עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהמכון הרפואי הווארד יוז והקרן הלאומי למדע לRG, וקרנות הוענקו לSM על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (גרנט R01-HL98416) ואיגוד הלב האמריקאי (גרנט 09BGIA2450014).

1. Culturing חד שכבתי נייד בהוספת Transwell <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשכונת סטרילי, רמת בטיחות ביולוגית 2 תא תרבות, מקום 0.8 מ&quot;מ הנקבובית PET transwell מוסיף לתוך צלחת 24 גם (4 בארות לכל מצב, למובהקות סטטיסטיות) עם מלקחיים. כל החומרים שנכנסו למכסת המנוע צריכים להיות מעוקרים עם אתנול. </li></ol> הערה: הגודל הנקבובית של המסנן צריך להיות שנבחר בהסכם לגודל הממוצע של NC בשימוש, כדי לאפשר תחבורה על פני הממברנה. כמו כן, לתוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית, כל תנאי ניסוי דורש מינימום של ארבע חזרות (בארות) בתוך אותו הניסוי, ומינימום של 3 ניסויים בלתי תלויים. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המדיום סלולרי תרבות המכיל מדיום DMEM בתוספת גלוקוז 4.5 גר &#39;/ ל&#39;, 15% בסרום שור עוברי, ו -1% סטרפטוקוקוס עט, וחום ל37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל אדנוקרצינומה מעי גס אפיתל אנושי (קאקו-2) תאים במדיום סלולרי ומקום200-400 μl של פתרון התא לתוך התא העליון (הפסגה) של להכניס transwell, בצפיפות של 1.5 x 10 5 תאים / 2 סנטימטר. למלא את התא התחתון (basolateral) עם 700-900 μl של מדיום סלולרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות תאים ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, ולחות 95% עבור 16-21 ימים, והחליפו את המדיום בתא העליון ותחתון בכל 3-4 ימים, תוך שימוש באמצעי האחסון שצוין בשלב 1.3. החלף בינוני לפי הסדר הבא כדי לשמור על הלחץ מעל (ולא מתחת) monolayer התא: לשאוב את המדיום מהתא התחתון, לשאוב את המדיום מהחדר העליון, למלא את התא העליון עם מדיום חדש, ולמלא את התא התחתון עם מדיום חדש. </li></ol> 2. אימות של GI אפיתל חדירות המחסום באמצעות Transepithelial חשמל ההתנגדות (Teer) וImmunostaining של צומת הדוקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור אחסון לטווח קצר (פחות מ -2 שבועות), לצלול אלקטרודות STX100 בsolu אלקטרוליטtion (.1-.15 M KCl או NaCl). חבר את כבל האלקטרודה ליציאת האלקטרודה במד EVOM וולט אוהם, כך שהמערכת היא קצרה חשמלית באופן פנימי, והוא שמר על הסימטריה האלקטרודה. עבור אחסון לטווח ארוך, לשטוף עם DH 2 O ולאחסן אותו במצב יבש, כהה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקר את האלקטרודות, לטבול באתנול במשך 15 דקות ולאפשר לאוויר יבש ל15 שניות. לחלופין, ניתן לאחסן את האלקטרודות במכסת מנוע UV. יש לשטוף את האלקטרודות בתמיסה סטרילית אלקטרוליט (תמיסת מלח חיץ פוספט, PBS) או .1-0.15 פתרון M KCl או NaCl, לפני כל מדידת התנגדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מד וולט אוהם מוגדר להגדרת ההתנגדות, במאונך למקם את האלקטרודות הבמכילה את תוסף transwell היטב, עם האלקטרודה הקצרה בחדר העליון ואלקטרודה הארוכה בתא התחתון נוגע בתחתית הבאר. לאחר קריאת EVOM תתייצב, להקליט את ערך ההתנגדות (שניתן באוהם; Ω) לכל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב התנגדות (ההתנגדce מנורמל לאזור; Ω × 2 סנטימטר) של דגימות על ידי הפחתת התנגדות רקע (Teer של מוסיף transwell ללא תאים) והכפלה בשטח הממברנה. ערכי התנגדות לרוב מדווחים בספרות. (ראה דיון) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על מדידות בכל 1-2 ימים עד Teer ערכי עלייה למקסימום ורמה, המצביעים על היווצרותו של מחסום חדירות, אשר בדרך כלל לוקח 2-3 שבועות מרגע platting תא. ערכי המישור Teer וזמן דרוש כדי להשיג את שלמות מחסום עשויים להשתנות בהתאם למספר תא מעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לאמת את נוכחותם של צמתים