この作品は、RGのハワード·ヒューズ医学研究所と国立科学財団のフェローシップでサポートされ、資金は米国国立衛生研究所（助成R01-HL98416）および米国心臓協会（グラント09BGIA2450014）によって、SMに授与されました。

1。トランスウェルインサート中の細胞単層を培養<ol><li>無菌のバイオセーフティーレベル2の細胞培養フードでは、0.8ミリメートルのPETは、鉗子で（統計的有意性のために、条件あたり4ウェル）を24ウェルプレートへの挿入をトランスウェル細孔置く。フードに入るすべての材料は、エタノールで消毒しなければならない。 </li></ol> 注：フィルターの孔径は、NCの平均サイズに合った選択する必要が膜を横切る輸送を可能にするために、用いられる。また、統計学的に有意な結果を得るため、各実験条件は、同一実験内で4リピート（井戸）の最小値を必要とし、3つの独立した実験の最小値。 <ol start="2"><li>水浴中で4.5g / Lグルコース、15％ウシ胎児血清および1％ペニシリンストレプトマイシン、37℃まで熱を補充したDMEM培地を含む細胞培養培地を調製する。 </li><li>細胞培地および代わりにヒト上皮結腸直腸腺癌（のCaco-2）細胞を希釈1.5×10 5細胞/ cm 2の密度でトランスウェルインサートの上部（頂端）チャンバ内に細胞溶液の200〜400μlの。細胞培地900μlの - 700と下（基底外側）室を埋める。 </li><li>ステップ1.3に示されているボリュームを使用して37℃、5％CO 2、および3〜4日ごとに上部及び下部チャンバーに培地を交換16-21日間、湿度95％、少なくとも培養細胞。細胞単層（むしろ下記より）上記の圧力を維持するには、次の順序でメディアを交換してください。、下室からメディアを吸引上部チャンバーからの培地を吸引、新鮮な培地で上室を満たし、かつと下室を埋める新鮮な培地。 </li></ol> 2。タイトジャンクショ​​ンの経上皮電気抵抗（TEER）および免疫染色を使用して、GI上皮透過性障壁の検証<ol><li>短期保存（2週間未満）については、電解質ソリューションでSTX100電極水没たTiON（0.1〜0.15 MのKClまたはNaCl）。システムは、内部で短絡して、電極の対称性が維持されるようにEVOM電圧抵抗計の電極端子に電極ケーブルを接続します。長期保存の場合は、D.H. 2 Oで洗浄し、乾燥した、暗い状態で保管してください。 </li><li> 、電極を殺菌15分間エタノールに浸し、15秒間空気乾燥できるようにする。あるいは、電極はUVフードに格納することができる。各抵抗測定の前に、無菌電解質溶液（リン酸緩衝生理食塩水、PBS）または0.1から0.15 MのKClまたはNaCl溶液に電極を洗浄します。 </li><li>電圧抵抗計は、抵抗の設定に設定すると、垂直方向に上室短い電極とウェルの底に触れて下室で長い電極と、うまくトランスウェルインサートを含む、電極を配置。各ウェルについて、EVOMの指示が安定したら、（Ωオームで与えられる）抵抗値を記録します。 </li><li>抵抗率を計算する（RESISTAN面積に対して標準化のce;Ω×cm 2）の試料のバックグラウンド抵抗（細胞を含まないトランスウェルインサートのTEER）を減算し、膜面積を掛けることによって。抵抗率の値は、ほとんどの場合、文献に報告されている。 （説明を参照してください） </li><li> TEERは、典型的には、細胞plattingの瞬間から2〜3週間かかり透過障壁の形成を示し、最大値と高原に上昇値まで1〜2日ごとに測定を繰り返します。プラトーTEER値と​​バリアの完全性を達成するの​​に必要な時間は、細胞の継代数に応じて変化し得る。 </li><li> （バリア形成のための閾値以上等しい）高いTEERを有する細胞単層に密着結合の存在を確認するために、15分間、冷2％パラホルムアルデヒドとのインキュベーションにより細胞を固定。次いで、1μg/ mlの抗オクルディンと共に室温で30分間、それらをPBSで細胞を洗浄し、インキュベートする。再びPBSで細胞を洗浄し、7.5μg/ mlのfで室温で30分間、それらをインキュベートするluorescentlyで標識した二次抗体。バリア形成の陰性対照として低TEERでウェルを使用してください。 </li></ol> 注：抗オクルディンの代替として、代替のタイトジャンクションタンパク質に対する抗体を使用することができる。 <ol start="7"><li>慎重に固定された単層が取り付けられたフィルター膜を切除し、エピ蛍光または共焦点顕微鏡を用いて撮像するためのスライド上にマウントする。 </li></ol> 3。ターゲットキャリアの経上皮輸送を評価<ol><li>先に説明したように07、125 Iで標的とする抗体（この例では、ICAM-1に対するマウスモノクローナル抗体、抗ICAMなど）を標識する。次いで、標識された抗体（CPM）/ mgのカウント毎分で比活性を算出し、抗体上の125 I含有量を決定し、タンパク質濃度、ガンマカウンターを推定するためにブラッドフォードアッセイを使用する。 </li></ol> 注：特異性を制御するには、再非標的コーティングされたNCを調製するために使用される標識マウスIgGによる手順を泥炭。治療の貨物の輸送を研究するために、この例では、貨物にラベルを付ける手順、例えば、α-ガラクトシダーゼ（α-GAL）を繰り返します。代替物はターゲッティング剤、非特異的対照、または治療貨物のために使用することができる。代替の方法はまた、化合物を標識し、標識された対応物の濃度を推定するために使用することができる。 <ol start="2"><li>夫婦NCの表面に抗体（この例では抗ICAM）を標的ラベル。この例では、07のように、表面吸着を可能にするために125 I-抗ICAMとともに室温で1時間ポリスチレンナノビーズ（100 nmの直径）をインキュベートする。 </li></ol> 注：非固有のコントロールを使用する125 I-IgGについて。貨物の輸送をトレースするには、抗体と125 I標識貨物（この例ではα-GAL）を標的とを組み合わせて使用します。 <ol start="3"><li> 3分間13,000×gで遠心分離し、吸引によって、上清中の非塗工の対応を削除します。ピペッティングによりPBS中の1％ウシ血清アルブミン（BSA）を用いてコーティングされたNCを含むペレットを、潜在的な粒子凝集（20-30短いパルス）を破壊するために低電力で超音波処理を再懸濁する。 </li><li> NCの特性評価のために、大きさ、多分散性、および動的光散乱（ベンダーの指示に従って）を使用して、コーティングされた粒子のζ電位を測定し、数を定量化する125使用して粒子表面に抗体分子（ 例えば抗ICAM）を標的I標識ガンマカウンター。 </li></ol> 注：これらの方法は、非特異的および治療 ​​的対応物について繰り返すことができる。コーティングされた粒子のサイズは約200 nmの範囲である。 <ol start="5"><li> （ 例えば 125 I-抗ICAMのNC; 56をnCi / ml）を、125 I-抗体のNCを追加TEER＆でコンフルエントのCaco-2単層上の上部チャンバーに＃8805;背景上のCM 2×350Ω（説明を参照）（16〜21日後に播種）。 1つまたは複数の所望の時間間隔で37℃で培養する。透過障壁に対するNCの効果を評価するために、インキュベーションの前と後のTEER（セクション2.3）を測定します。 </li></ol> 注：この手順は、非特異的および治療 ​​的対応物について繰り返すことができる。 <ol start="6"><li>上下のチャンバーからの培地を回収し、37℃（上室）で0.5ミリリットルDMEMまたは1ミリリットルのdH 2 O（下室）で一回、それらを洗ってください。ガンマカウンターを用いて放射性同位元素の合計含有量の測定のための洗浄を集める。 </li><li>細胞画分の測定には、通気フィルタを切除し、 例えば、（細胞内容物を放出する）エッジの周りに切断し、10分間、1％トリトンX-100でガンマ計数管でインキュベートし、カミソリの刃を使用して、セルの測定を行う前総放射能の関連。 </li><li>私は再度125を測定するには潜在的な劣化、最初のミックスPBS中の3％BSAを700μlの200μlのトリクロロ酢酸（TCA）で（、上下、または細胞画分から）の試料300μlに輸送中のNCからまたはリース。 15分間室温でインキュベートする。一方今回は、ガンマカウンターでこのサンプルの全放射能を測定します。 </li><li>劣化したタンパク質または125 I画分（上清）から完全なタンパク質（ペレット）を分離するために、5分間3000×gで遠心分離TCAサンプル。無料の125 I画分の放射能を定量化し、遠心分離前に測定した全放射能からこの値を減算します。これは、劣化していない標識されたタンパク質の量を提供する。 </li></ol> 4。ターゲットナノキャリアの経上皮輸送のメカニズム<ol><li>ラベル以前のセクション3.1に記載されているような、私は125とアルブミンは、7を報告した。 </li></ol> 注：アルブミンは66.5であるkDaタンパク質、従って、比較的大きな物質。より大きな物体の受動輸送のための有効な制御（例えば、200nmでのNCは、ここで使用される）ものの、より小さな薬物担体の輸送を研究するときに、より小さな不活性トレーサー分子で置換されるべきである（説明を参照）。 <ol start="2"><li>アルブミン傍漏出、上記のようにトランスウェルインサート上で培養されたCaco-2単層を使用して傍細胞輸送を評価する。 </li><li>細胞単層上の上部チャンバー媒体に、125 I-アルブミン単独（漏れの基礎レベルを示すネガティブコントロール）、または125 I-アルブミンと非放射性標識された抗体標的NCS（セクション3.5を参照）のいずれかを追加します。 NC輸送をテストするときに検討したものと一致する必要があり、選択した時間間隔（秒）、37℃でインキュベートする。前、間、TEER（セクション2.3）を測定し、示されているようにインキュベートした後、その合計125 Iで無料の125 I測定のためのすべての画分を収集第3節では注意してください：125 I-アルブミンと非放射性標識されたコントロールのIgG NCの併用に加え、コントロールとして使用することができる。 </li><li>間接合部を開放するための陽性対照として、トランスウェルインサートの上部及び下部チャンバーに5mMのH 2 O 2を含有する細胞培地を追加し、30分間37℃でインキュベートする。その後、TEER（セクション2.3）を測定し、選択した時間間隔で上室への125 I-アルブミンを追加します。細胞間結合のH 2 O 2誘導性開口によって引き起こさTEER値の減衰を同定するために、インキュベーションを通して様々な時点でTEERを測定する。 </li><li>平行実験において、50μMのモノダンシルカダベリン（MDC、クラスリン依存性エンドサイトーシスの阻害剤）のいずれかでコンフルエントのCaco-2単層をインキュベートすることにより、125 Iを標的とNCのもトランスサイトと呼ばれる細胞間輸送を、評価し、1μg/ mlのフィリピン（カベオラの阻害剤媒介性エンドサイトーシス）、0.5μMのwortmann内、または20μMの[5 - （N-エチル-N-イソプロピル）アミロ]（ホスファチジルイノシトール3マクロピノサイトーシスに関与するキナーゼ[PI3K]の阻害剤）（マクロピノサイトーシスとCAMを介したエンドサイトーシス15の阻害剤EIPA）。 </li></ol> 注：125 I-NCのIgGを125 I-アルブミンは、これらの阻害剤の効果についてのネガティブコントロールとして使用することができる、他の方法（例えば、siRNAの技術）は、より選択的阻害を提供することができる。 <ol start="6"><li>単層透過性に対する阻害剤の効果のための追加コントロールとして、その間、および阻害剤および放射性標識された物質で細胞をインキュベートした後、前にTEER（セクション2.3）を測定します。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

