Este trabajo fue apoyado por una beca de investigación del Instituto Médico Howard Hughes y de la Fundación Nacional de Ciencias para RG, y los fondos otorgados a SM por los Institutos Nacionales de Salud (Grant R01-HL98416) y la Asociación Americana del Corazón (Grant 09BGIA2450014).

1. El cultivo de una monocapa de células en Transwell inserciones <ol><li> En un nivel de bioseguridad 2 células campana de cultivo estéril, coloque 0,8 mm de poro PET Transwell inserciones en una placa de 24 pocillos (4 pozos por condición, para la significación estadística) con fórceps. Todos los materiales que entran en la campana deben ser esterilizadas con etanol. </li></ol> Nota: El tamaño de poro del filtro tiene que ser seleccionado de acuerdo con el tamaño medio de la NC utilizado, para permitir el transporte a través de la membrana. Además, para obtener resultados estadísticamente significativos, cada condición experimental requiere un mínimo de cuatro repeticiones (pozos) dentro del mismo experimento, y un mínimo de 3 experimentos independientes. <ol start="2"><li> Preparar medio de cultivo celular que contiene medio DMEM suplementado con 4,5 g / L de glucosa, suero bovino fetal al 15%, y 1% pen-strep, y el calor a 37 ° C en un baño de agua. </li><li> Diluir adenocarcinoma colorrectal epitelial humana (Caco-2) células en medio celular y el lugar200-400 l de la solución de células en el (apical) cámara superior del inserto Transwell, a una densidad de 1,5 x 10 5 células / cm 2. Llene el (basolateral) cámara baja con 700 a 900 l de medio celular. </li><li> Células de cultivo a 37 ° C, 5% de CO 2, y 95% de humedad durante 16-21 días, reemplazando el medio en la cámara superior e inferior, cada 3-4 días, utilizando los volúmenes indicados en el paso 1.3. Reemplazar medio en el orden siguiente para mantener la presión por encima de (en vez de debajo) de la monocapa de células: Aspirar el medio desde la cámara inferior, aspirar el medio de la cámara superior, llenar la cámara superior con medio fresco, y llenar la cámara inferior con medio fresco. </li></ol> 2. Validación de la GI epitelial Permeabilidad Barrera Usando resistencia eléctrica transepitelial (TEER) y La inmunotinción de uniones estrechas <ol><li> Para el almacenamiento a corto plazo (menos de 2 semanas), se sumergen los electrodos en una solución STX100 electrolitoción (0,1-0,15 M KCl o NaCl). Conectar el cable del electrodo al electrodo de puerto en el metro EVOM voltios-ohmios de modo que el sistema es internamente en cortocircuito y la simetría del electrodo se mantiene. Para el almacenamiento a largo plazo, enjuagar con dH 2 O y almacenar en una condición seco y oscuro. </li><li> Para esterilizar los electrodos, se sumergen en etanol durante 15 minutos y dejar secar al aire durante 15 segundos. Alternativamente, los electrodos pueden ser almacenados en una campana de UV. Enjuagar los electrodos en una solución estéril de electrolito (solución salina tampón de fosfato, PBS) o solución M de KCl o NaCl 0,1-0,15, antes de cada medición de la resistencia. </li><li> Con el medidor de voltios-ohmios establece en el ajuste de la resistencia, colocar verticalmente electrodos en un pozo que contiene el inserto Transwell, con el electrodo corto en la cámara superior y el largo electrodo en la cámara inferior de tocar la parte inferior del pozo. Una vez que la lectura se estabilice EVOM, registre el valor de la resistencia (dado en ohmios; Ω) para cada pozo. </li><li> Calcular la resistividad (resistance normalizó a la zona; Ω × 2 cm) de las muestras de restar la resistencia de fondo (TEER de insertos transwell sin células) y multiplicando por área de superficie de la membrana. Los valores de resistividad son más a menudo en la literatura. (Véase el debate) </li><li> Repetir las mediciones cada 1-2 días hasta que la TEER valores de aumento de hasta un máximo y meseta, indicando la formación de una barrera de permeabilidad, que típicamente toma de 2-3 semanas desde el momento de Platting celular. Valores y el tiempo necesario para lograr la integridad de la barrera Meseta TEER pueden variar en función del número de pases celulares. </li><li> Para verificar la presencia de uniones estrechas en monocapas de células con alta TEER (igual o por encima del valor umbral para la formación de la barrera), fijar las células por incubación con frío 2% de paraformaldehído durante 15 min. A continuación, lavar