הדוקים בmonolayers תא עם Teer הגבוה (שווה או מעל ערך הסף להיווצרות מחסום), לתקן את התאים על ידי דגירה עם paraformaldehyde 2% קרים במשך 15 דקות. לאחר מכן, לשטוף תאים עם PBS ומדגיר אותן 30 דקות בטמפרטורת חדר עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר אנטי occludin. שטוף תאים שוב עם PBS ומדגיר אותן 30 דקות בטמפרטורת חדר עם 7.5 מיקרוגרם / מיליליטר ונוגדנים משני luorescently שכותרת. השתמש בבארות עם Teer נמוך כביקורת שלילית להיווצרות מכשול. </li></ol> הערה: כתחליף לאנטי occludin, ניתן להשתמש בנוגדנים לחלבוני צומת הדוקים חלופיים. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבלו בזהירות את קרום המסנן שבי monolayer הקבוע מצורף, ולעלות על גבי שקופיות להדמיה באמצעות epifluorescence או confocal. </li></ol> 3. הערכת Transepithelial תחבורה של נשאים ממוקדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית נוגדנים (נוגדנים חד שבטיים כנגד עכבר ICAM-1, אנטי ICAM, בדוגמא זו) מיקוד עם 125 אני, כפי שתואר בעבר 7. השתמש assay ברדפורד להעריך ריכוז חלבון ודלפק גמא לקבוע 125 אני תוכן בנוגדנים, ואז לחשב את הפעילות הספציפית בספירת לדקה (CPM) / מ&quot;ג של נוגדן שכותרתו. </li></ol> הערה: כדי לשלוט על הספציפיות, מחדשכבול ההליך על ידי IgG עכבר תיוג, אשר ישמש להכנת NCS המצופה שאינו ממוקד. ללמוד הובלה של מטענים טיפוליים, לחזור על תהליך תיוג המטען, למשל, אלפא Galactosidase (α-Gal) בדוגמא זו. חלופות יכולות לשמש לסוכן המיקוד, שליטה שאינה ספציפית, או מטען טיפולי. גם שיטות חלופיות ניתן להשתמש כדי לתייג תרכובות ולהעריך את הריכוז של עמיתיהם שכותרתו. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זוג שכותרת מיקוד נוגדנים (אנטי ICAM בדוגמא שלנו) על פני השטח של NCS. בדוגמא זו, דגירה nanobeads קלקר (קוטר 100 ננומטר) במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר עם 125 I-אנטי ICAM לאפשר ספיחת פני השטח, כפי שתואר על 7. </li></ol> הערה: לקבלת השליטה שאינה ספציפית להשתמש 125 I-IgG. כדי לעקוב אחר שינוע מטענים, להשתמש בשילוב של מיקוד נוגדנים ו125 מטען שהכותרת אני (α-גל בדוגמא שלנו). <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב XG 13,000 במשך 3 דקות ולהסיר את עמיתיהם שאינם מצופים בsupernatant על ידי שאיפה. Resuspend את הכדור המכיל NCS המצופה באמצעות 1% אלבומין בסרום שור (BSA) ב-PBS על ידי pipetting, וsonicate בהספק נמוך כדי לשבש אגרגטים פוטנציאל חלקיקים (20-30 בפולסים קצרים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפיון NC, למדוד את הגודל, polydispersity, וζ-פוטנציאלי של חלקיקים מצופים באמצעות פיזור אור דינמי (בעקבות הוראות ספק), ולכמת את מספר 125 כותרת מיקוד מולקולות נוגדן (למשל אנטי ICAM) על פני השטח של החלקיקים באמצעות דלפק גמא. </li></ol> הערה: שיטות אלה ניתן לחזור להעמיתים שאינם ספציפיים וטיפוליים. הגודל של חלקיקים מצופים נע סביב 200 ננומטר. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 125 NCS אני נוגדנים, (למשל 125 I-אנטי ICAM NCS; 56 NCI / מיליליטר) לתא העליון מעל monolayers המחוברות קאקו-2 עם Teer &amp;# 8805; 350 Ω × 2 סנטימטר (ראה דיון) על רקע (16-21 ימים לאחר זריעה). לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך מרווחים אחד או יותר זמן רצוי. מדוד Teer (סעיף 2.3) לפני ואחרי הדגירה כדי להעריך את ההשפעות של NCS במחסום החדירות. </li></ol> הערה: הליך זה ניתן לחזור להעמיתים שאינם ספציפיים וטיפוליים. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף בינוני מהתאים העליונים ותחתונים ולשטוף אותם פעם אחת עם 0.5 מיליליטר DMEM על 37 מעלות צלזיוס (בית עליון) או 1 מיליליטר DH 2 O (תא תחתון). לאסוף את שוטף למדידה בסך הכל תוכן radioisotope באמצעות דלפק גמא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדידה של שבריר התא, בלו, המסנן החדיר, למשל באמצעות סכין גילוח כדי לחתוך מסביב לקצוות, ודגירה בצינור דלפק גמא עם 1% טריטון X-100 עבור 10 דקות (כדי לשחרר את תוכן תא), לפני מדידת תא הקשורים רדיואקטיביות סך הכל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למדוד 125 אני מחדשבחכירה מNCS במהלך הובלה או עקב הידרדרות פוטנציאלית, התמהיל ראשון 300 μl של מדגם (משברים העליונים, תחתון, או תא) עם 700 μl של BSA 3% ב-PBS ו200 μl חומצת Trichloroacetic (TCA). דגירה בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות. בינתיים זה זמן, למדוד את הרדיואקטיביות הכוללת של מדגם זה בדלפק גמא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות TCA צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 5 דקות על מנת להפריד בין חלבון שלם (גלולה) מהחלבון המושפל או 125 אני שבריר (supernatant). לכמת את הרדיואקטיביות שלי שבריר 125 החופשי ולחסר ערך זה מרדיואקטיביות בסך הכל נמדד לפני צנטריפוגה. זה יספק את כמות החלבון שכותרתו כי הוא לא מושפל. </li></ol> 4. מנגנון של Transepithelial תחבורה של Nanocarriers ממוקד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית אלבומין עם 125 כפי שתוארו בסעיף 3.1 והעבר דיווחה 7. </li></ol> הערה: אלבומין הוא 66.5חלבון kDa, ולכן, חומר גדול יחסית. למרות שליטה בתוקף להובלה פסיבית של אובייקטים גדולים יותר (למשל 200 NCS ננומטר משמש כאן), זה צריכה להיות מוחלף עם מולקולות נותב אינרטי קטנים יותר כאשר לומדים הובלה של נשאי תרופות קטנים יותר (ראה דיון). <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להעריך תחבורת paracellular באמצעות זליגת paracellular אלבומין, קאקו-2 monolayers תרבות על transwell מוסיף כפי שתואר לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדיום החדר העליון מעל monolayer התא, להוסיף או 125 I-אלבומין לבד (ביקורת שלילית המראה את הרמה הבסיסית של דליפה), או 125 NCS-ממוקד נוגדן I-אלבומין ולא רדיואקטיבי (כמתואר בסעיף 3.5). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך מרווח הזמן שנבחר (ים), שאמור להתאים לאלו שנבדקו בעת בדיקת תחבורת NC. מדוד Teer (סעיף 2.3) לפני, במהלך, ואחרי הדגירה, ואז לאסוף את כל השברים ל125 אני כולל ו125 אני מדידות חופשיות כפי שמצוין. בסעיף 3 הערה: בנוסף בד בבד 125 NCS IgG שליטת I-אלבומין ולא רדיואקטיבי עשוי לשמש כביקורת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביקורת חיובית לפתיחת צמתים אינטר, להוסיף מדיה תא המכילה 5 מ&quot;מ H 2 O 2 לתאי העליונים ותחתונים של להכניס transwell, ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. ואז, למדוד Teer (סעיף 2.3) ולהוסיף 125 I-אלבומין לחדר העליון למרווחי הזמן שנבחרו. מדוד Teer בנקודות זמן שונים לאורך הדגירה לזהות ריקבון ערך Teer נגרמים על ידי H 2 O פתיחה מושרה 2 של צמתים התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים מקבילים, להעריך תחבורת transcellular, המכונה גם transcytosis, 125 NCS-ממוקד אני על ידי דוגרים קאקו-2 monolayers מחוברות עם או monodansylcadaverine מיקרומטר 50 (MDC; מעכב של אנדוציטוזה בתיווך clathrin), 1 מיקרוגרם / מיליליטר filipin (מעכב של caveolar אנדוציטוזה בתיווך), וורטמן 0.5 מיקרומטרב( מעכב של phosphatidylinositol 3 קינאז [PI3K], מעורב בmacropinocytosis), או 20 מיקרומטר [5 - (N-אתיל-N-איזופרופיל) אמילוריד] (EIPA, מעכב של macropinocytosis ואנדוציטוזה בתיווך CAM 15). </li></ol> הערה: 125 I-IgG NCS ו125 I-אלבומין עשוי לשמש בקרות שליליות להשפעה של מעכבים האלה, ושיטות אחרות (לדוגמא: טכניקות siRNA) עשויות לספק עיכוב בררני יותר. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד Teer (סעיף 2.3) לפני, במהלך, ולאחר הדגירה של תאים עם מעכבים וחומרי רדיואקטיבי, כבקרה נוספת להשפעה של מעכבים על חדירות השכבה. </li></ol>

