Bu çalışma Howard Hughes Tıp Enstitüsü ve Ulusal Bilim Vakfı RG ve Sağlık (Hibe R01-HL98416) Ulusal Enstitüleri ve Amerikan Kalp Derneği (Grant 09BGIA2450014) ile SM verilen fonların bir burs ile desteklenmiştir.

1.. Transwell Ek&#39;ler hücre tek tabaka Kültürleme <ol><li> Steril, biyogüvenlik düzeyi 2 hücre kültürü kaputu, 0.8 mm PET forseps ile (istatistiksel anlamlılık için, durum başına 4 kuyu) 24 plaka içine ekler Transwell gözenek yerleştirin. Kapağı giren bütün malzemeler, etanol ile sterilize edilmelidir. </li></ol> Not: filtrenin gözenek boyutu NC kullanılan ortalama boyutuna uygun olarak seçilmesi gerekir, zar boyunca taşıma izin vermek. Ayrıca, istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için, her deney durumu aynı deney içinde dört tekrarlar (oyuk) bir minimum ve 3 bağımsız deney en az gerektirir. <ol start="2"><li> Bir su banyosu içinde 37 ° C hücre kültürü 4.5 g / L glukoz,% 15 fetal bovin serum ve% 1 Pen Strep ile takviye edilmiş DMEM ortamı ihtiva eden bir ortam, ve ısı hazırlayın. </li><li> Hücre ortamı ve yerinde (Caco-2) hücreleri insan epitel kolorektal adenokarsinom seyreltin/ Cm 2 1.5 x 10 5 hücre yoğunluğunda transwell ucun üst (apikal) bölme içine, hücre çözeltisinin 200-400 ul. Hücre ortamında 900 ul - 700 ile alt (bazolateral) bölmesini doldurun. </li><li> Adım 1.3 &#39;de gösterilen birimleri kullanılarak, her 3-4 günde, üst ve alt odası içindeki bir ortam değiştirme 37 ° C,% 5 CO2 ve 16-21 gün için% 95 nem oranında kültür hücreleri. , Alt bölmeden orta aspire üst bölmeden orta aspire, taze ortam ile üst bölmeyi doldurmak ve alt bölmeyi doldurmak: Hücre mono tabakasının (yerine göre aşağıda) üzerindeki basıncın muhafaza edilmesi için aşağıdaki sırayla orta değiştirin taze ortam. </li></ol> 2. Sıkı EklemlerininTünelleme GI epitel geçirgenliği Transepitelyal Elektrik Direnci kullanma Bariyer (TEER) ve immünboyanmadan Doğrulama <ol><li> Kısa süreli saklama (2 haftadan daha az) için, bir elektrolit sorunun çözümünden de STX100 elektrotlar batığıntion (0.1-0.15 M KCl veya NaCl). Sistem dahili kısa devre ve elektrot simetri korunur, böylece EVOM volt-ohm metre üzerinde elektrot noktasına elektrot kablosunu bağlayın. Uzun süreli depolama için, dH 2 O ile yıkayın ve kuru, karanlık koşullarda saklayın. </li><li> , Elektrotlar sterilize 15 dakika boyunca etanol içinde batırmak ve 15 saniye boyunca havada kurumaya izin vermek için. Alternatif olarak, elektrotlar bir UV başlığı içinde saklanabilir. Her bir ölçümden önce direnç, steril bir elektrolit çözeltisi (fosfat tamponlu tuz çözeltisi, PBS) veya 0.1-0.15 M KCl veya NaCl çözeltisi içinde elektrotlar durulayın. </li><li> Volt-ohm metre direnç ayara sahip, dikey olarak üst odasında kısa elektrot ve kuyunun alt temas alt bölme içinde uzun elektrot ile, iyi transwell inserti ihtiva eden elektrotlar yerleştirin. Her bir kuyu için; EVOM okuma stabilize sonra, (Ω ohm verilen) direnç değerini kaydedin. </li><li> Özdirenç (DAYANIKLI hesaplayınce alana normalize; Ω × cm 2) arka plan direncini hücreleri olmadan transwell uçlar (TEER) çıkarılarak ve membran yüzey alanı ile çarpılarak numunelerin. Direnç değerleri en sık literatürde bildirilmiştir. (Tartışma bak) </li><li> TEER tipik olarak hücre platting andan itibaren 2-3 hafta alır geçirgenlik bariyer oluşumunu gösteren bir maksimum ve plato sebebiyet değeri kadar her 1-2 gün ölçümleri tekrarlayın. Plato TEER değerleri ve bariyer bütünlüğünü sağlamak için gerekli zamanı hücre kanalı sayısına bağlı olarak değişebilir. </li><li> Yüksek TEER (engelleyici formasyonu için eşik değerine eşit veya üzerinde) ile hücre mono tabakaları sıkı birleşme varlığını doğrulamak için, 15 dakika boyunca soğuk% 2 paraformaldehid ile inkübasyon yoluyla Hücreleri sabitlemek. Daha