نشكر الدكتور توشيو Terashima من جامعة كوبي، اليابان، لتدريس تقنية جراحة الحنجرة، والدكتور لين Enquist من جامعة برينستون لتوريد PRV-بارثا. وأيد البحث من قبل جائزة الرواد NIH DP1 OD000448 لإريك D. جارفيس وجائزة زمالة أبحاث NSF العليا لغوستافو آرياغا. وتستخدم الأرقام من الأعمال السابقة الفضل بشكل مناسب تحت بلوس وان الوصول المفتوح جميل الترخيص (CC-BY) وفقا لسياسات التحرير في المجلة.

ملاحظة: تم استعراض جميع الإجراءات الحيوانية والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسية واستخدم جامعة ديوك. 1. تخزين الكاذب الفيروسات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نحصل على فيروسات حية (PRV152) من مختبر الدكتور لين Enquist في جامعة برينستون في عيار 1 × 10 9 PFU / م. وقد تم نشر بروتوكول لتوليد فيروس 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة الفيروس في 20 ميكرولتر في أنبوب داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية BSL-2 وتخزينها في -80 درجة مئوية تحت الظروف المناسبة للسلامة الأحيائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد قسامة من PRV مباشرة قبل الحقن. </li></ol> 2. إعداد الجراحية لحقن في العضلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمل التخدير العام عن طريق الحقن العضلي الكيتامين-زيلازين (100 ملغم / كغم من الكيتامين و 10 ملغ / كغ زيلازين) والحفاظ على طائرة التخدير المناسبة باستخدام isofluorane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حماية القرنيات مع مرهم البصريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد رانه موقع الجراحة وفقا لتقنية العقيم بواسطة تقليم الشعر وتعقيم موقع الجراحة مع الدعك بالتناوب من Betadine والكحول 70٪ (الحد الأدنى من 3 دورات). تأكد من استخدام الستائر معقمة لتغطية المناطق الجراحية. للتأكد من الالتزام تقنيات معقمة طوال الإجراءات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق الجلد وتكشف عن العضلات من الفائدة. على سبيل المثال، للوصول إلى عضلة الحنجرة الحلقية الدرقية فمن الضروري أولا إزالة جزء المغطي للعضلة القصية اللامية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم أي العضلات مقطوع مع VetBond نسيج لاصق. </li></ol> 3. حقن PRV في العضلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 10 ميكرولتر NanoFil نظام محقنة مكروية مع حل PRV إذابة طازجة، إرفاق المقاوم للصدأ إبرة الصلب 34 G، وتركيبها بعناية على الجهاز التجسيمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح ببطء الفضاء الميت والتحقق من أن حل يخرج طرف محقنة مكروية. تجاهل السائل كنفايات bioharzard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام microp التجسيميجهاز ositioning تضع بعناية طرف محقنة مكروية في عضلة الفائدة وملء ببطء العضلات حتى تورم طفيف مرئيا. معدل الحقن سوف تختلف تبعا لحجم العضلات وحجم ليتم حقنه. على سبيل المثال، ينبغي بذل خمس حقن 200 NL (1 ميكرولتر الكل) بمعدل 4 NL / ثانية 1 دقيقة بعيدا في نفس الموقع لملء العضلات الحلقية الدرقية. نقل المحقنة إلى العضلات القادمة من الفائدة (على الحلقي الطرجهالي الجانبي في هذه الحالة) وتكرار إجراء الحقن. ثقب فقط كل عضلة مرة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التراجع عن محقنة مكروية بعد خمس دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم كسر في العريضة باستخدام VetBond نسيج لاصق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم الانتهاء من جميع الحقن، وإغلاق الجرح باستخدام VetBond نسيج لاصق. اعتمادا على المبادئ التوجيهية الخاصة بك المحلية institional استخدام الحيواني، الغرز أو مقاطع الجرح يمكن استخدامها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الحيوانات حتى الاستلقاء القصية وتوفير تسكين الألم، والغذاء، والمياه، والرعاية التي تتطلبها ذمبادئ توجيهية لاستخدام الحيوانات لدينا المؤسسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد وقت بقاء تجريبيا (في هذه الحالة، 90 ساعة لتسمية 2 الثانية تأمر الخلايا العصبية القشرية)، التضحية الحيوانية جرعة زائدة بنتوباربيتال ويروي transcardially مع المياه المالحة 0.9٪ تليها 4٪ الفورمالديهايد في 0.1 M PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وبعد إصلاح الدماغ في 4٪ الفورمالديهايد لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryoprotect الدماغ في الفوسفات عازلة تحتوي على 30٪ سكروز لمدة 48 ساعة على الأقل. </li></ol> 4. كشف مناعى من EGFP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع المقاطع في 40 ميكرون على مشراح انزلاق وحفظ المقاطع العائمة إلى 0.1M برنامج تلفزيوني. أقسام أرق، على سبيل المثال 30 ميكرون، ويمكن استخدامها عند تلطيخ أقسام محمولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرواء أقسام لمدة 30 دقيقة في 0.3٪ H 2 O 2 في برنامج تلفزيوني محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع مستضدات غير محددة في الأقسام لمدة 30 دقيقة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.3٪ توين 20 مع مصل الماعز العادي من أدوات VECTASTAIN النخبة (VE عدة). </li><li&gt; احتضان سدت أبواب مقابل 3.5 ساعة في أرنب مكافحة EGFP (1: 1000) في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أقسام ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، ثم احتضان لهم لمدة 1 ساعة في الماعز المضادة للأرنب الضد الثانوية من VE عدة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل ABC من VE عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أقسام ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، ثم الرد عليهم لمدة 1 ساعة في حل ABC من VE عدة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أقسام ثلاث مرات في المخزن الفوسفات لمدة 10 دقيقة، وتطوير لمدة 8 دقائق في المخزن الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4، يحتوي على 0.05٪ DAB (3، 3&#39;-diaminobenzidine) و0.015٪ H 2 O 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقسام جبل على الشرائح SuperFrost زائد ويذوى من خلال سلسلة الكحول متدرج (70٪، 95٪، 100٪ و 100٪ لمدة 5 دقائق لكل منهما). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح المقاطع من خلال اثنين من يغسل زيلين (5 دقائق لكل منهما) وساترة الشرائح مع Permount المتوسطة المتزايدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة الأقسام التي شنت على المجهر. المنتج رد فعل DAB insidه يجب أن تظهر الخلايا البني. يمكن للصور الرقمية يكون لون مقلوب لتسليط الضوء على العمليات الدقيقة. </li></ol> 5. إعداد الجراحية لحقن استشفاف في مناطق الدماغ التي اكتشفها PRV للبحث عن المفقودين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمل التخدير العام عن طريق الحقن العضلي الكيتامين-زيلازين (100 ملغم / كغم من الكيتامين و 10 ملغ / كغ زيلازين) والحفاظ على طائرة التخدير المناسبة باستخدام isofluorane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حماية القرنيات مع مرهم البصريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الرأس في إطار التجسيمي المناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الموقع الجراحي وفقا لتقنية العقيم بواسطة تقليم الشعر وتطهير الموقع مع الدعك بالتناوب من Betadine والكحول 70٪ (الحد الأدنى من 3 دورات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل شق فروة الرأس وسحب الجلد فوق منطقة في الدماغ من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء حج القحف صغير في الإحداثيات التجسيمي المناسبة. على سبيل المثال، الإحداثيات للاتصال laryngeally القشرة الحركية التي حددها PRV البحث عن المفقودين فين الماوس البالغين من 1.2 ملم و 0.2 ملم الوحشي منقاري إلى Bregma. </li></ol> 6. حقن البيروكسيديز ديكستران الأمينات في المخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 7.5٪ الأمينات ديكستران المعقدة البيروكسيديز (BDA) عن طريق إذابة 25 ملغ من BDA (10000 ميغاواط) في 333 ميكرولتر من محلول ملحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل نظام micropipette Nanoject II مع حلا كافيا BDA لحقن المخطط لها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح ببطء الفضاء الميت والتحقق من أن الحل يتم إنهاء غيض micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام جهاز micropositioning التجسيمي خفض بعناية غيض micropipette في منطقة الدماغ من الفائدة وحقن ببطء BDA. ضبط معدل الحقن اعتمادا على حجم المنطقة ليكون المسمى. على سبيل المثال، 12 حقن 4.6 NL يجب أن أدلى تكون على أربعة مواقع مختلفة 0.2 مم وبصرف النظر (اتجاه rostro الذيلية) لتغطية القشرة الحركية ترتبط laryngeally في فئران بالغة. ينبغي تعديل حجم الحقن النهائي وفقا لحجم منطقة الدماغ من الفائدة، مع الأخذ في الاعتبار أن التسمية قد ينتشر من صميم حقن عن طريق الانتشار من خلال أنسجة المخ وعلى طول عمليات الخلايا العصبية المسماة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ختم حج القحف باستخدام الاسمنت الأسنان، وإغلاق الجرح فروة الرأس باستخدام VetBond نسيج