<ol>
	<li>Deli, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+use+of+tight+junction+modulators+to+reversibly+open+membranous+barriers+and+improve+drug+delivery.">Potential use of tight junction modulators to reversibly open membranous barriers and improve drug delivery.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1788, 892-910 (2009).</li><li>Mrsny, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+nature:+"Pathogen-Mimetic"+systems+for+mucosal+nano-medicines.">Lessons from nature: "Pathogen-Mimetic" systems for mucosal nano-medicines.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 61, 172-192 (2009).</li><li>Turner, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+mucosal+barrier+function+in+health+and+disease.">Intestinal mucosal barrier function in health and disease.</a> Nat. Rev. Immunol. 9, 799-809 (2009).</li><li>Torchilin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multifunctional+and+stimuli-sensitive+pharmaceutical+nanocarriers.">Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 71, 431-444 (2009).</li><li>Sadekar, S., Ghandehari, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+transport+and+toxicity+of+PAMAM+dendrimers:+implications+for+oral+drug+delivery.">Transepithelial transport and toxicity of PAMAM dendrimers: implications for oral drug delivery.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64, 571-588 (2012).</li><li>Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+in+design+and+characterization+of+ligand-targeted+drug+delivery+systems.">Challenges in design and characterization of ligand-targeted drug delivery systems.</a> J. Control. Release. , 0168-3659 (2012).</li><li>Volkheimer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persorption+of+particles:+physiology+and+pharmacology.">Persorption of particles: physiology and pharmacology.</a> Adv. Pharmacol. Chemother. 14, 163-187 (1977).</li><li>Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell-cell+junctions:+happy+together.">Endothelial cell-cell junctions: happy together.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 5, 261-270 (2004).</li><li>Jung, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+for+oral+delivery+of+peptides:+is+there+a+role+for+polymers+to+affect+mucosal+uptake.">Biodegradable nanoparticles for oral delivery of peptides: is there a role for polymers to affect mucosal uptake.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 50, 147-160 (2000).</li><li>Hubatsch, I., Ragnarsson, E. G., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+drug+permeability+and+prediction+of+drug+absorption+in+Caco-2+monolayers.">Determination of drug permeability and prediction of drug absorption in Caco-2 monolayers.</a> Nat. Protoc. 2, 2111-2119 (2007).</li><li>Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+human+colon+carcinoma+cell+line+(Caco-2)+as+a+model+system+for+intestinal+epithelial+permeability.">Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability.</a> Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).</li><li>Tavelin, S., Grasjo, J., Taipalensuu, J., Ocklind, G., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+epithelial+cell+culture+in+studies+of+drug+transport.">Applications of epithelial cell culture in studies of drug transport.</a> Methods Mol. Biol. 188, 233-272 (2002).</li><li>Bareford, L. M., Swaan, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytic+mechanisms+for+targeted+drug+delivery.">Endocytic mechanisms for targeted drug delivery.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 59, 748-758 (2007).</li><li>Tuma, P. L., Hubbard, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcytosis:+crossing+cellular+barriers.">Transcytosis: crossing cellular barriers.</a> Physiol. Rev. 83, 871-932 (2003).</li><li>Muro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+endocytic+pathway+induced+by+clustering+endothelial+ICAM-1+or+PECAM-1.">A novel endocytic pathway induced by clustering endothelial ICAM-1 or PECAM-1.</a> J. Cell Sci. 116, 1599-1609 (2003).</li><li>Shah, P., Jogani, V., Bagchi, T., Misra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Caco-2+cell+monolayers+in+prediction+of+intestinal+drug+absorption.">Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption.</a> Biotechnol. Prog. 22, 186-198 (2006).</li><li>Delie, F., Rubas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+colonic+cell+line+sharing+similarities+with+enterocytes+as+a+model+to+examine+oral+absorption:+advantages+and+limitations+of+the+Caco-2+model.">A human colonic cell line sharing similarities with enterocytes as a model to examine oral absorption: advantages and limitations of the Caco-2 model.</a> Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 14, 221-286 (1997).</li><li>Kuhnline Sloan, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+and+biological+methods+for+probing+the+blood-brain+barrier.">Analytical and biological methods for probing the blood-brain barrier.</a> Annu. Rev. Anal. Chem. 5, 505-531 (2012).</li><li>Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+three-dimensional,+all-human+in+vitro+model+of+the+blood-brain+barrier+using+mono-,+co-,+and+tri-cultivation+Transwell+models.">Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models.</a> J. Neurosci. Methods. 199, 223-229 (2011).</li><li>Kasper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flotillin-involved+uptake+of+silica+nanoparticles+and+responses+of+an+alveolar-capillary+barrier+in+vitro.">Flotillin-involved uptake of silica nanoparticles and responses of an alveolar-capillary barrier in vitro.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. , 0939-6411 (2012).</li><li>Ghaffarian, R., Bhowmick, T., Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transport+of+nanocarriers+across+gastrointestinal+epithelial+cells+by+a+new+transcellular+route+induced+by+targeting+ICAM-1.">Transport of nanocarriers across gastrointestinal epithelial cells by a new transcellular route induced by targeting ICAM-1.</a> J. Control. Release. 163, 25-33 (2012).</li><li>Hsu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+endothelial+delivery+and+biochemical+effects+of+alpha-galactosidase+by+ICAM-1-targeted+nanocarriers+for+Fabry+disease.">Enhanced endothelial delivery and biochemical effects of alpha-galactosidase by ICAM-1-targeted nanocarriers for Fabry disease.</a> J. Control. Release. 149, 323-331 (2011).</li><li>Schmiedlin-Ren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+enhanced+oral+availability+of+CYP3A4+substrates+by+grapefruit+constituents.+Decreased+enterocyte+CYP3A4+concentration+and+mechanism-based+inactivation+by+furanocoumarins.">Mechanisms of enhanced oral availability of CYP3A4 substrates by grapefruit constituents. Decreased enterocyte CYP3A4 concentration and mechanism-based inactivation by furanocoumarins.</a> Drug Metab. Dispos. 25, 1228-1233 (1997).</li><li>Hughes, J., Crowe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+P-glycoprotein-mediated+efflux+of+digoxin+and+its+metabolites+by+macrolide+antibiotics.">Inhibition of P-glycoprotein-mediated efflux of digoxin and its metabolites by macrolide antibiotics.</a> J. Pharmacol. Sci. 113, 315-324 (2010).</li><li>Wielinga, P. R., de Waal, E., Westerhoff, H. V., Lankelma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+transepithelial+drug+transport+by+on-line+measurement:+cellular+control+of+paracellular+and+transcellular+transport.">In vitro transepithelial drug transport by on-line measurement: cellular control of paracellular and transcellular transport.</a> J. Pharm. Sci. 88, 1340-1347 (1999).</li><li>Morris, M. C., Deshayes, S., Heitz, F., Divita, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptides:+from+molecular+mechanisms+to+therapeutics.">Cell-penetrating peptides: from molecular mechanisms to therapeutics.</a> Biol. Cell. 100, 201-217 (2008).</li><li>Kapus, A., Szaszi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+between+apical+and+paracellular+transport+processes.">Coupling between apical and paracellular transport processes.</a> Biochem. Cell Biol. 84, 870-880 (2006).</li><li>Hood, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant+protection+by+PECAM-targeted+delivery+of+a+novel+NADPH-oxidase+inhibitor+to+the+endothelium+in+vitro+and+in+vivo.">Antioxidant protection by PECAM-targeted delivery of a novel NADPH-oxidase inhibitor to the endothelium in vitro and in vivo.</a> J. Control. Release. 163, 161-169 (2012).</li><li>Simone, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+targeting+of+polymeric+nanoparticles+stably+labeled+with+the+PET+imaging+radioisotope+iodine-124.">Endothelial targeting of polymeric nanoparticles stably labeled with the PET imaging radioisotope iodine-124.</a> Biomaterials. 33, 5406-5413 (2012).</li><li>Vercauteren, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+inhibitors+to+study+endocytic+pathways+of+gene+carriers:+optimization+and+pitfalls.">The use of inhibitors to study endocytic pathways of gene carriers: optimization and pitfalls.</a> Mol. Ther. 18, 561-569 (2010).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