las células con PBS y se incuban durante 30 min a temperatura ambiente con 1 mg / ml de anti-ocludina. Lavar las células de nuevo con PBS y se incuban durante 30 min a temperatura ambiente con 7,5 g / ml fanticuerpos secundarios luorescently marcados. Utilice pozos con bajo TEER como un control negativo para la formación de la barrera. </li></ol> Nota: Como sustituto para el anti-ocludina, se pueden usar anticuerpos frente a proteínas de unión estrecha alternativos. <ol start="7"><li> Escindir con cuidado la membrana de filtro en la que se adjunta la monocapa fijo, y montar en portaobjetos para formación de imágenes utilizando epifluorescencia o microscopía confocal. </li></ol> 3. Evaluar Transepitelial Transporte de Portadores focalizados <ol><li> Marcar el anticuerpo (anticuerpo de ratón monoclonal contra ICAM-1, anti-ICAM, en este ejemplo) que apunta con 125 I, como se ha descrito previamente 7. Utilice ensayo de Bradford para estimar la concentración de proteínas y un contador gamma para determinar 125I contenido en el anticuerpo, a continuación, calcular la actividad específica en cuentas por minuto (CPM) / mg de anticuerpo marcado. </li></ol> Nota: Para el control de la especificidad, returba el procedimiento mediante el etiquetado de IgG de ratón, que se utiliza para preparar los CN recubiertos no dirigidas. Para estudiar el transporte de una carga terapéutica, repita el procedimiento de etiquetado de la carga, por ejemplo, alfa-galactosidasa (α-Gal) en este ejemplo. Las alternativas pueden ser utilizados para el agente de dirección, el control no específico, o de carga terapéutica. Los métodos alternativos también pueden ser utilizados para etiquetar compuestos y estimar la concentración de los homólogos marcados. <ol start="2"><li> Acoplar el marcado objetivo de anticuerpos (anti-ICAM en nuestro ejemplo) a la superficie de los Comités Nacionales. En este ejemplo, incubar nanobeads de poliestireno (diámetro 100 nm) durante 1 hora a temperatura ambiente con 125 I-anti-ICAM para permitir la adsorción superficial, tal como se describe 7. </li></ol> Nota: Para el control no específica utilizar 125I-IgG. Para rastrear el transporte de una carga, utilice una combinación de focalización de anticuerpos y 125 de carga que llevan la etiqueta (α-Gal en nuestro ejemplo). <ol start="3"><li> Se centrifuga a 13.000 g durante 3 min y retirar las contrapartes no-revestidos en el sobrenadante por aspiración. Resuspender el sedimento que contiene los CN recubiertos usando 1% de albúmina de suero bovino (BSA) en PBS mediante pipeteo, y se somete a ultrasonidos a baja potencia para interrumpir agregados de partículas potenciales (20-30 breves pulsos). </li><li> Para la caracterización de Carolina del Norte, medir el tamaño, la polidispersidad, y ζ-potencial de partículas recubiertas utilizando dispersión dinámica de luz (siguiendo las instrucciones del proveedor), y cuantificar el número de marcado con 125I de metas de moléculas de anticuerpo (por ejemplo anti-ICAM) en la superficie de la partícula usando un contador gamma. </li></ol> Nota: Estos métodos se pueden repetir para las contrapartes no específicas y terapéuticas. El tamaño de partículas recubiertas oscila alrededor de 200 nm. <ol start="5"><li> Añadir 125 CN I-anticuerpo (por ejemplo, 125 I-anti-ICAM NCs; 56 nCi / ml) a la cámara superior por encima de confluentes Caco-2 monocapas con la TEER y# 8805; 350 Ω × 2 cm (ver Discusión) sobre el fondo (16 a 21 días después de la siembra). Incubar a 37 ° C durante uno o más de tiempo deseado intervalos. Mida TEER (Sección 2.3), antes y después de la incubación para evaluar los efectos de los Comités Nacionales sobre la permeabilidad de la barrera. </li></ol> Nota: Este procedimiento se puede repetir para las contrapartes no específicas y terapéuticas. <ol start="6"><li> Recoger medio de las cámaras superior e inferior y lavar una vez con 0,5 ml de DMEM a 37 ° C (cámara superior) o 1 ml dH 2 O (cámara baja). Recoger los lavados para la medición del contenido total de radioisótopo utilizando un contador gamma. </li><li> Para la medición de la fracción de células, escindir el filtro permeable, por ejemplo, utilizando una hoja de afeitar para cortar alrededor de los bordes, y se incuba en un tubo contador gamma con 1% de Triton X-100 durante 10 min (para liberar el contenido de celdas), antes de la medición de células total asociada a la radiactividad. </li><li> Para