sonra, 1 ug / ml anti-occludin ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS ile bunları hücreleri yıkayın ve inkübe edilir. PBS ile tekrar hücreleri yıkayın ve 7.5 ug / ml F, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca inkübeluorescently-etiketli sekonder antikorları içerir. Bariyer oluşumu için bir negatif kontrol olarak, düşük TEER ile kuyu kullanın. </li></ol> Not: Anti-occludin için bir ikame olarak, alternatif bir sıkı bağlantı proteinlerine antikorlar kullanılabilmektedir. <ol start="7"><li> Dikkatlice sabit tek tabaka bağlı olduğu filtre zarı tüketim ve Epifloresans veya konfokal mikroskopi kullanılarak görüntüleme için slaytlar üzerine monte edilir. </li></ol> 3. Hedeflenen Taşıyıcılar Transepitelyal Transport Değerlendirilmesi <ol><li> 7, daha önce tarif edildiği gibi, 125 I ile hedefleme antikoru (bu örnekte, ICAM-1&#39;e karşı fare monoklonal antikoru, anti-ICAM) etiketleyin. Etiketli antikorun antikor üzerindeki 125I içeriğini belirlemek için, protein konsantrasyonu ve bir gama sayacı tahmin etmek Bradford tahlili kullanarak, ardından dakika (CPM) sayım olarak spesifik aktivitesinin hesaplanması / mg. </li></ol> Not: özgünlük için kontrol etmek için, yenidenUygun olmayan bir kaplanmış, NCS hazırlamak için kullanılacak etiketleme fare IgG ile prosedür turba. Terapötik bir kargo taşıma incelemek için, bu örnekte, yük etiketleme prosedürü, örneğin, alfa-galaktosidaz (α-Gal) tekrarlayın. Alternatifler hedefleme ajanı, spesifik olmayan bir kontrol ya da tedavi edici yükler için de kullanılabilir. Alternatif yöntemleri de bileşikler etiket ve etiketlenmiş meslektaşları konsantrasyonunu tahmin etmek için kullanılabilmektedir. <ol start="2"><li> Çift NCS yüzeyine antikoru (örnekte anti-ICAM) hedefleme etiketli. Bu örnekte, 7, tarif edildiği gibi, yüzey soğrulmasına olanak vermek için 125 I-anti-ICAM ile oda sıcaklığında 1 saat boyunca polistiren nanobeads (100-nm çapında) inkübe edilir. </li></ol> Not: spesifik olmayan kontrol 125I-IgG kullanın. Bir kargo taşıma izlemek için, antikor ve 125-etiketli kargo (bizim örneğimizde α-Gal) hedefleyen bir arada kullanın. <ol start="3"><li> 3 dakika boyunca 13,000 x g&#39;de santrifüj ve aspirasyon ile üstte yüzen madde içindeki kaplı olmayan muadilleri çıkarın. Parçacıkların kümelenmesi potansiyel (20-30 kısa darbeler) bozmak için düşük güçte% 1 sığır serum pipetleme PBS albümini (BSA) ve sonikasyon kullanılarak kaplanmış NCS içeren pelet yeniden süspanse edin. </li><li> NC karakterizasyonu için, boyut, bir çoklu-dağınıklığa ve dinamik ışık saçılması (satıcı talimatlarına uygun) kullanılarak kaplanmış parçacıkların ζ-potansiyelini ölçmek ve sayısını ölçmek 125 kullanarak bir parçacık yüzeyi üzerinde antikor moleküllerinin (örneğin, anti-ICAM) hedef-işaretli gama sayacı. </li></ol> Not: Bu yöntem, spesifik olmayan ve terapötik karşıtları için tekrarlanabilir. Kaplanmış taneciklerin büyüklüğü 200 nm civarında değişmektedir. <ol start="5"><li> TEER ile birleşen ve Caco-2 tek katmanlarının üzerindeki üst bölmeye, 125 I-antikor NCS, (56 nCi / ml, örneğin 125I-anti-ICAM NCS) ekleyin# 8805; arka plan üzerinde 350 Ω × cm 2 (Tartışma) (16-21 gün sonrası-ekim). Bir veya daha fazla arzu edilen zaman aralıkları boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilir. Geçirgenlik bariyer üzerinde NC&#39;ler etkilerini değerlendirmek için inkübasyon öncesi ve sonrası Teer (Bölüm 2.3) ölçün. </li></ol> Not: Bu işlem, özel olmayan ve terapötik karşıtları için tekrarlanabilir. <ol start="6"><li> Üst ve alt odadan orta toplamak ve 37 ° C (oda üst) veya 1 ml dH 2 O (alt odası) 0.5 ml DMEM ile bir kere yıkayın. Bir gama sayacı kullanılarak toplam radyoizotop içeriğinin ölçülmesi için yıkama toplayın. </li><li> Hücre fraksiyonu ölçümü için, kenarlarda kesme ve ölçme hücresi önce 10 dakika boyunca (hücre içeriği serbest bırakmak için),% 1 Triton X-100 ile bir gamma sayıcı tüp içinde inkübasyona bir ustura kullanılarak, örneğin, geçirgen filtre tüketim toplam radyoaktivite ilişkili. </li><li> Ben tekrar 125 ölçmek için, olası bozulma, ilk karışımı, PBS içinde% 3 BSA içinde 700 ul ve 200 ul trikloroasetik asit (TCA) ile (üst, alt veya hücre fraksiyonlarından) numune 300 ul için nakil sırasında NC&#39;ler veya kiralanan. 