في الغرفة العليا، وبعد النقل من خلال أحادي الطبقة الخلية وغشاء مسامي الكامنة، وجمع أخيرا المتوسطة في مجلس النواب لتقدير حجم المواد المنقولة. ويمكن أيضا نقل في الاتجاه basolateral-لقمية تقاس الإدارة الأولية إلى انخفاض الغرفة وجمع لاحقة من مجلس الشيوخ 5،10،12،16. توجد تقنيات مختلفة للتحقق من تشكيل حاجز نفاذية على transwells، بما في ذلك طير والمقايسات النقل paracellular، كما هو موضح أعلاه. بالإضافة إلى ذلك، يمكن إزالة عامل التصفية منفذة على الخلايا التي يتم تربيتها لتحليل التصوير (مثل مضان، مبائر، المجهر الإلكتروني)، وكذلك المصادقة على نموذج أحادي الطبقة المحمولة، فضلا عن آلية النقل. اختيار نوع الغشاء، والذي يتوفر في أحجام مختلفة المسام، والمواد، والمناطق السطحية، ويعتمد على مختلف الواقعالتمرير مثل حجم المواد أو الأشياء المراد نقلها، نوع من الخلايا، وطريقة التصوير 16،18-20. Transwell إدراج أيضا تسهيل التحكم ودقيقة الكمي النقل بالمقارنة مع أنظمة الثدييات المعقدة، كما هي معروفة أحجام الغرف ومساحة سطح الخلية الثوابت. في حين يتم التخلص من العديد من العوامل التي تدخل في الجسم الحي في التسليم، بما في ذلك وجود مخاط الأمعاء، إجهاد القص، والإنزيمات الهضمية، الخلايا المناعية وغيرها، هذا على نطاق صغير في النموذج المختبر يوفر معلومات أولية مفيدة بشأن النقل. كمثال لتوضيح تكييف هذه الأساليب لدراسة النقل NC عبر الحواجز الخلوية 10،11،16،17، ونحن هنا وصف الحالة التي كان على غرار القدرة على الانتقال NC عبر ظهارة GI عن طريق تقييم مرور تسليم المخدرات نموذج النظام من خلال أحادي الطبقة من الإنسان غدية القولون الظهارية (كاتشو-2) الخلايا. لهذا الغرض، جوكانت أذرع مثقف في إدراج transwell، على 0.8 ميكرومتر المسام البولي ايثيلين تيريفثاليت (PET) تصفية (6.4 مم)، وهو شفاف، ويمكن استخدامها للتصوير المجهري. يتم التحقق من صحة وضع حاجز نفاذية عن طريق قياس طير والنقل القمي، لbasolateral من مادة السيطرة، والزلال، والتصور مضان المجهري عنصر من منعطفات ضيقة، والبروتين occludin. ويستخدم نموذج من البوليمر استهدفت NC، ويتألف من 100 نانومتر، الجسيمات النانوية البوليسترين nonbiodegradable. والمغلفة البلاغات الوطنية عن طريق الامتزاز السطح مع الأجسام المضادة التي تستهدف وحدها أو مزيج من الأجسام المضادة التي تستهدف والبضائع العلاجية، حيث يمكن أن توصف إما المكون مع 125 أنا النظائر المشعة للبحث عن المفقودين. في المثال المحدد، يعترف الضد التصاق بين الخلايا جزيء-1 (ICAM-1)، أعرب البروتين على سطح GI الظهارية (وغيرها) الخلايا، وهو ما ثبت لتسهيل داخل الخلايا والعابر للخلايا س النقل<html> ناقلات المخدرات و وحمولتها 21. البضائع هو ألفا غالاكتوزيداز (α غال)، انزيم العلاجية المستخدمة لعلاج مرض فابري، وهو اضطراب التخزين الليزوزومية الوراثية 22. الخدمة المدنية القومية المغلفة، من حوالي 200 نانومتر في الحجم، وتضاف إلى غرفة قمي أكثر من أحادي الطبقة الخلية وحضنت في 37 درجة مئوية لفترات متفاوتة من الزمن، وبعد ذلك يمكن أن يتم الكشف عن 125 وأنا على البلاغات الوطنية المرتبطة أحادي الطبقة الخلية و / أو نقل إلى غرفة basolateral أدناه الخلايا. تقرير إضافية مجانية 125 I يسمح الطرح الكسر المتدهورة وتقدير النقل NC المغلفة. ويتم تقييم آلية النقل من خلال دراسة مزيد من التغييرات في نفاذية حاجز المتعلقة الطريق paracellular، من خلال المعلمات المذكورة أعلاه، في حين يتم تحديد النقل العابر للخلايا من خلال دراسة التغيرات في مجال النقل عند تحوير مسارات الإلتقام وtranscytosis. ontent &quot;&gt; هذه الأساليب توفير معلومات قيمة حول نماذج حاجز الخلوية، مدى ومعدل نقل نظام تسليم المخدرات، وآلية مثل النقل، والسماح تماما تقييم إمكانات لتسليم المخدرات عبر الحواجز الخلوية.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Transwell inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), 1x</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-37TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125Iodine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ033H002MC</td>
			<td>Radioactive hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Equitech Bio</td>
			<td>BAH-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulin G (IgG)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>015-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)</td>
			<td>Marlin 1987</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Galactosidase, from green coffee beans</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8507-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC latex beads, 100 nm</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>17150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>234729-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA433-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-27151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monodansylcadaverine (MDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wortmannin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Wizard2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt-ohm meter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEER electrodes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>STX100</td>
			<td>Electrodes available for different well-plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Light Scattering (DLS)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nano-ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers

ناقلات ميكرومتر الفرعية (nanocarriers؛ نكس) تعزيز فعالية الأدوية من خلال تحسين القابلية للذوبان والاستقرار، زمن الدوران، والاستهداف، والافراج عنهم. بالإضافة إلى ذلك، يجتاز الحواجز الخلوية في الجسم أمر حاسم لكلا التسليم عن طريق الفم من البلاغات الوطنية العلاجية إلى الدورة الدموية والنقل من الدم إلى الأنسجة، حيث هناك حاجة إلى التدخل. ويتحقق النقل NC عبر الحواجز الخلوية من (ط) الطريق paracellular، عبر تعطيل عابرة من التقاطعات التي التعشيق الخلايا المجاورة، أو (ب) الطريق العابر للخلايا، حيث يتم المنضوية المواد عن طريق الإلتقام، ونقلها عبر خلايا الجسم، ويفرز في المقابل سطح الخلية (transyctosis). تسليم عبر الحواجز الخلوية يمكن أن تيسره اقتران المداواة أو ناقليها مع استهداف وكلاء التي تربط خصيصا لعلامات سطح الخلية المعنية في مجال النقل. هنا، ونحن نقدم أساليب لقياس مدى وآلية النقل NC عبر حاجز خلية النموذج، مبادرة الخوذ البيضاءيتكون الفصل من أحادي الطبقة من الجهاز الهضمي (GI) الخلايا الظهارية نمت على غشاء مسامي تقع في إدراج transwell. ويؤكد تشكيل حاجز نفاذية عن طريق قياس المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (طير)، والنقل بطريق الظهارة من مادة السيطرة، والمناعية من منعطفات ضيقة. على سبيل المثال، تستخدم ~ 200 نانومتر البوليمر البلاغات الوطنية، التي تحمل بضائع والعلاجية والمغلفة مع الأجسام المضادة التي تستهدف محددا سطح الخلية. هو المسمى الأجسام المضادة أو البضائع العلاجية مع 125 أنا النظائر المشعة للبحث عن المفقودين وتضاف نكس المسمى إلى مجلس الشيوخ خلال أحادي الطبقة خلية لفترات متفاوتة من الزمن. ويمكن الكشف عن البلاغات الوطنية المرتبطة الخلايا و / أو نقلها إلى غرفة الأساسي. قياس مجانية 125 I يسمح الطرح الكسر المتدهورة. ويتم تقييم مسار paracellular عن طريق تحديد التغييرات المحتملة الناجمة عن النقل NC لمعلمات حاجز المذكورة أعلاه. ط النقل العابر للخلاياتقدر تحددها معالجة تأثير تحوير الإلتقام وtranscytosis مسارات.

التحقق من صحة نموذج خلية لدينا لدراسة النقل بطريق الظهارة من البلاغات الوطنية المستهدفة، ويبين الشكل 2 أن كاتشو-2 الطبقات الوحيدة الخلية مطلي في مناطق ذات كثافة من 1.5 × 10 5 خلية / سم 2 وصلت التقاء ~ 12 يوم وحافظ سلامة أحادي الطبقة تصل إلى 18 يوم، يتبين م...

Watch this Scientific Journal Video about Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers at JoVE.com

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

تتطلب العديد من التطبيقات العلاجية النقل الآمن والفعال للناقلات المخدرات وحمولتها عبر الحواجز الخلوية في الجسم. توضح هذه المقالة على تكييف أساليب أنشئت لتقييم معدل وآلية نقل nanocarriers المخدرات (NCS) عبر الحواجز الخلوية، مثل الجهاز الهضمي (GI) ظهارة.