שימוש בשיטות שנדונו לעיל, ניתן לקבוע מודל תא לחקר תחבורה של NCS הממוקד על פני מחסומים סלולריים, כמו בדוגמא הניתנת לקאקו-2 תאי אפיתל, שהוא רלוונטי להערכת תחבורה מלומן במערכת העיכול אל הדם במקרה של מערכות להולכת תרופות דרך הפה. Culturing של monolayers תאי אפיתל במערכת העיכול במוסי?...

מחסומים נייד במעשה גוף כשער בין הסביבה החיצונית והתאים פנימיים. זהו המקרה לרירית אפיתל להפריד את פני השטח החיצוני החשופים של מערכת העיכול (GI) בדרכי ו1-3 זרם הדם. מחסומים נייד גם לייצג את הממשק שבין זרם הדם וparenchyma ומרכיבים תאיים של רקמות ואיברים. זהו המקרה לרירית האנדותל הפנימית בכלי דם, כגון מחסום דם הריאה, מחסום דם המוח, וכו &#39;1 היכולת לחצות מחסומים סלולריים אלה בגוף היא חיונית לאספקה ​​יעילה של סוכנים טיפוליים ואבחון למחזור הדם ורקמות / איברים שבו יש צורך בהתערבות. כדי לשפר את המסירה של סוכנים טיפוליים או אבחון, ניתן לטעון תרכובות אלה לnanocarriers תת מיקרומטר (NCS). אפשר לנסח רכב משלוח סמים אלו עם מגוון רחב שלchemistries ומבנים כדי לייעל את מסיסות תרופה, הגנה, הפרמקוקינטיקה, שחרור, וחילוף חומרים של 4,5. NCS יכול להיות גם פונקציונליות עם זיקה או מיקוד moieties (למשל נוגדנים, סוכרים פפטידים, aptamers, וכו &#39;) כדי להקל על הדבקה לאזורים בגוף שבו נדרש הפעולה הטיפולית 2,6. מיקוד של NCS לגורמים הביעו על פני השטח של מחסומים סלולריים יכול עוד יותר להקל על תחבורה אל ו / או על פני רפידות אלה 2,6. התפקיד של סלקטיבי שינוע חומרים בין שתי סביבות דורש תכונות ייחודיות מסוימות בקרב שכבות תאים. מאפיין אחד כזה הוא קוטביות בתא, שבו קרום הפסגה מול לומן של חללים משתנה מקרום basolateral המכוון כלפי interstitium הרקמות, ביחס למורפולוגיה קרום ורכב שומנים, מובילים, וקולטני 2. תכונה נוספת כרוכה junctio אינטרNS חיבור תאים סמוכים. רגולציה של החלבונים היוצרים צמתים הדוקים, מולקולות במיוחד junctional הידבקות (קונפיטורות), occludins, וclaudins, לווסת את תפקוד המחסום כדי לאפשר באופן סלקטיבי או לא הובלת חומרים בין תאים, המכונים תחבורת paracellular, המאפשר מעבר של חומרים מהלום ל שטח basolateral 3. עקידת אלמנטים רבים טבעיים וסינטטיים (לויקוציטים, מולקולות, חלקיקים, ומערכות אספקת סמים) לחסמים סלולריים בגוף יכולה לגרום לפתיחת תא לצומת, אשר עשוי להיות ארעי ויחסית לא מזיק או ממושך יותר, ולכן, לא בטוח עם גישה של חומרים בלתי רצויים על פני המחסום 2,5,7-9. כתוצאה מכך, מסלול זה יכול להיות מוערך על ידי מדידת ההתנגדות החשמלית transepithelial (Teer) ודיפוזיה פסיבית paracellular של מולקולות (זליגת paracellular במסמך זה נקרא), לפיה ירידה בהתנגדות לזרם חשמלי או דליפת paracellular המוגברת של ineמתחם rt לחלל basolateral מצביע על פתיחת צמתים תא, בהתאמה 5,10,11. כדי להשלים את השיטות הללו, כל אחד מחלבוני הצומת ההדוקים המפורטים לעיל יכול להיות מוכתם על מנת להעריך את היושרה שלהם, שבו צריכים להופיע כתמים מרוכזים בגבולות תאי תאים בכל רחבי הפריפריה התא 5,10,12. לחלופין, מערכות אספקת סמים, כי יעד גורמי תא שטח מסוימים, כגון אלה הקשורים לבורות מצופים clathrin או invaginations קרום בצורת בקבוק שנקרא caveolae, עלולות לעורר ספיגת ועי לתוך תאים על ידי אנדוציטוזה, מתן שדרת עבור משלוח סמים לתאים תאיים 5, 13. בנוסף, אנדוציטוזה עלולה להוביל לסחר בשלפוחית ​​על פני גוף התא לשחרור בצד basolateral, תופעה הידועה בtransyctosis, או תחבורת transcellular 14. לכן, ידע של קינטיקה והמנגנון של אנדוציטוזה ניתן להשתמש כדי לנצל תאייםnd משלוח הסמים transcellular, שמציע מצב בטוח יחסית ושליטה מלאה של משלוח בהשוואה לתוואי paracellular. (אנדוציטוזה כמו במקרה של מולקולת הידבקות תא (רמ&quot;א בתיווך)) המנגנון של אנדוציטוזה ניתן להעריך עם מאפננים של מסלולים קלאסיים (clathrin ואנדוציטוזה בתיווך caveolin, וmacropinocytosis) או מסלולים שאינם קלאסיים 5,13,15 . בעוד סחר תאיים לעתים קרובות למד בבארות או coverslips סטנדרטיים, היעדר תא basolateral מונע קיטוב תא ואת היכולת ללמוד תחבורה פני שכבות תאים. כדי להתגבר על מכשול זה, תחבורה ברחבי monolayers התא נחקרה ארוכה באמצעות transwell מוסיף 10,11,16,17, שמורכב מחדר עליון (פסגת), קרום חדיר נקבובי שבו תאים לצרף ולהקים monolayer הדוק, ונמוך יותר קאמרי (basolateral) (איור 1). בתצורה זו, תחבורה ניתן למדוד בקודקוד לכיוון basolateral על ידי מתן טיפול לחדר העליון, בעקבות ההובלה דרך monolayer התא והקרום הנקבובי הבסיסי, ולבסוף איסוף הבינוני בתא התחתון לכימות של חומר מועבר. תחבורה בכיוון basolateral לפסגה גם ניתן למדוד על ידי ממשל ראשוני לתא התחתון והאוסף הבא מהעליון קאמרי 5,10,12,16. טכניקות שונות קיימות כדי לאמת את היווצרות מחסום חדירות על transwells, כולל Teer ומבחני תחבורת paracellular, כפי שתוארו לעיל. בנוסף, המסנן החדיר שבו תאים בתרבית ניתן להסיר בניתוח הדמיה (למשל