medir 125 me rearrendado de los CN durante el transporte o debido a la degradación potencial, primera mezcla 300 l de muestra (de las fracciones superiores, inferiores o celulares) con 700 l de BSA al 3% en PBS y 200 l de ácido tricloroacético (TCA). Incubar a temperatura ambiente durante 15 min. Mientras tanto este tiempo, medir la radiactividad total de esta muestra en un contador gamma. </li><li> Centrifugar las muestras de TCA en 3000 xg durante 5 minutos para separar la proteína intacta (gránulo) de la proteína degradada o 125I fracción (sobrenadante). Cuantificar la radiactividad de la fracción libre de 125I y restar este valor de la radioactividad total medida antes de la centrifugación. Esto proporcionará la cantidad de proteína marcada que no se degrada. </li></ol> 4. Mecanismo de Transepitelial Transporte de Nanocarriers focalizados <ol><li> Etiqueta albúmina con 125I como se describe en la Sección 3.1 y se informó anteriormente 7. </li></ol> Nota: La albúmina es un 66,5kDa de proteínas y, por lo tanto, una sustancia relativamente grande. Aunque un control válido para el transporte pasivo de objetos más grandes (por ejemplo, 200 nm CN usado aquí), que debe ser sustituido con moléculas de trazador inerte más pequeñas cuando se estudia el transporte de portadores de fármacos más pequeños (véase la discusión). <ol start="2"><li> Para evaluar el transporte paracelular utilizando albúmina de fugas paracelular, de cultivo de Caco-2 monocapas sobre Transwell inserciones como se describió anteriormente. </li><li> Para el medio de cámara superior por encima de la monocapa de células, añadir ya sea solo 125 I-albúmina (control negativo que muestra el nivel basal de fugas), o 125 CN anticuerpos dirigidos I-albúmina y no radiomarcados (como se describe en la Sección 3.5). Se incuba a 37 ° C para el intervalo de tiempo seleccionado (s), que debe coincidir con los examinados al probar el transporte NC. Mida TEER (Sección 2.3) antes, durante y después de la incubación, se recogen todas las fracciones para el total de 125 I y 125 I gratuitas mediciones como se indica. en la Sección 3 Nota: adición concomitante de 125 de control de la I-albúmina y no radiomarcado CN IgG puede ser utilizado como un control. </li><li> Como control positivo para la apertura de las uniones intercelulares, añadir medios de células que contiene 5 mM de H 2 O 2 a las cámaras superior e inferior de la pieza de inserción Transwell, y se incuba a 37 ° C durante 30 min. Luego, mida TEER (Sección 2.3) y añadir 125 I-albúmina a la cámara superior de los intervalos de tiempo seleccionados. Medir la TEER en varios puntos de tiempo a lo largo de la incubación para identificar la TEER decaimiento valor causada por H 2 O 2 inducida por la apertura de las uniones de las células. </li><li> En experimentos paralelos, evaluar el transporte transcelular, también llamado transcitosis, de 125 corresponsales nacionales orientados I incubando confluentes Caco-2 monocapas, ya sea con 50 monodansylcadaverine M (MDC; inhibidor de la endocitosis mediada por clatrina), 1 mg / ml filipin (inhibidor de caveolar endocitosis mediada), Wortmann 0,5 Men (inhibidor de la fosfatidilinositol 3 quinasa [PI3K], que participan en macropinocitosis), o 20 mM [5 - (N-etil-N-isopropil) amilorida] (EIPA, inhibidor de macropinocitosis y endocitosis mediada por CAM 15). </li></ol> Nota: 125 I-IgG de los CN y 125 I-albúmina pueden ser utilizados como controles negativos para el efecto de estos inhibidores, y otros métodos (por ejemplo, técnicas de siRNA) pueden proporcionar una inhibición más selectiva. <ol start="6"><li> Medir la TEER (Sección 2.3) antes, durante, y después de la incubación de las células con inhibidores y materiales radiomarcados, como un control adicional para el efecto de los inhibidores de la permeabilidad monocapa. </li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Usando los métodos discutidos más arriba, un modelo celular para el estudio de transporte de los CN dirigidos a través de barreras celulares se puede establecer, por ejemplo, el ejemplo proporcionado para Caco-2 células epiteliales, lo cual es relevante para la evaluación de transporte desde el lumen GI a la sangre en el caso de los sistemas de administración de fármacos orales. El cultivo de las monocapas de células epiteliales GI en insertos Transwell activar la medición de la TEER y fluorescencia inmunotinci...