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Bununla birlikte, bu kez, bir gamma sayacında Bu örnek, toplam radyoaktivite ölçülür. </li><li> Bozulmuş protein veya 125 I fraksiyon (yüzer) için sağlam protein (pelet) ayırmak üzere 5 dakika boyunca 3000 x g&#39;de santrifüjleyin TCA örnekleri. Serbest 125I fraksiyonun radyoaktivitesi sayısal olarak ve daha önce santrifüj ölçülen toplam radyoaktivitenin bu değeri çıkarın. Bu bozulmuş değildir etiketli protein miktarını sağlayacaktır. </li></ol> 4. Hedeflenen Nanocarriers of Transepitelyal Ulaştırma Mekanizması <ol><li> Etiket da Bölüm 3.1 &#39;de tarif edildiği gibi 125 ile bir albümin 7 bildirilmiştir. </li></ol> Not: Albumin a 66.5 olduğunudolayısıyla kDa protein ve, nispeten büyük bir madde. Küçük ilaç taşıyıcılarının taşıma okuyan zaman büyük nesneler (örneğin 200 nm NC&#39;ler Burada kullanılan) pasif taşıma için geçerli bir denetim, bu (Tartışma) küçük asal izleyici moleküller ile ikame edilmelidir rağmen. <ol start="2"><li> Albumin paraselüler sızıntı, yukarıda tarif edildiği gibi Transwell kültür ekleri üzerine Caco-2 tek tabakaları kullanılarak paraselüler taşıma değerlendirmek. </li><li> Hücre mono tabakasının üzerindeki üst odası ortamı için, (Bölüm 3.5 &#39;de tarif edildiği gibi) 125 I-albümin, tek başına (sızıntısının bazal seviyesini gösteren negatif kontrol) ya da 125 I-albümin ve non-radyo-etiketli antikor ya da hedefli bir NCS ekleyin. NC taşıma test ederken muayene uymalıdır seçilen zaman aralığı (s), 37 ° C&#39;de inkübe edin. Öncesinde, sırasında Teer (Bölüm 2.3) ölçün ve belirtildiği gibi inkübasyondan sonra, bundan sonra, toplam 125 I ve serbest 125I ölçümleri seyahati fraksiyonlarım toplamak. Bölüm 3 Not: 125I-albümin ve radyo-etiketlenmemiş kontrol IgG NC&#39;ler eş zamanlı ek bir kontrol olarak kullanılabilir. </li><li> Arası bağlantı yerlerine açılması için bir pozitif kontrol olarak, hücre ortamı transwell ucun üst ve alt bölmelere 5 mM H 2 O 2 içeren ekleyin ve 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Daha sonra, Teer (Bölüm 2.3) ölçmek ve seçilen zaman aralıkları için üst bölmeye 125 I-albümin ekleyin. H 2 hücre birleşme kısımlarının O 2 kaynaklı açma neden olduğu çürüme TEER değeri tespit etmek kuluçkalama boyunca çeşitli zaman noktalarında Teer ölçün. </li><li> Paralel deneylerde, 50 uM ya da monodansylcadaverine ile birleşen Caco-2 tek-tabakalar inkübe edilerek 125 I-hedefli NCS, aynı zamanda transsitoz adlandırılan hücre üzerinden taşıma değerlendirmek (MDC, klatrin dolayımlı endositoz inhibitörü), 1 ug / ml filipin (caveolar inhibitörü aracılı endositoz), 0.5 uM Wortmannin ya da 20 uM [5 - (N-etil-N-izopropil) amilorit] (fosfatidilinositol 3 makropinositoz dahil kinaz [PI3K] inhibitörü) (makropinositoz ve CAM dolayımlı endositoz 15 inhibitörü EIPA). </li></ol> Not: 125I-IgG NC&#39;ler ve 125 I-albumin, bu inhibitörlerin etkisi için negatif kontrol olarak kullanılabilir, ve diğer yöntemler (örneğin, siRNA teknikleri) daha seçici inhibisyonu sağlayabilir. <ol start="6"><li> Tek tabaka geçirgenliği üzerindeki inhibitörlerinin etkisi için ilave bir kontrol olarak, Teer sırasında önce (Bölüm 2.3) ve inhibitörleri ve radyo-etiketli malzeme ile hücrelerin inkübasyonu sonrasında ölçün. </li></ol>