על ידי הקרינה, confocal, מיקרוסקופית אלקטרונים), כהוכחה נוספת של מודל monolayer תא, כמו גם את המנגנון של תחבורה. בחירה של סוג הקרום, שהוא זמין בגדלים שונים נקבוביות, חומרים ופני שטחים, תלויה בפקטו השוניםrs כגון גודל של חומרים או חפצים כדי להיות מועברים, סוג התא, ואת שיטת הדמיה 16,18-20. Transwell מוסיף גם להקל כימות מבוקר ומדויק של תחבורה בהשוואה למערכות של יונקים מורכבים, כאמצעי אחסון של התאים ועל פני השטח של תאים ידועים קבועים. בעוד גורמים רבים המעורבים בin vivo משלוח בוטלו, לרבות הנוכחות של ריר מעיים, מאמץ גזירה, אנזימי עיכול, תאי מערכת החיסון, וכו &#39;, בקנה מידה הקטן הזה במודל מבחנה מספקת מידע ראשוני שימושי לגבי תחבורה. כדוגמא כדי להמחיש את ההתאמה של שיטות אלה ללמוד תחבורת NC פני מחסומים סלולריים 10,11,16,17, אנו מתארים כאן מקרה שבו הפוטנציאל להובלת NC פני האפיתל במערכת העיכול היה במתכונת על ידי בחינת מעבר משלוח סמים מודל של מערכת באמצעות monolayer של אדנוקרצינומה מעי גס אפיתל האנושי (קאקו-2) תאים. לצורך, ג זואמות היו בתרבית במוסיפה transwell, על terephthalate 0.8 מיקרומטר הנקבובית פוליאתילן מסנן (PET) (קוטר 6.4 מ&quot;מ), שהוא שקוף וניתן להשתמש בם להדמיה מיקרוסקופית. מעמדו של מחסום החדירות אומת על ידי מדידת Teer, תחבורת הפסגה לbasolateral של חומר שליטה, אלבומין, והדמית מיקרוסקופ פלואורסצנטי של אלמנט של צמתים ההדוקים, חלבון occludin. מודל של פולימר הממוקד NC משמש, בהיקף של 100 ננומטר, חלקיקי פוליסטירן, לא מתכלים. NCS הם מצופים על ידי ספיחת משטח עם נוגדן מיקוד לבד או שילוב של נוגדני מיקוד ומטענים טיפוליים, שבו גם מרכיב יכול להיות מתויג עם 125 למעקב radioisotope. בדוגמא שנבחרה, הנוגדנים מזהה הידבקות אינטר מולקולה 1 (ICAM-1), חלבון לידי ביטוי על פני השטח של אפיתל במערכת העיכול (וגם אחרים) תאים, אשר הוכח כדי להקל תאיים וo תחבורת transcellular<html> ספקים ו סמים ומטעניהם 21. המטען הוא אלפא Galactosidase (α-Gal), אנזים טיפולי המשמש לטיפול במחלת פברי, הפרעת אחסון lysosomal גנטי 22. NCS המצופה, של כ -200 ננומטר בגודלם, מתווספים לתא apical מעל monolayer התא וטופחו על 37 מעלות צלזיוס למשך תקופות משתנות של זמן, שלאחריו 125 אני בNCS ניתן לאתרם קשור לmonolayer ו / או התא מועבר לתא basolateral מתחת לתאים. קביעה נוספות של 125 אני חופשי מאפשרת חיסור של השבר והערכה המושפל תחבורת NC המצופה. המנגנון של תחבורה מוערך יותר על ידי בחינת שינויים במחסום החדירות הנוגעים לתוואי paracellular, באמצעות הפרמטרים שתוארו לעיל, תוך הובלת transcellular נקבעת על ידי בחינת שינויים בתחבורה כאשר ויסות מסלולים של אנדוציטוזה וtranscytosis. ontent &quot;&gt; שיטות אלה מספקים מידע רב ערך לגבי דגמי מחסום סלולארי, במידה ושיעור ההובלה של מערכת אספקת סמים, ואת המנגנון של תחבורה כזה, לחלוטין ומאפשר הערכה של הפוטנציאל עבור משלוח סמים על פני מחסומים סלולריים.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Transwell inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), 1x</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-37TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125Iodine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ033H002MC</td>
			<td>Radioactive hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Equitech Bio</td>
			<td>BAH-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulin G (IgG)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>015-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)</td>
			<td>Marlin 1987</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Galactosidase, from green coffee beans</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8507-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC latex beads, 100 nm</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>17150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>234729-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA433-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-27151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monodansylcadaverine (MDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wortmannin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Wizard2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt-ohm meter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEER electrodes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>STX100</td>
			<td>Electrodes available for different well-plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Light Scattering (DLS)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nano-ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers

ספקי משנה מיקרומטר (nanocarriers; NCS) לשפר את היעילות של תרופות על ידי שיפור מסיסות, יציבות, זמן מחזור, מיקוד, ושחרורו. בנוסף, חוצים מחסומים סלולריים בגוף הוא קריטי עבור שני המשלוח האוראלי של NCS הטיפולי למחזור הדם והתחבורה מהדם לרקמות, שבו יש צורך בהתערבות. תחבורת NC פני מחסומים סלולריים מושגת על ידי: מסלול paracellular (i), באמצעות שיבוש זמני של צמתים שמשתלבים תאים סמוכים, או (ii) את מסלול transcellular, שבו חומרים הם הפנימו על ידי אנדוציטוזה, מועבר על פני גוף התא, ומופרש על פני התא ההפוך (transyctosis). משלוח פני מחסומים סלולריים ניתן להקל על ידי צימוד הרפוי או הספקים שלהם עם סוכני מיקוד שלהיקשר באופן ספציפי לסמנים על פני קרום תא המעורב בהובלה. כאן, אנו מספקים שיטות למדידת WHI המידה ומנגנון של תחבורת NC על פני מחסום תא מודל,פרק מורכב מmonolayer של תאי האפיתל במערכת העיכול (GI) גדל על קרום נקבובי נמצא בכנס transwell. כינונה של מחסום חדירות אושר על ידי מדידת התנגדות חשמלית transepithelial (Teer), תחבורת transepithelial של חומר שליטה, וimmunostaining של צמתים הדוקים. כדוגמא, ~ 200 NCS פולימר ננומטר משמשים, אשר נושא מטען טיפולי והם מצופים בנוגדן שמכוון הקובע על פני קרום תא. הנוגדנים או המטען טיפולי מתויג עם 125 למעקב radioisotope וNCS שכותרתו מתווספים לחדר העליון מעל monolayer התא לתקופות שונות של זמן. NCS הקשורים לתאים ו / או מועברים לתא הבסיסי ניתן לאתרם. מדידה של 125 אני חופשי מאפשרת חיסור של השבר המושפל. מסלול paracellular נבחנים על ידי קביעת שינויים אפשריים הנגרמים על ידי תחבורת NC לפרמטרי המחסום שתוארו לעיל. i תחבורת Transcellulars נקבע על ידי עסק בהשפעה של ויסות מסלולי אנדוציטוזה וtranscytosis.