上述の方法を用いて、細胞壁を越え標的NCの輸送を研究するための細胞モデルは、このような場合には血液中にGI管腔から輸送を評価することに関連したCaco-2上皮細胞を、示した例のように、確立することができる経口薬物送達システム。トランスウェルインサート中のGI上皮細胞単層の培養は、細胞透過性障壁の形成を確認するために、タイトジャンクショ​​ンのTEERおよび蛍光免疫染色の...

外部環境と内部区画の間のゲートウェイとしてのボディの行為中の細胞の障壁。これは、胃腸（GI）管および血流1-3の外部露出面を分離する上皮層の場合である。携帯の障壁はまた、血流と実質および組織や臓器の細胞成分との間のインタフェースを表す。体内でこれらの細胞障壁を横断する能力は、治療薬および診断薬の効率的な送達のために重要である1これは、血液などの肺関門、血液脳関門のような血管内皮の内側ライニングの場合である循環へと介入が必要とされる組織/器官。 治療薬または診断薬の送達を改善するために、これらの化合物は、サブミクロンナノキャリア（NCS）にロードすることができる。これらの薬物送達ビヒクルは、様々な製剤化することができる薬物の溶解性、保護、薬物動態、リリース、および代謝4,5を最適化するための化学的性質と構造。 NCはまた、治療上の処置が必要とされる2,6身体の領域への接着を容易にするために、親和性またはターゲティング部分（ 例えば、抗体、ペプチド、糖、アプタマーなど ）で官能基化することができる。携帯障壁の表面に発現決定にNCの標的化は、さらに2,6におよび/ ​​またはこれらのライニングを横切る輸送を容易にすることができる。 選択的に2環境の間の物質の輸送の役割は、細胞層の中で、特定のユニークな機能を必要とします。一つのこのような特徴は、キャビティの内腔に面する頂端膜は、膜の形態および脂質、トランスポーター、および受容体2の組成物に関して、組織の間質に向かって配向基底膜まで変化することにより、細胞極性である。もう一つの特徴は、細胞間を必要とするjunctio隣接するセル間を接続NS。タイトジャンクショ​​ンを形成するタンパク質の制御、特に接合部接着分子（JAM）、オクルディン、およびクローディン、選択的傍細胞輸送として知られている細胞、間の物質の輸送を可能にするかどうバリア機能を調節し、内腔から材料の許可通過に基底外側のスペース3。体内の細胞の障壁に多くの天然および合成の要素（白血球、分子、粒子、および薬物送達システム）の結合はのアクセスの危険なので、一過性で比較的無害またはより長期であってもよい細胞ジャンクショ​​ンの開口を誘導することができバリア2,5,7-9全体の不要物。したがって、この経路は、アミンの電流または増加傍漏れに対する抵抗を減少することにより、経上皮電気抵抗（TEER）及び（本明細書傍漏れと呼ばれる）分子の受動傍細胞拡散を測定することによって評価することができる基底外側空間にRT化合物は、それぞれ5,10,11、細胞間結合の開放を示している。染色はすべての細胞周辺5,10,12の周囲に細胞-細胞境界に集中して表示される場所、これらの方法を補完するために、上記のタイトジャンクションタンパク質のいずれかは、それらの完全性を評価するために染色することができる。 あるいは、クラスリン被覆ピットやカベオラと呼ばフラスコ状の膜陥入に関連するものなどの特定の細胞表面決定基を標的とする薬物送達システムは、細胞内区画5への薬物送達のための道を提供し、エンドサイトーシスによって細胞に小胞の取り込みをトリガすることができる13。また、エンドサイトーシスは、側底側のリリースのために細胞体全体に小胞の人身売買にtransyctosis、または経細胞輸送14と呼ばれる現象を引き起こすことがあります。そのため、エンドサイトーシスの動態とメカニズムについての知識は、細胞内のAを活用するために用いることができる傍細胞経路に比べて納期の比較的安全かつ制御モードを提供していますND経薬物送達、。エンドサイトーシスの機構は、古典的経路の調節因子（クラスリンとカベオリン媒介エンドサイトーシス、およびマクロピノ）または（例えば、細胞接着分子（CAM）を介したエンドサイトーシスの場合のような）非古典的ルートに評価することができる5,13,15 。 細胞内輸送は、多くの場合、標準的なウェルまたはカバースリップで研究されているのに対し、基底外側コンパートメントの不在は、細胞極性と細胞層を横断する輸送を研究する能力を妨げる。この障害を克服するために、細胞単層を横切る輸送は、長いトランスウェルの上部（頂端）チャンバ、細胞が付着し、タイトな単層を形成する多孔性透過膜で構成され、10,11,16,17が挿入され、下部用いて研究されている（基底外側）室（ 図1）。この構成では、輸送は、で測定することができる上部チャンバーに処置を施す細胞単層とその下の多孔質膜を通って輸送を次の、そして最終的に輸送され、材料の定量化のための下部チャンバー内の媒体を収集することにより、頂端から側底方向。側底から頂端方向への輸送は、上部チャンバー5,10,12,16から下室とその後のコレクションに最初の投与によって測定することができる。上記のように様々な技術が、TEERおよび傍細胞輸送アッセイを含む、トランスウェル上で透過障壁の形成を確認するために存在する。また、細胞が培養された通気フィルタは、さらに、細胞単層モデルの検証ならびに輸送のメカニズムとして、（蛍光、共焦点顕微鏡、電子顕微鏡法により）イメージング分析のために除去することができる。異なる孔サイズ、材料、および表面エリアで利用可能である膜型の選択は、種々のファクトに依存する例えば、輸送される物質または物体の大きさ、細胞型、及び撮像方法としてrsを16,18-20。トランスウェルインサートはまた、チャンバーおよび細胞表面領域のボリュームは既知の定数であり、哺乳動物のような複雑なシステムと比較して、輸送の制御された正確な定量化を容易にする。 in vivo送達に関与する多くの要因が、腸の粘液の存在を含む、せん断応力、消化酵素、免疫細胞などを排除しているが、 インビトロモデルでのこの小さな規模は、輸送に関する有用な予備情報を提供しています。 