<ol>
	<li>Deli, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+tight+junction+modulators+to+reversibly+open+membranous+barriers+and+improve+drug+delivery.">Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).</li><li>Mrsny, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+nature:+"Pathogen-Mimetic"+systems+for+mucosal+nano-medicines.">Lessons from nature: "Pathogen-Mimetic" systems for mucosal nano-medicines.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 172-192 (2009).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+and+stimuli-sensitive+pharmaceutical+nanocarriers.">Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 71, 431-444 (2009).</li><li>Sadekar, S., Ghandehari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+transport+and+toxicity+of+PAMAM+dendrimers:+implications+for+oral+drug+delivery.">Transepithelial transport and toxicity of PAMAM dendrimers: implications for oral drug delivery.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 571-588 (2012).</li><li>Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+design+and+characterization+of+ligand-targeted+drug+delivery+systems.">Challenges in design and characterization of ligand-targeted drug delivery systems.</a> J. Control. Release. , 0168-3659 (2012).</li><li>Volkheimer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persorption+of+particles:+physiology+and+pharmacology.">Persorption of particles: physiology and pharmacology.</a> Adv. Pharmacol. Chemother. 14, 163-187 (1977).</li><li>Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-cell+junctions:+happy+together.">Endothelial cell-cell junctions: happy together.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 261-270 (2004).</li><li>Jung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+for+oral+delivery+of+peptides:+is+there+a+role+for+polymers+to+affect+mucosal+uptake.">Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: is there a role for polymers to affect mucosal uptake.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 50, 147-160 (2000).</li><li>Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+drug+permeability+and+prediction+of+drug+absorption+in+Caco-2+monolayers.">Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers.</a> Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).</li><li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+(Caco-2)+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability.">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).</li><li>Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+epithelial+cell+culture+in+studies+of+drug+transport.">Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport.</a> Methods Mol. Biol. 188, 233-272 (2002).</li><li>Bareford, L. M., Swaan, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+mechanisms+for+targeted+drug+delivery.">Endocytic mechanisms for targeted drug delivery.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 748-758 (2007).</li><li>Tuma, P. L., Hubbard, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcytosis:+crossing+cellular+barriers.">Transcytosis: crossing cellular barriers.</a> Physiol. Rev. 83, 871-932 (2003).</li><li>Muro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endocytic+pathway+induced+by+clustering+endothelial+ICAM-1+or+PECAM-1.">A novel endocytic pathway induced by clustering endothelial ICAM-1 or PECAM-1.</a> J. Cell Sci. 116, 1599-1609 (2003).</li><li>Shah, P., Jogani, V., Bagchi, T., Misra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Caco-2+cell+monolayers+in+prediction+of+intestinal+drug+absorption.">Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption.</a> Biotechnol. Prog. 22, 186-198 (2006).</li><li>Delie, F., Rubas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+colonic+cell+line+sharing+similarities+with+enterocytes+as+a+model+to+examine+oral+absorption:+advantages+and+limitations+of+the+Caco-2+model.">A human colonic cell line sharing similarities with enterocytes as a model to examine oral absorption: advantages and limitations of the Caco-2 model.</a> Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, 221-286 (1997).</li><li>Kuhnline Sloan, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+and+biological+methods+for+probing+the+blood-brain+barrier.">Analytical and biological methods for probing the blood-brain barrier.</a> Annu. Rev. Anal. Chem. 5, 505-531 (2012).</li><li>Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+three-dimensional,+all-human+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+using+mono-,+co-,+and+tri-cultivation+Transwell+models.">Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models.</a> J. Neurosci. Methods. 199, 223-229 (2011).</li><li>Kasper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flotillin-involved+uptake+of+silica+nanoparticles+and+responses+of+an+alveolar-capillary+barrier+in+vitro.">Flotillin-involved uptake of silica nanoparticles and responses of an alveolar-capillary barrier in vitro.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. , 0939-6411 (2012).</li><li>Ghaffarian, R., Bhowmick, T., Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+nanocarriers+across+gastrointestinal+epithelial+cells+by+a+new+transcellular+route+induced+by+targeting+ICAM-1.">Transport of nanocarriers across gastrointestinal epithelial cells by a new transcellular route induced by targeting ICAM-1.</a> J. Control. Release. 163, 25-33 (2012).</li><li>Hsu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+endothelial+delivery+and+biochemical+effects+of+alpha-galactosidase+by+ICAM-1-targeted+nanocarriers+for+Fabry+disease.">Enhanced endothelial delivery and biochemical effects of alpha-galactosidase by ICAM-1-targeted nanocarriers for Fabry disease.</a> J. Control. Release. 149, 323-331 (2011).</li><li>Schmiedlin-Ren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+enhanced+oral+availability+of+CYP3A4+substrates+by+grapefruit+constituents.+Decreased+enterocyte+CYP3A4+concentration+and+mechanism-based+inactivation+by+furanocoumarins.">Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruit constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins.</a> Drug Metab. Dispos. 25, 1228-1233 (1997).</li><li>Hughes, J., Crowe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+P-glycoprotein-mediated+efflux+of+digoxin+and+its+metabolites+by+macrolide+antibiotics.">Inhibition of P-glycoprotein-mediated efflux of digoxin and its metabolites by macrolide antibiotics.</a> J. Pharmacol. Sci. 113, 315-324 (2010).</li><li>Wielinga, P. R., de Waal, E., Westerhoff, H. V., Lankelma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transepithelial+drug+transport+by+on-line+measurement:+cellular+control+of+paracellular+and+transcellular+transport.">In vitro transepithelial drug transport by on-line measurement: cellular control of paracellular and transcellular transport.</a> J. Pharm. Sci. 88, 1340-1347 (1999).</li><li>Morris, M. C., Deshayes, S., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+from+molecular+mechanisms+to+therapeutics.">Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics.</a> Biol. Cell. 100, 201-217 (2008).</li><li>Kapus, A., Szaszi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+apical+and+paracellular+transport+processes.">Coupling between apical and paracellular transport processes.</a> Biochem. Cell Biol. 84, 870-880 (2006).</li><li>Hood, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+protection+by+PECAM-targeted+delivery+of+a+novel+NADPH-oxidase+inhibitor+to+the+endothelium+in+vitro+and+in+vivo.">Antioxidant protection by PECAM-targeted delivery of a novel NADPH-oxidase inhibitor to the endothelium in vitro and in vivo.</a> J. Control. Release. 163, 161-169 (2012).</li><li>Simone, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+targeting+of+polymeric+nanoparticles+stably+labeled+with+the+PET+imaging+radioisotope+iodine-124.">Endothelial targeting of polymeric nanoparticles stably labeled with the PET imaging radioisotope iodine-124.</a> Biomaterials. 33, 5406-5413 (2012).</li><li>Vercauteren, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers:+optimization+and+pitfalls.">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li></ol>

Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.

Yukarıda tartışılan yöntemler kullanılarak, hücresel engelleri arasında hedef NCS taşıma çalışmak için bir hücre modeli bu durumda kana GI lümeninden taşıma değerlendirilmesi için uygun olan Caco-2 epitel hücreleri için, verilen örnekte olduğu gibi, kurulabilir ağızdan ilaç verme sistemleri. Transwell ekler GI epitel hücre mono tabakaları kültürleme bir hücre geçirgenliği bariyer oluşumu teyit TEER ölçümü ve sıkı kavşaklar floresan bağışıklık boyamasım sağladı. Daha sonr...

Dış çevre ve iç bölmeleri arasında bir ağ geçidi olarak vücut eyleminde hücresel engelleri. Bu durum, gastrointestinal (GI) sistemi ve kan 1-3 maruz kalan harici bir yüzey ayırma epitel astar için de geçerlidir. Hücresel bariyerleri de kan ve parankimi ve doku ve organların hücresel bileşenleri arasındaki arayüz temsil eder. Vücutta bu hücresel engelleri hareket yeteneği terapötik ve teşhis maddeleri etkili biçimde aktarılması için çok önemlidir 1 Bu, vb kan-akciğer engeli, kan-beyin engeli, kan damarları, endotel iç astar için geçerlidir müdahale gerekli dolaşımı ve dokuların / organların içine. Tedavi edici veya teşhis edici maddelerin geliştirilmesi için, bu bileşikler, alt mikrometre nanocarriers (NCS) yüklenebilir. Bu ilaç dağıtım araçları, çeşitli ile formüle edilebilirkimyaları ve ilacın çözünürlüğünü koruma, farmakokinetik, serbest ve metabolizma 4,5 optimize yapıları. NC&#39;ler, terapötik etki için gerekli olan, 2,6 vücut bölgelerine yapışmasını kolaylaştırmak için afinite ya da (örn. antikorlar, peptidler, şekerler, aptamerler) hedefleme parçaları ile fonksiyonalize edilebilir. Hücresel engellerin yüzeyinde ifade belirleyicilere NC&#39;ler hedeflenmesi daha fazla 2,6 içine ve / veya bu astarları arasında taşınmasını kolaylaştırır. Seçici iki ortam arasında madde taşınması rolü hücre katmanları arasında bazı benzersiz özellikleri gerektirir. Boşlukların lümeni bakan apikal zar zar morfoloji ve lipid, taşıyıcılar ve reseptörler 2 bileşimi ile ilgili olarak, doku interstisyumunda yönelik bazolateral zardan değişir ve böylece Böyle bir özellik, hücre kutupludur. Diğer bir özelliği içerir arası junctiokomşu hücreyi birleştiren ns. Sıkı birleşim, özellikle kavşak yapışma molekülleri (Sıkışması), occludins ve klaudin oluşturan proteinlerin düzenlenmesi konusunda bu lumeninden maddelerin geçişine izin veren, seçici paraselüler taşıma olarak bilinen hücrelerin arasında maddelerin taşınmasına olanak veya olmasın bariyer fonksiyonunu modüle basolateral alan 3. Vücutta hücresel bariyerleri için birçok doğal ve sentetik elemanları (lökositler, moleküller, parçacıklar ve ilaç verme sistemleri gibi) bağlanma, bu nedenle, bir erişim güvenli olmayan geçici ve nispeten zararsız ya da daha uzun olabilir ve bu, hücre-bağlantı açıklığı uyarabilir 2,5,7-9 bariyer üzerinde arzu edilmeyen maddeler. Sonuç olarak, bu geçiş yolu, transepitelyal elektrik direnci (TEER) ve moleküllerin pasif difüzyon paraselüler (burada adı paraselüler kaçak) ölçülmesiyle değerlendirilebilir, bu sayede, bir elektrik akımı ya da bir ine artan paraselüler sızıntıya direnci azalmışbazolateral boşluğa rt bileşiği, hücre birleşme açılmasını gösterir sırasıyla 5,10,11. Boyama tüm hücre kenarına 5,10,12 çevresinde hücre-hücre sınırlarının altında konsantre gözükmelidir.Onu burada bu yöntemler tamamlamak üzere, yukarıda listelenen sıkı birleşme proteinlerinin herhangi bütünlüklerini değerlendirmek için boyanmış olabilir. Alternatif olarak, klatrin kaplı çekirdeklerin veya caveolae olarak adlandırılan bir şişe-şekilli zar invajinasyonları, ilişkili olanlar gibi, spesifik hücre yüzeyi belirleyici, hedef ilaç dağıtım sistemleri, hücre içi bölmelerin 5&#39;e ilaç verilmesi için bir yol sağlayarak, endositoz ile hücre içine alınmasını veziküler tetikleyebilir 13. Buna ek olarak, endositoz bazolateral tarafında serbest, transyctosis olarak bilinen bir olgu ya da hücre üzerinden taşıma için 14 hücre gövdesi boyunca veziküllerin ticareti yol açabilir. Bu nedenle, endositoz kinetiği ve mekanizmasının bilgisi hücre içi a yararlanmak için kullanılabilmektedirnd paraselüler rotaya göre teslimat nispeten güvenli ve kontrollü bir mod sunuyor transsellüler ilaç dağıtım,. Endositoz mekanizması, klasik yolları (klatrin ve caveolin aracılı endositoz ve makropinositoz) ya da klasik olmayan yollarının modülatörleri ile değerlendirilebilmektedir (örneğin, hücre yapışma molekülü durumunda olduğu gibi (CAM) aracılı endositoz) 5,13,15 . Hücre içi ticaretinin genellikle standart kuyulara veya lamelleri okudu Oysa, bir Bazolateral bölmesinin olmaması hücre kutuplaşmayı ve hücre katmanları arasında ulaşım çalışma yeteneğini engellemektedir. Bu engeli aşmak için, hücre tekli katmanları üzerinde taşıma uzun transwell bir üst (apikal) odası, hücreler takmak ve sıkı bir tek tabaka oluşturan bir gözenekli geçirgen zar oluşur ki, 10,11,16,17 ekler, ve bir alt kullanılarak incelenmiştir (Bazolateral) odası (Şekil 1). Bu yapılandırmada, taşıma ölçülebilirapikal-to-bazolateral, üst bölmesine bir tedavi uygulanmasını hücre mono tabakasında ve altta yatan gözenekli zar içinden taşınmasını takiben, ve son olarak taşınan malzeme miktarının belirlenmesi için, alt bölmede ise orta toplayarak yönü. Bazolateral-apikal yönünde Transport aynı