כאימות של מודל התא שלנו ללמוד תחבורת transepithelial של NCS הממוקד, איור 2 מראה כי קאקו-2 monolayers תא מצופה בצפיפות של 1.5 × 10 5 תאים / 2 סנטימטר הגיעה מפגש ~ יום 12 ושמר עד יום 18 יושרת monolayer, מסומן על ידי (איור 2 א) Teer. זו קבלה תוקף על ידי הנוכחות של צמתים הדוקי?...

Watch this Scientific Journal Video about Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers at JoVE.com

Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

יישומים טיפוליים רבים דורשים הובלה בטוחה ויעילה של נשאי תרופות והמטענים שלהם על פני מחסומי תאים שבגוף. מאמר זה מתאר התאמה של שיטות הוקמו על מנת להעריך את השיעור ומנגנון של תחבורה של nanocarriers סמים (NCS) על פני מחסומים סלולריים, כגון במערכת העיכול (GI) אפיתל.

מודלים ושיטות להערכת תחבורה של ליפידיות פני מחסומים נייד

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

models-methods-to-evaluate-transport-drug-delivery-systems-across

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Pharmacology

Bioengineering

Unit 1

Pharmacokinetics

SCIENTISTS IN ACTION

46.0K Views.  University of Maryland.  יישומים טיפוליים רבים דורשים הובלה בטוחה ויעילה של נשאי תרופות והמטענים שלהם על פני מחסומי תאים שבגוף. מאמר זה מתאר התאמה של שיטות הוקמו על מנת להעריך את השיעור ומנגנון של תחבורה של nanocarriers סמים (NCS) על פני מחסומים סלולריים, כגון במערכת העיכו...

Video: Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

קביעת תעריף הובלת xenobiotics ו ננו מעבר לשליה באמצעות<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; דגם זלוף שליה אנושי

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

במבחנה חלחול של FITC טעון Ferritins מעבר מכשול עכברוש דם-מוח: מודל לחקר משלוח מולקולות Nanoformulated

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

יישומי ייצור משלוח סמים של חלקיקי משי

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

ניסויי ו אלמנטים סופיים פרוטוקול לחקר התחבורה של מומסים ניטראליים והואשמו ברחבי Articular סחוס

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Creating a Structurally Realistic Finite Element Geometric Model of a Cardiomyocyte to Study the Role of Cellular Architecture in Cardiomyocyte Systems Biology

With the advent of three-dimensional (3D) imaging technologies such as electron tomography, serial-block-face scanning electron microscopy and confocal microscopy, the scientific community has unprecedented access to large datasets at sub-micrometer resolution that characterize the architectural remodeling that accompanies changes in cardiomyocyte function in health and disease. However, these datasets have been under-utilized for&#160;investigating the role of cellular architecture remodeling in cardiomyocyte function. The purpose of this protocol is to outline how to create an accurate finite element model of a cardiomyocyte using high resolution electron microscopy and confocal microscopy images. A detailed and accurate model of cellular architecture has significant potential to provide new insights into cardiomyocyte biology, more than experiments alone can garner. The power of this method lies in its ability to computationally fuse information from two disparate imaging modalities of cardiomyocyte ultrastructure to develop one unified and detailed model of the cardiomyocyte. This protocol outlines steps to integrate electron tomography and confocal microscopy images of adult male Wistar (name for a specific breed of albino rat) rat cardiomyocytes to develop a half-sarcomere finite element model of the cardiomyocyte. The procedure generates a 3D finite element model that contains an accurate, high-resolution depiction (on the order of ~35 nm) of the distribution of mitochondria, myofibrils and ryanodine receptor clusters that release the necessary calcium for cardiomyocyte contraction from the sarcoplasmic reticular network (SR) into the myofibril and cytosolic compartment. The model generated here as an illustration does not incorporate details of the transverse-tubule architecture or the sarcoplasmic reticular network and is therefore a minimal model of the cardiomyocyte. Nevertheless, the model can already be applied in simulation-based investigations into the role of cell structure in calcium signaling and mitochondrial bioenergetics, which is illustrated and discussed using two case studies that are presented following the detailed protocol.

This protocol outlines a novel method to create a spatially detailed finite element model of the intracellular architecture of cardiomyocytes from electron microscopy and confocal microscopy images. The power of this spatially detailed model is demonstrated using case studies in calcium signaling and bioenergetics.

יצירת מודל גיאומטרי מבנית מציאותי סופיים של Cardiomyocyte ללמוד את התפקיד של אדריכלות הסלולר Cardiomyocyte במערכות ביולוגיות

With the advent of three-dimensional (3D) imaging technologies such as electron tomography, serial-block-face scanning electron microscopy and confocal ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

Functionalization פני השטח של חלקיקי וירוס הפטיטיס E בשיטות כימיות ההטיה

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

הערכה מקיפה של היעילות והבטיחות של משלוח סמים, ממוקדות השליה באמצעות שלוש שיטות משלימות

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

הדחקת שעתוק גנים על ידי ניתוב מחדש מכונות הסלולר עם המגבילים Epigenetic כימי

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

ניתוח תלת-מימד של תגובות מרובות-סלולר לקבוצת מעברי כימוסטנט

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...