Barreras celulares en el cuerpo actúan como una puerta de enlace entre el ambiente externo y compartimentos internos. Este es el caso para el revestimiento epitelial que separa la superficie expuesta externamente del tracto gastrointestinal (GI) y el torrente sanguíneo 1-3. Barreras celulares también representan la interfaz entre el torrente sanguíneo y el parénquima y componentes celulares de los tejidos y órganos. Este es el caso para el revestimiento endotelial interior en los vasos sanguíneos, tales como la barrera sangre-de pulmón, la barrera sangre-cerebro, etc 1 La capacidad de atravesar estas barreras celulares en el cuerpo es crucial para la entrega eficaz de los agentes terapéuticos y de diagnóstico en la circulación y tejidos / órganos donde se necesita la intervención. Para mejorar el suministro de agentes terapéuticos o de diagnóstico, estos compuestos se pueden cargar en nanovehículos sub-micrométricos (NCS). Estos vehículos de administración de fármacos se pueden formular con una variedad dequímicas y estructuras para optimizar la solubilidad del fármaco, la protección, la farmacocinética, la liberación y el metabolismo de 4,5. CN también se puede funcionalizar con afinidad o restos de direccionamiento (por ejemplo, anticuerpos, péptidos, azúcares aptámeros, etc) para facilitar la adhesión a las áreas del cuerpo donde se requiere la acción terapéutica 2,6. Focalización de los Comités Nacionales de los determinantes expresados ​​en la superficie de las barreras celulares puede facilitar aún más el transporte en y / oa través de estos forros de 2,6. El papel de transportar selectivamente sustancias entre dos entornos requiere ciertas características únicas entre las capas de células. Una de estas características es la polaridad celular, por lo que la membrana apical dirigida a la luz de las cavidades varía desde la membrana basolateral orientada hacia el intersticio de tejido, con respecto a la morfología de la membrana y la composición de los lípidos, transportistas y receptores 2. Otra característica implica junctio intercelularns conectan células adyacentes. La regulación de las proteínas que forman las uniones estrechas, moléculas de adhesión sobre todo de unión (mermeladas), occludins y claudins, modulan la función de barrera para permitir o no el transporte de sustancias entre las células, conocidas como el transporte paracelular, que permite el paso de materiales desde la luz a el espacio basolateral 3. La unión de muchos elementos naturales y sintéticos (leucocitos, moléculas, partículas y sistemas de administración de fármacos) a barreras celulares en el cuerpo puede inducir la apertura de células-unión, que puede ser transitoria y relativamente inocuo o más prolongada y, por lo tanto, peligroso con el acceso de sustancias no deseadas a través de la barrera 2,5,7-9. Por consiguiente, esta vía se puede evaluar mediante la medición de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) y la difusión paracelular pasiva de las moléculas (en este documento denominado fugas paracelular), por lo que la disminución de la resistencia a una corriente eléctrica o el aumento de las fugas paracelular de un INEcompuesto rt en el espacio basolateral indican apertura de los cruces de células, respectivamente 5,10,11. Para complementar estos métodos, cualquiera de las proteínas de unión estrecha enumerados anteriormente se puede teñir para evaluar su integridad, donde la tinción debe aparecer concentrada en las fronteras de célula-célula todo alrededor de la periferia de la célula 5,10,12. Alternativamente, los sistemas de administración de fármacos que se dirigen a los determinantes específicos de la superficie celular, tales como los asociados a depresiones revestidas de clatrina o invaginaciones de membrana forma de matraz llamadas caveolas, pueden desencadenar la captación vesicular en células por endocitosis, proporcionando una vía para la administración de fármacos a los compartimentos intracelulares 5, 13. Además, la endocitosis puede conducir a tráfico de vesículas de todo el cuerpo de la célula para la liberación en el lado basolateral, un fenómeno conocido como transyctosis, o el transporte transcelular 14. Por lo tanto, el conocimiento de la cinética y el mecanismo de endocitosis puede ser utilizado para explotar un intracelularND administración de fármacos transcelular, que ofrece un modo relativamente seguro y controlado de entrega en comparación con la ruta paracelular. (Endocitosis, tales como el caso de la molécula de adhesión celular (CAM)-mediada) El mecanismo de la endocitosis se puede evaluar con moduladores de la vía clásica (clatrina y la endocitosis mediada por caveolina, y macropinocitosis) o rutas no clásicos 5,13,15 . Considerando que el tráfico intracelular se estudia a menudo en pozos o cubreobjetos estándar, la ausencia de un compartimento basolateral se opone a la polarización celular y la capacidad de estudiar el transporte a través de capas de células. Para superar este obstáculo, el transporte a través de monocapas de células se ha estudiado durante mucho tiempo el uso de insertos Transwell 10,11,16,17, que consisten en una cámara superior (apical), una membrana permeable poroso donde las células se unen y forman una monocapa apretado, y una menor (basolateral) cámara (Figura 1). En esta configuración, el transporte se puede medir en el-apical a basolateral dirección mediante la administración de un tratamiento en la cámara superior, después del transporte a través de la monocapa de células y la membrana porosa subyacente, y finalmente recoger el medio en la cámara inferior para la cuantificación de material transportado. Transporte en la dirección basolateral a apical también se puede medir por la administración inicial a la cámara inferior y la recogida posterior de la cámara superior 5,10,12,16. Existen diversas técnicas para verificar la formación de barrera de permeabilidad en los cultivos polarizados, incluyendo la TEER y ensayos de transporte paracelular, como se describió anteriormente. Además, el filtro permeable en el que se cultivan las células se puede quitar para análisis de imágenes (por ejemplo, por fluorescencia, confocal, microscopía electrónica), como una validación adicional del modelo de monocapa celular, así como el mecanismo de transporte. La selección del tipo de