zamanda, üst bölme 5,10,12,16 ikinci alt bölme ve daha sonra toplama ilk uygulanması ile ölçülebilir. Çeşitli teknikler yukarıda tarif edildiği gibi, TEER ve paraselüler taşıma deneyleri de dahil olmak üzere transwells ilgili geçirgenlik bariyeri oluşumunu doğrulamak için vardır. Buna ek olarak, hücreler kültürlenir üzerinde geçirgen filtre (floresan konfokal, elektron mikroskopi ile) görüntüleme analizi için kaldırılabilir ayrıca, hücre tek tabaka modeli doğrulama hem de taşıma mekanizması olarak. Farklı gözenek boyut, malzeme ve yüzey alanları mevcuttur membran türü, seçimi, çeşitli fiili bağlıdırBu tür maddelerin bir boyut veya taşınan nesneler, hücre tipi ve görüntüleme yöntemi 16,18-20 olarak rs. Transwell uçlar da bölmeler ve hücre yüzey alanı hacim sabitleri bilinmektedir kompleks bir memeli sistemleri ile karşılaştırıldığında taşıma kontrollü ve hassas ölçümü kolaylaştırır. In vivo verilmesi dahil birçok faktör gibi bağırsak mukus varlığı, kesme stresi, sindirim enzimleri, bağışıklık hücreleri, aşağıdakileri içeren, elimine edilir olsa da, in vitro modelinde bu küçük çaplı taşıma ilgili yararlı ön bilgiler sağlar. Hücresel engelleri 10,11,16,17 genelinde NC taşıma çalışma bu yöntemlerin adaptasyonunu göstermek için bir örnek olarak, biz burada GI epitel üzerinden NC taşınması için potansiyel bir model ilaç dağıtım geçişini değerlendirerek modellenmiş bir olgu sunulmuştur insan epitel kolorektal adenokarsinom (Caco-2) hücreleri, bir tek tabaka ile sistemi. Bu amaçla, carşın saydamdır ve mikroskopi görüntüleme için kullanılabilecek bir 0.8 um gözenek polietilen tereftalat (PET) filtre (6.4 mm çap) üzerinde, transwell uçlar kültürlenmiştir. Geçirgenlik bariyeri durumu Teer, bir kontrol madde, albumin ve sıkı birleşme, occludin proteinin bir elemanın floresan mikroskobu görselleştirme apikal-to-bazolateral taşıma ölçülmesiyle doğrulanır. Polimer hedef NC bir model 100 nm, doğada çözülmeyen polistiren nano partiküller oluşan kullanılır. NC&#39;ler yüzey tek bir hedef antikor ile adsorpsiyon ya da bir hedef antikorun bir kombinasyonu ve bileşen ya da radyoizotop izleme boyunca 125 I ile etiketlenebilir terapötik bir kargo ile kaplanmıştır. Seçilen örnek, antikor, hücreler arası yapışma molekülü-1 (ICAM-1) gösterilmiştir, bir protein GI epitel yüzeyinde eksprese (ve diğer) hücre içi ve hücre üzerinden taşıma o kolaylaştırmak gösterilmiştir hücreleri,<html> f ilaç taşıyıcıları ve bunların kargolar 21. Yük alfa-galaktosidaz (α-Gal), Fabry hastalığı, genetik bir lizozomal depo 22 bozukluk tedavisi için kullanılan tedavi edici bir enzimdir. Boyutu yaklaşık 200 nm kaplanmış NC&#39;ler, değişen zaman dönemleri için hücre mono tabakasında üzerinde apikal bölmeye ilave edilmiş ve 37 ° C&#39;de inkübe edilir ve bundan sonra 125 NCS I hücre mono tabakasında ve / veya ilişkili tespit edilebilir Hücrelerin aşağıdaki bazolateral bölmeye taşınır. Ücretsiz 125 I Ek belirlenmesi kaplanmış NC ulaşım bozulmuş fraksiyonu ve tahmini çıkarma sağlar. Taşıma mekanizması ayrıca hücre üzerinden taşıma endositoz ve transsitoz arasında yolunu modüle zaman taşıma değişiklikler incelenerek belirlenir ise, yukarıda tarif edilen parametreler aracılığıyla, paraselüler yönlendirmek için ilişkin geçirgenlik bariyeri değişiklikler incelenerek değerlendirilir. &quot;ontent&gt; Bu yöntemler, tamamen hücresel engelleri arasında ilaç verilmesi için potansiyel olarak değerlendirilmesine imkan veren, değerli hücre bariyer modelleri ile ilgili bilgiler, bir ilaç verme sisteminin taşıma oranı ve derecesini, ve bu taşıma mekanizmasını sağlar.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Transwell inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), 1x</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-37TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125Iodine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ033H002MC</td>
			<td>Radioactive hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Equitech Bio</td>
			<td>BAH-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulin G (IgG)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>015-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)</td>
			<td>Marlin 1987</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Galactosidase, from green coffee beans</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8507-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC latex beads, 100 nm</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>17150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>234729-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA433-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-27151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monodansylcadaverine (MDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wortmannin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Wizard2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt-ohm meter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEER electrodes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>STX100</td>
			<td>Electrodes available for different well-plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Light Scattering (DLS)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nano-ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers

Alt-mikrometre taşıyıcılar (nanocarriers; NC&#39;ler) çözünürlük, istikrar, dolaşım süresi, hedefleme ve salınımını artırarak ilaçların etkinliğini arttırmak. Buna ek olarak, vücuttaki hücre engelleri geçme müdahale gereklidir dokular içine kan dolaşımı ve taşıma içine terapötik NC&#39;ler hem ağız yoluyla verilmesi için çok önemlidir. Komşu hücreler ya da (ii) hücre üzerinden hücre gövdesi üzerinde taşınan malzeme endositoz tarafından içselleştirilir yol, ve salgılanan içiçe birleşme geçici bozulma ile, (i) paraselüler rotası: hücresel engelleri arasında NC taşıma ile elde edilmektedir ters hücre yüzeyinde (transyctosis) at. Hücresel engelleri arasında Gönderme taşıma katılan hücre yüzeyi işaretleri için spesifik olarak bağlanan hedefleyen maddeler ile terapötik ya da taşıyıcıların birleştirilmesi suretiyle kolaylaştırılabilir. Burada, WHI bir model hücre bariyerinden ölçüde ve NC taşıma mekanizması, ölçmek için bir yöntem sağlarch bir Transwell uç bulunan bir gözenekli zar üzerinde yetiştirilen gastrointestinal bir tek tabaka (GI) epitel hücreleri oluşur. Bir geçirgenlik bariyeri oluşumu transepitelyal elektriksel direnci (TEER), bir kontrol maddenin transepitelyal taşıma ve sıkı birleşme bölgesinin immün ölçümü ile teyit edilir. Bir örnek olarak, ~ 200 nm polimer NC&#39;ler terapötik bir yük taşıyan ve bir hücre yüzeyi hedef belirleyici bir antikor ile kaplanmış olan, kullanılmıştır. Antikor ya da terapötik yük radyoizotop izleme için 125 I ile etiketlenir ve etiketlenmiş NC&#39;ler değişen zaman dönemleri için hücre tek tabaka üzerinde, üst bölmeye eklenir. Temel bölmeye taşınan hücreler ve / veya ilişkili NC&#39;ler tespit edilebilir. Ücretsiz 125 I ölçümü bozulmuş fraksiyonu çıkarma sağlar. Paraselüler yol, yukarıda tarif edilen bariyer parametrelere NC taşıma ile neden olduğu potansiyel değişiklikleri saptanmasıyla değerlendirilir. Transsellüler taşıma iendositoz ve yolunu modüle transsitoz etkisini ele belirlenir s.