携帯障壁10,11,16,17間でのNCの輸送を研究するため、これらの方法の適応を説明するための例として、ここでは消化管上皮を通過するのNC輸送の可能性は、モデル薬物送達の通過を評価することによりモデル化した場合について説明ヒト上皮結腸直腸腺癌（のCaco-2）細胞の単層を介してシステム。この目的のためにあり、cのエルは透明であり、顕微鏡イメージングのために使用することができる0.8μmの細孔ポリエチレンテレフタレート（PET）フィルター（6.4ミリメートル直径）上で、トランスウェルインサートで培養した。透過障壁の状態がTEER、コントロール物質、アルブミン、タイトジャンクショ​​ンの元素の蛍光顕微鏡可視化、オクルディンタンパク質の頂端から側底輸送を測定することによって検証される。標的ポリマーNCのモデルを100nm、非生分解性ポリスチレンナノ粒子からなる、使用される。 NCは、表面だけでは標的とする抗体との吸着または標的とする抗体の組み合わせの成分のいずれかが放射性同位元素のトレースのための125 Iで標識することができる治療貨物によってコーティングされている。選択された例では、抗体は、細胞間接着分子-1（ICAM-1）を認識し、タンパク質が細胞内および経細胞輸送oをを促進することが示されているGI上皮（および他の）細胞の表面上に発現<html> F薬物担体とその貨物21。カーゴは、α-ガラクトシダーゼ（α-ガラクトシダーゼ）、ファブリー病、遺伝リソソーム貯蔵障害22の治療のために使用治療用酵素である。 サイズが約200nmのコーティングされたNCのは、上のNC 125 Iは、細胞単層に関連するおよび/ ​​または検出することができ、その後、細胞単層上に先端チャンバーに添加し、そして様々な時間にわたって37℃でインキュベートし細胞下の側底室に搬送される。無料の125 Iの追加の決定は、コーティングされたNC輸送の劣化した分と推定の減算を可能にする。経細胞輸送は、エンドサイトーシスおよびトランスサイトーシスの経路を調節する際の輸送の変化を調べることによって決定される輸送の機構はさらに、上述のパラメータを介して、傍細胞経路に関連する透過障壁の変化を調べることにより評価される。 ontent &quot;&gt;これらの方法は、完全に細胞の障壁を横切る薬物送達のための潜在性の評価を可能にする、貴重なセルラバリア·モデルに関する情報、薬物送達システムの輸送の程度と速度、およびそのような輸送の機構を提供する。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Transwell inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), 1x</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-37TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125Iodine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ033H002MC</td>
			<td>Radioactive hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Equitech Bio</td>
			<td>BAH-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulin G (IgG)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>015-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)</td>
			<td>Marlin 1987</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Galactosidase, from green coffee beans</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8507-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC latex beads, 100 nm</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>17150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>234729-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA433-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-27151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monodansylcadaverine (MDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wortmannin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Wizard2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt-ohm meter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEER electrodes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>STX100</td>
			<td>Electrodes available for different well-plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Light Scattering (DLS)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nano-ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers

サブマイクロキャリア（ナノキャリアは、NCは）は、溶解性、安定性、循環時間、ターゲティング、および放出を向上させることによって薬物の効力を高める。また、体内で細胞の障壁を横断することは、介入が必要とされる組織への血液から循環と輸送への治療NCの両方の経口送達のために重要である。材料は、エンドサイトーシスによって内在細胞体を通過して輸送され、分泌される一過性の隣接するセルを連動ジャンクショ​​ンの破壊、または（ii）経細胞経路を介して（I）傍細胞経路、、：携帯の壁を越えたNC輸送はによって達成される反対細胞表面（transyctosis）で。細胞の障壁を横切る送達は、輸送に関与する細胞表面マーカーに特異的に結合するターゲティング剤と治療薬またはそれらのキャリアを結合することによって容易にすることができる。ここでは、WHIのモデル細胞関門を越えて広がりとNC輸送のメカニズムを測定する方法を提供CHはトランスウェルインサートにあり、多孔質膜上に成長した胃腸の単層（GI）上皮細胞で構成されています。透過障壁の形成は経上皮電気抵抗（TEER）、対照物質の経上皮輸送、および密着結合の免疫染色を測定することによって確認される。一例として、〜200nmのポリマーのNCは、治療貨物を運び、細胞表面決定基を標的とする抗体で被覆され、使用されている。抗体または治療の貨物は、放射性同位体の追跡とラベルされたNCのために125 Iで標識されている時間の変化期間の細胞単層を介して上部チャンバーに追加されます。 NCは、細胞に関連したおよび/または下にあるチャンバに搬送を検出することができる。無料の125 Iの測定は、劣化した分を差し引くことができます。傍細胞経路は、上述したバリアパラメータNC輸送による電位の変化を測定することにより評価される。経細胞輸送iをエンドサイトーシスおよびトランスサイトーシス経路を調節する効果に対処することによって決定されよ。