membrana, que está disponible en diferentes tamaños de poros, materiales, y áreas de superficie, depende de varios factors, tales como el tamaño de las sustancias u objetos a ser transportados, tipo de célula, y el método de formación de imágenes 16,18-20. Transwell inserciones también facilitan la cuantificación controlada y precisa de transporte en comparación con los sistemas de mamíferos complejos, como volúmenes de las cámaras y el área de superficie de la célula son constantes conocidas. Mientras que se eliminan muchos factores involucrados en la entrega en vivo, incluyendo la presencia de moco intestinal, tensión de cizallamiento, enzimas digestivas, las células inmunes, etc, esta pequeña escala modelo in vitro proporciona información preliminar útil en materia de transporte. Como ejemplo para ilustrar la adaptación de estos métodos para estudiar el transporte NC a través de barreras celulares 10,11,16,17, describimos aquí un caso en que el potencial de transporte NC a través del epitelio GI fue modelado mediante la evaluación de paso de un modelo de administración de fármacos sistema a través de una monocapa de células Caco-(2) células de adenocarcinoma colorrectal epitelial humana. Para este propósito, Cells se cultivaron en insertos Transwell, en un 0,8 micras de poro de tereftalato de polietileno (PET) filtro (6,4 mm de diámetro), que es transparente y puede ser utilizado para obtener imágenes de microscopía. El estado de la barrera de permeabilidad se valida mediante la medición de la TEER, el transporte apical a basolateral de una sustancia de control, la albúmina, y la visualización microscopía de fluorescencia de un elemento de las uniones estrechas, la proteína ocludina. Se utiliza un modelo de polímero específica Carolina del Norte, que consta de 100 nm, las nanopartículas de poliestireno no biodegradables. CN están recubiertas por adsorción superficial con un anticuerpo dirigido solo o una combinación de un anticuerpo dirigido y una carga terapéutica, donde cualquiera de los componentes puede ser marcado con 125I para el rastreo de radioisótopos. En el ejemplo seleccionado, el anticuerpo reconoce molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1), una proteína expresada en la superficie de células epiteliales GI (y otros), células que se ha demostrado para facilitar intracelular y transcelular o transporte<html> portadores de fármacos f y sus cargas 21. La carga es la alfa-galactosidasa (α-Gal), una enzima terapéutica utilizada para el tratamiento de la enfermedad de Fabry, una enfermedad de depósito lisosomal genética 22. Los CN recubiertos, de alrededor de 200 nm de tamaño, se añaden a la cámara apical sobre la monocapa de células y se incubaron a 37 ° C durante períodos variables de tiempo, después de lo cual 125 I en los CN puede ser detectada asociada a la monocapa de células y / o transportados a la cámara basolateral por debajo de las células. Determinación adicional de free 125 I permite la sustracción de la fracción degradada y la estimación de los transportes recubierto NC. El mecanismo de transporte se evaluó adicionalmente mediante el examen de los cambios en la permeabilidad de la barrera perteneciente a la ruta paracelular, a través de los parámetros descritos anteriormente, mientras que el transporte transcelular se determina mediante el examen de los cambios en el transporte cuando la modulación de las vías de endocitosis y transcitosis. ontenido &quot;&gt; Estos métodos proporcionan información valiosa acerca de los modelos de barrera celular, el alcance y la velocidad de transporte de un sistema de administración de medicamentos, y el mecanismo de este tipo de transporte, lo que en conjunto la evaluación de las posibilidades de la administración de fármacos a través de barreras celulares.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Transwell inserts</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>353095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle&#39;s Medium (DMEM), 1x</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>35-015-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human epithelial colorectal adenocarcinoma (Caco-2) cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-37TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>125Iodine</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEZ033H002MC</td>
			<td>Radioactive hazard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Saline (PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Equitech Bio</td>
			<td>BAH-66</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Immunoglobulin G (IgG)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>015-000-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse monoclonal antibodies to human ICAM-1 (anti-ICAM)</td>
			<td>Marlin 1987</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Galactosidase, from green coffee beans</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G8507-25UN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC latex beads, 100 nm</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>17150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>234729-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SA433-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin antibody (Y-12), goat polyclonal anti-human</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>Sc-27151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monodansylcadaverine (MDC)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filipin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F9765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-(N-ethyl-N-isopropyl) amiloride (EIPA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wortmannin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gamma counter</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>Wizard2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volt-ohm meter</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>EVOM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEER electrodes</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>STX100</td>
			<td>Electrodes available for different well-plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Light Scattering (DLS)</td>
			<td>Malvern</td>
			<td>Nano-ZS90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