Hedeflenen NCS transepitelyal taşıma çalışma için hücre modelinin doğrulama olarak, Şekil 2, Caco-2 hücre mono tabakaları izdiham ~ 12 gün ulaşmıştır 1.5 x 10 5 hücre / cm 2 arasında bir yoğunlukta kaplanmıştır ve 18 gün kadar tek tabaka bütünlüğünü muhafaza olduğunu göstermektedir TEER (Şekil 2A) ile. Bu düşük TEER kötü sıkı kavşak etiketleme (17 Ω × cm 2, 5 günde kıyasla, yüksek TEER (390 Ω × cm 2,</s...

Watch this Scientific Journal Video about Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers at JoVE.com

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Birçok terapötik uygulama vücutta hücresel engelleri arasında ilaç taşıyıcıları ve yük güvenli ve etkin taşıma gerektirir. Bu makalede, gastrointestinal (GI) epitel olarak hücresel engelleri genelinde uyuşturucu nanocarriers (NCS), taşıma hızını ve mekanizmasını değerlendirmek amacıyla kurulmuş yöntemlerden bir adaptasyon açıklar.

Modelleri ve Hücresel Engeller Arasında İlaç Taşıyıcı Sistemlerin Transport Değerlendirmesinde Yöntemleri

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

models-methods-to-evaluate-transport-drug-delivery-systems-across

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Bioengineering

Unit 1

Pharmacokinetics

SCIENTISTS IN ACTION

46.1K Görüntüleme.  University of Maryland.  Birçok terapötik uygulama vücutta hücresel engelleri arasında ilaç taşıyıcıları ve yük güvenli ve etkin taşıma gerektirir. Bu makalede, gastrointestinal (GI) epitel olarak hücresel engelleri genelinde uyuşturucu nanocarriers (NCS), taşıma hızını ve mekanizmasını değerlendirmek amacıyla kurulmuş yöntemlerden bir adaptasyon açıklar. 

Video: Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Plasenta karşısında Ksenobiyotik ve Nanomalzemelerin Ulaştırma Hızı belirlenmesi kullanarak<em&gt; Ex vivo</em&gt; İnsan Plasental Perfüzyon Modeli

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Biyomühendislik

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

3-Boyutlu Hücre Kültürü için Self-raporlama iskeleleri

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

İpek Nanopartiküller imalatı ve İlaç Dağıtım Uygulamaları

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

Deneysel ve Sonlu Eleman Protokolü Eklem Kıkırdak genelinde Nötr ve Yüklü Çözünenlerin Ulaştırma Araştırma

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

Hepatit E virüs nano tanecikleri kimyasal konjugasyon yöntemlerle yüzey Functionalization

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

Kapsamlı değerlendirme etkinliği ve güvenliği üç tamamlayıcı yöntemlerle plasenta hedefli ilaç dağıtım

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Kimyasal epigenetik değiştiriciler ile hücresel makine yeniden yönlendirerek Gen transkripsiyonu bastırmak

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Chemoattractant degradelere Multi-hücresel tepkiler 3D Analizi

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

Mikroakışkan Karıştırma Platformu Kullanarak Gen Teslimatı için Lipid Nanopartiküllerinin Formülei ve Karakterizasyonsu

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such as the cornea and conjunctiva. While therapeutic effects and pharmacokinetics of the drugs upon subconjunctival injection have been described in some studies, very few assess the ocular distribution of drugs or drug delivery systems (DDS). The latter is critical for the optimization of intraocular DDS design and drug bioavailability to achieve the desired ocular localization and duration of action (e.g., acute versus. prolonged). This study establishes the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to qualitatively study the ocular distribution of fluorescent liposomes in real-time in live mice after sub-conjunctival injection. Being designed for in vivo visual inspection of tissues at the microscopic level, this is also the first full description of the CLM imaging method to study spatio-temporal distribution of injectables in the eye after subconjunctival injection.

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

We present a protocol for the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to non-invasively study the spatio-temporal distribution of liposomes in the eye after subconjunctival injection.

Fiberoptik Konfokal Lazer Mikroendoskopi Kullanılarak Oküler İlaç Dağıtım Sistemlerinin Spatio-Temporal In Vivo Görüntülemesi

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...