نماذج وأساليب لتقييم نقل المخدرات نظم التسليم عبر الحواجز الخلوية

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

models-methods-to-evaluate-transport-drug-delivery-systems-across

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Bioengineering

Unit 1

Pharmacokinetics

SCIENTISTS IN ACTION

46.0K Views.  University of Maryland.  تتطلب العديد من التطبيقات العلاجية النقل الآمن والفعال للناقلات المخدرات وحمولتها عبر الحواجز الخلوية في الجسم. توضح هذه المقالة على تكييف أساليب أنشئت لتقييم معدل وآلية نقل nanocarriers المخدرات (NCS) عبر الحواجز الخلوية، مثل الجهاز الهضمي (GI) ظ...

Video: Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

تحديد معدل النقل من الاكسيوبيوتك والمواد النانوية عبر المشيمة باستخدام<em&gt; خارج الحي</em&gt; الإنسان المشيمة الإرواء الموديل

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

سقالات الإبلاغ الذاتي للخلية ثقافة 3 الأبعاد

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

في المختبر تخلل من Ferritins تحميل FITC-عبر الفأر حاجز الدم في الدماغ: نموذج لدراسة تسليم Nanoformulated الجزيئات

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

تطبيقات تصنيع وتسليم المخدرات من النانوية الحرير

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

والتجريبية وبروتوكول العناصر المحددة للتحقيق في نقل المواد المذابة المحايدة، واتهم في الغضروف المفصلي

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Creating a Structurally Realistic Finite Element Geometric Model of a Cardiomyocyte to Study the Role of Cellular Architecture in Cardiomyocyte Systems Biology

With the advent of three-dimensional (3D) imaging technologies such as electron tomography, serial-block-face scanning electron microscopy and confocal microscopy, the scientific community has unprecedented access to large datasets at sub-micrometer resolution that characterize the architectural remodeling that accompanies changes in cardiomyocyte function in health and disease. However, these datasets have been under-utilized for&#160;investigating the role of cellular architecture remodeling in cardiomyocyte function. The purpose of this protocol is to outline how to create an accurate finite element model of a cardiomyocyte using high resolution electron microscopy and confocal microscopy images. A detailed and accurate model of cellular architecture has significant potential to provide new insights into cardiomyocyte biology, more than experiments alone can garner. The power of this method lies in its ability to computationally fuse information from two disparate imaging modalities of cardiomyocyte ultrastructure to develop one unified and detailed model of the cardiomyocyte. This protocol outlines steps to integrate electron tomography and confocal microscopy images of adult male Wistar (name for a specific breed of albino rat) rat cardiomyocytes to develop a half-sarcomere finite element model of the cardiomyocyte. The procedure generates a 3D finite element model that contains an accurate, high-resolution depiction (on the order of ~35 nm) of the distribution of mitochondria, myofibrils and ryanodine receptor clusters that release the necessary calcium for cardiomyocyte contraction from the sarcoplasmic reticular network (SR) into the myofibril and cytosolic compartment. The model generated here as an illustration does not incorporate details of the transverse-tubule architecture or the sarcoplasmic reticular network and is therefore a minimal model of the cardiomyocyte. Nevertheless, the model can already be applied in simulation-based investigations into the role of cell structure in calcium signaling and mitochondrial bioenergetics, which is illustrated and discussed using two case studies that are presented following the detailed protocol.

This protocol outlines a novel method to create a spatially detailed finite element model of the intracellular architecture of cardiomyocytes from electron microscopy and confocal microscopy images. The power of this spatially detailed model is demonstrated using case studies in calcium signaling and bioenergetics.

إنشاء نموذج عنصر محدود هيكلي واقعية هندسية من كارديوميوسيتي لدراسة دور البنية الخلوية في بيولوجيا الأنظمة كارديوميوسيتي

With the advent of three-dimensional (3D) imaging technologies such as electron tomography, serial-block-face scanning electron microscopy and confocal ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

الروغان السطحية من جسيمات نانوية فيروس التهاب الكبد الوبائي ه استخدام أساليب تصريف المواد الكيميائية

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

تقييم شامل لفعالية وسلامة إيصال الأدوية المستهدفة للمشيمة باستخدام ثلاثة أساليب تكميلية

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

قمع النسخ الجيني قبل إعادة توجيه الأجهزة الخلوية مع المعدلات جينية الكيميائية

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

تحليل ثلاثي الابعاد للاستجابات متعددة الخلايا لتدرجات تشيمواتراكتانت

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...