models and methods to evaluate transport of drug delivery systems across cellular barriers

Portadores Sub-micrométricas (Nanocarriers; CN) mejorar la eficacia de los medicamentos mediante la mejora de la solubilidad, estabilidad, tiempo de circulación, la orientación, y la liberación. Además, atravesar las barreras celulares en el cuerpo es crucial tanto para la administración oral de los CN terapéuticos en la circulación y el transporte de la sangre a los tejidos, donde se necesita la intervención. NC transporte a través de barreras celulares se logra mediante: (i) la ruta paracelular, a través de la interrupción transitoria de las uniones que se entrelazan las células adyacentes, o (ii) la ruta transcelular, donde los materiales son internalizados por endocitosis, transportados a través del cuerpo celular, y secretada en la superficie de la célula opuesta (transyctosis). Entrega a través de barreras celulares puede facilitarse mediante el acoplamiento de la terapéutica o de sus portadores con agentes de direccionamiento que se unen específicamente a los marcadores de la superficie celular implicadas en el transporte. Aquí, ofrecemos métodos para medir el alcance y el mecanismo de transporte de Carolina del Norte a través de una barrera de células modelo, WHICH consta de una monocapa de gastrointestinal (GI) las células epiteliales cultivadas en una membrana porosa situada en un inserto Transwell. La formación de una barrera de permeabilidad se confirmó mediante la medición de la resistencia transepitelial eléctrica (TEER), el transporte transepitelial de una sustancia de control, y la inmunotinción de las uniones estrechas. Como un ejemplo, se utilizan 200 ~ CN polímero nm, y que llevan una carga terapéutico y están recubiertos con un anticuerpo que se dirige a un determinante de la superficie celular. El anticuerpo terapéutico o de carga se marca con 125I para el rastreo de radioisótopos y los CN marcados se añaden a la cámara superior sobre la monocapa de células durante períodos variables de tiempo. NCs asociados a las células y / o transportados a la cámara subyacente puede ser detectado. Medición de free 125 I permite la sustracción de la fracción de degradado. La ruta paracelular se evalúa mediante la determinación de cambios potenciales causados ​​por el transporte del NC para los parámetros de barrera descritas anteriormente. Transcelular i transportes determinar examinando el efecto de la modulación de la endocitosis y transcitosis vías.