目標とNCの経上皮輸送を研究する私たちの細胞モデルの検証として、 図2は 、Caco-2細胞単層を、合流〜12日目に到達した1.5×10 5細胞/ cm 2の密度でプレートし、18日目までの単層の完全性を維持していることを示していますTEER（ 図2A）で示される。これは、低TEER苦手タイトジャンクション標識（CM 2×17Ω、5日目と比較して高いTEER（CM 2日?...

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Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

多くの治療用途は、体内の細胞の壁を越え薬物担体とその貨物の安全かつ効率的な輸送を必要とする。この記事では、胃腸（GI）上皮のような細胞壁を越えた薬物ナノキャリア（NCS）の輸送速度とメカニズムを評価するために確立された方法の適応を説明します。

携帯の障壁を通過する薬物送達システムの輸送を評価するためのモデルと方法

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

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46.1K ビュー.  University of Maryland. 多くの治療用途は、体内の細胞の壁を越え薬物担体とその貨物の安全かつ効率的な輸送を必要とする。この記事では、胃腸（GI）上皮のような細胞壁を越えた薬物ナノキャリア（NCS）の輸送速度とメカニズムを評価するために確立された方法の適応を説明します。 

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Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

使用プラ​​センタアクロス異物およびナノ材料の輸送速度の決定<em&gt; ex vivoで</em&gt;ヒト胎盤灌流モデル

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

生物工学

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3次元細胞培養のための自己申告足場

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

シルクナノ粒子の製造および薬物送達アプリケーション

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

実験および有限要素議定書は、関節軟骨全体で中性および荷電溶質の輸送を調査します

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

化学の活用方法を使用して E 型肝炎ウイルスのナノ粒子の表面化学

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

3 つの補完的な手法を使用して胎盤をターゲットとした薬剤投与の安全性の総合評価

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

化学のエピジェネティックな修飾剤の細胞機械装置をリダイレクトすることによって遺伝子の転写を抑制

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

化学誘引物質勾配に対するマルチセル応答の3D 解析

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

マイクロ流体混合プラットフォームを用いた遺伝子導入のための脂質ナノ粒子の作製と特性化

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such as the cornea and conjunctiva. While therapeutic effects and pharmacokinetics of the drugs upon subconjunctival injection have been described in some studies, very few assess the ocular distribution of drugs or drug delivery systems (DDS). The latter is critical for the optimization of intraocular DDS design and drug bioavailability to achieve the desired ocular localization and duration of action (e.g., acute versus. prolonged). This study establishes the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to qualitatively study the ocular distribution of fluorescent liposomes in real-time in live mice after sub-conjunctival injection. Being designed for in vivo visual inspection of tissues at the microscopic level, this is also the first full description of the CLM imaging method to study spatio-temporal distribution of injectables in the eye after subconjunctival injection.

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

We present a protocol for the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to non-invasively study the spatio-temporal distribution of liposomes in the eye after subconjunctival injection.

光ファイバー共焦点レーザー微小内視鏡検査を用いた眼内ドラッグデリバリーシステムの時空間的イン ビボ イメージング

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...