Como validación de nuestro modelo celular para estudiar el transporte transepitelial de los CN dirigidos, la Figura 2 muestra que Caco-2 monocapas de células en placas a una densidad de 1,5 × 10 5 células / cm 2 alcanzado la confluencia ~ Día 12 y se mantienen la integridad de la monocapa hasta el día 18, indicado por la TEER (Figura 2A). Este fue validado por la presencia de uniones estrechas ocludina-positivo (Figura 2B) en monocapas con al...

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Models and Methods to Evaluate Transport of Drug Delivery Systems Across Cellular Barriers

Muchas aplicaciones terapéuticas requieren un transporte seguro y eficiente de los portadores de fármacos y sus cargas a través de barreras celulares en el cuerpo. En este artículo se describe una adaptación de los métodos establecidos para evaluar la tasa y el mecanismo de transporte de nanovehículos drogas (NCS) a través de barreras celulares, tales como el tracto gastrointestinal (GI) epitelio.

Modelos y métodos para evaluar el transporte de Drug Delivery Systems a través de barreras celulares

Sub-micrometer carriers (nanocarriers; NCs) enhance efficacy of drugs by improving solubility, stability, circulation time, targeting, and release. ...

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Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Determinación de la velocidad de transporte de xenobióticos y Nanomateriales través de la placenta mediante el<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo perfusión placentaria humana

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Investigación

Bioingeniería

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting 3D cellular construct can often be more relevant to studying the molecular events and cell-cell interactions than similar experiments studied in 2D. To create effective 3D cultures with high cell viability throughout the scaffold the culture conditions such as oxygen and pH need to be carefully controlled as gradients in analyte concentration can exist throughout the 3D construct. Here we describe the methods of preparing biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors and their incorporation into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds along with their subsequent preparation for the culture of mammalian cells. The pH responsive scaffolds can be used as tools to determine microenvironmental pH within a 3D cellular construct. Furthermore, we detail the delivery of pH responsive nanosensors to the intracellular environment of mammalian cells whose growth was supported by electrospun PLGA scaffolds. The cytoplasmic location of the pH responsive nanosensors can be utilized to monitor intracellular pH (pHi) during ongoing experimentation.

Biocompatible pH responsive sol-gel nanosensors can be incorporated into poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) electrospun scaffolds. The produced self-reporting scaffolds can be used for in&#160;situ monitoring of microenvironmental conditions whilst culturing cells upon the scaffold. This is beneficial as the 3D cellular construct can be monitored in real-time without disturbing the experiment.

Los andamios de autoinforme para el 3-Dimensional Cultivo Celular

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.

Fabricación y entrega de medicamentos Aplicaciones de seda nanopartículas

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and ...

An Experimental and Finite Element Protocol to Investigate the Transport of Neutral and Charged Solutes across Articular Cartilage

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular cartilage impairs its load-bearing function substantially as it experiences tremendous chemical degradation, i.e. proteoglycan loss and collagen fibril disruption. One promising way to investigate chemical damage mechanisms during OA is to expose the cartilage specimens to an external solute and monitor the diffusion of the molecules. The degree of cartilage damage (i.e. concentration and configuration of essential macromolecules) is associated with collisional energy loss of external solutes while moving across articular cartilage creates different diffusion characteristics compared to healthy cartilage. In this study, we introduce a protocol, which consists of several steps and is based on previously developed experimental micro-Computed Tomography (micro-CT) and finite element modeling. The transport of charged and uncharged iodinated molecules is first recorded using micro-CT, which is followed by applying biphasic-solute and multiphasic finite element models to obtain diffusion coefficients and fixed charge densities across cartilage zones.

We propose a protocol to investigate the transport of charged and uncharged molecules across articular cartilage with the aid of recently developed experimental and numerical methods.

Un experimental y el Protocolo de elementos finitos para investigar el transporte de solutos neutros y cargadas a través de cartílago articular

Osteoarthritis (OA) is a debilitating disease that is associated with degeneration of articular cartilage and subchondral bone. Degeneration of articular ...

Surface Functionalization of Hepatitis E Virus Nanoparticles Using Chemical Conjugation Methods

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of various diseases. This application relies on genetic modification, self-assembly, and cysteine conjugation to fulfill the tumor-targeting application of recombinant VLPs. Compared with genetic modification alone, chemical conjugation of foreign peptides to VLPs offers a significant advantage because it allows a variety of entities, such as synthetic peptides or oligosaccharides, to be conjugated to the surface of VLPs in a modulated and flexible manner without alteration of the VLP assembly.
Here, we demonstrate how to use the hepatitis E virus nanoparticle (HEVNP), a modularized theranostic capsule, as a multifunctional delivery carrier. Functions of HEVNPs include tissue-targeting, imaging, and therapeutic delivery. Based on the well-established structural research of HEVNP, the structurally independent and surface-exposed residues were selected for cysteine replacement as conjugation sites for maleimide-linked chemical groups via thiol-selective linkages. One particular cysteine-modified HEVNP (a Cys replacement of the asparagine at 573 aa (HEVNP-573C)) was conjugated to a breast cancer cell-specific ligand, LXY30 and labeled with near-infrared (NIR) fluorescence dye (Cy5.5), rendering the tumor-targeted HEVNPs as effective diagnostic capsules (LXY30-HEVNP-Cy5.5). Similar engineering strategies can be employed with other macromolecular complexes with well-known atomic structures to explore potential applications in theranostic delivery.

We have engineered the capsid protein of hepatitis E virus as a theranostic nanoparticle (HEVNP). HEVNP self-assembles into a stable icosahedral cage in mucosal delivery. Here, we describe the modification of HEVNPs for tumor targeting by mutating surface-exposed residues to cysteines, which conjugate synthetic ligands that specifically bind tumor cells.

Funcionalización superficial de nanopartículas de Virus de Hepatitis E métodos de conjugación química

Virus-like particles (VLPs) have been used as nanocarriers to display foreign epitopes and/or deliver small molecules in the detection and treatment of ...

Comprehensive Evaluation of the Effectiveness and Safety of Placenta-Targeted Drug Delivery Using Three Complementary Methods

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to the placenta while minimizing fetal and maternal side effects remains challenging. Targeted nanoparticle carriers provide new opportunities to treat placental disorders. We recently demonstrated that a synthetic placental chondroitin sulfate A binding peptide (plCSA-BP) could be used to guide nanoparticles to deliver drugs to the placenta. In this protocol, we describe in detail a system for assessing the efficiency of drug delivery to the placenta by plCSA-BP that employs three separate methods used in combination: in vivo imaging, high-frequency ultrasound (HFUS), and high-performance liquid chromatography (HPLC). Using in vivo imaging, plCSA-BP-guided nanoparticles were visualized in the placentas of live animals, while HFUS and HPLC demonstrated that plCSA-BP-conjugated nanoparticles efficiently and specifically delivered methotrexate to the placenta. Thus, a combination of these methods can be used as an effective tool for the targeted delivery of drugs to the placenta and development of new treatment strategies for several pregnancy complications.

We describe a system that utilizes three methods to evaluate the safety and effectiveness of placenta-targeted drug delivery: in vivo imaging to monitor nanoparticle accumulation, high-frequency ultrasound to monitor placental and fetal development, and HPLC to quantify drug delivery to tissue.

Evaluación integral de la efectividad y seguridad de la entrega de drogas orientada a Placenta utilizando tres métodos complementarios

No effective treatments currently exist for placenta-associated pregnancy complications, and developing strategies for the targeted delivery of drugs to ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Reprimiendo la transcripción genética redirigiendo la maquinaria celular con modificadores químicos de epigenéticas

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

Análisis 3D de las respuestas multicelulares a los degradados Quimioattractant

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

Formulación y caracterización de nanopartículas lipídicas para la administración de genes utilizando una plataforma de mezcla microfluídica

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such as the cornea and conjunctiva. While therapeutic effects and pharmacokinetics of the drugs upon subconjunctival injection have been described in some studies, very few assess the ocular distribution of drugs or drug delivery systems (DDS). The latter is critical for the optimization of intraocular DDS design and drug bioavailability to achieve the desired ocular localization and duration of action (e.g., acute versus. prolonged). This study establishes the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to qualitatively study the ocular distribution of fluorescent liposomes in real-time in live mice after sub-conjunctival injection. Being designed for in vivo visual inspection of tissues at the microscopic level, this is also the first full description of the CLM imaging method to study spatio-temporal distribution of injectables in the eye after subconjunctival injection.

Spatio-Temporal In Vivo Imaging of Ocular Drug Delivery Systems using Fiberoptic Confocal Laser Microendoscopy

We present a protocol for the use of fiberoptic confocal laser microendoscopy (CLM) to non-invasively study the spatio-temporal distribution of liposomes in the eye after subconjunctival injection.

Imágenes espacio-temporales in vivo de sistemas oculares de administración de fármacos mediante microendoscopía láser confocal de fibra óptica

Subconjunctival injection is an attractive route to administer ocular drugs due to easy trans-scleral access that bypasses anterior ocular barriers, such ...