لاصق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الحيوانات حتى الاستلقاء القصية وتوفير تسكين الألم، والغذاء، والمياه، والرعاية المطلوبة من قبل الإرشادات استخدام الحيوان المؤسسية الخاص بك. </li></ol> 7. حقن الكوليرا السمية الوحدة الفرعية ب في العضلات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1٪ الكوليرا السمية فرعية ب (CTB) عن طريق إذابة 1 ملغ من CTB في 100 ميكرولتر من محلول ملحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ستة أيام BDA الحقن في الدماغ، نفذ إعداد الجراحية كما هو موضح أعلاه لحقن PRV في العضلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 10 ميكرولتر NanoFil نظام محقنة مكروية مع حل CTB، إرفاق المقاوم للصدأ إبرة الصلب 34 G، وبعناية تركيبها على جهاز التجسيمي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أداء إبر دقيقة جدا في العضلات (ق) من الفائدة وإلغاء سابقامكتوب لPRV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مراقبة الحيوانات حتى الاستلقاء القصية وتوفير تسكين الألم، والغذاء، والمياه، والرعاية المطلوبة من قبل الإرشادات استخدام الحيوان المؤسسية الخاص بك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد ثلاثة أيام من الحقن CTB، التضحية الحيوانية جرعة زائدة بنتوباربيتال ويروي transcardially مع المياه المالحة 0.9٪ تليها 4٪ الفورمالديهايد في 0.1 M PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وبعد إصلاح الدماغ في 4٪ الفورمالديهايد لمدة 24 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryoprotect الدماغ في الفوسفات عازلة تحتوي على 30٪ سكروز لمدة 48 ساعة على الأقل. </li></ol> 8. الكشف عن BDA وCTB في نفس المقاطع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع المقاطع في 40 ميكرون على مشراح وحفظ المقاطع العائمة إلى 0.1M برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرواء أقسام لمدة 30 دقيقة في 0.3٪ H 2 O 2 في برنامج تلفزيوني محمية من الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل ABC من VE عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أقسام ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، ثم الرد عليهم لمدة 1 ساعة في حل ABC في RT. </لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أقسام ثلاث مرات في المخزن الفوسفات لمدة 10 دقيقة، وتطوير لمدة 8 دقائق في المخزن الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4، يحتوي على 0.05٪ DAB (3، 3&#39;-diaminobenzidine)، 0.015٪ H 2 O 2، و 0.05٪ كلوريد النيكل. المنتج رد فعل DAB داخل الخلايا يجب أن تظهر الأسود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقسام كتلة لمدة 30 دقيقة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.3٪ توين 20 مع مصل الأرنب العادي من أدوات VECTASTAIN النخبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان سدت أبواب لمدة 2 ساعة في الماعز المضادة للCTB (1: 10000) في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أقسام ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، ثم احتضان لهم لمدة 1 ساعة في أرنب مكافحة الماعز الضد الثانوية من VE عدة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل ABC من VE عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أقسام ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق، ثم الرد عليها لمدة 30 دقيقة في محلول ABC في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل أقسام ثلاث مرات في المخزن الفوسفات لمدة 10 دقيقة، وتطوير لمدة تصل إلى 8 دقائق في المخزن الفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4، يحتوي على 0.05٪ DAB (3، 3&#39;-diaminobenzidine) و0.015٪ H 2 O 2. المنتج رد فعل DAB داخل الخلايا يجب أن تظهر البني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أقسام جبل على الشرائح SuperFrost زائد ويذوى من خلال سلسلة الكحول متدرج (70٪، 95٪، 100٪ و 100٪ لمدة 5 دقائق لكل منهما). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح المقاطع من خلال اثنين من يغسل زيلين (5 دقائق لكل منهما) وساترة الشرائح مع Permount المتوسطة المتزايدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة الأقسام التي شنت على المجهر. </li></ol>

<ol>
	<li>Card, J. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, 1.51-1.5.28 (2001).</li><li>Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudorabies+virus+expressing+enhanced+green+fluorescent+protein:+a+tool+for+in+vitro+electrophysiological+analysis+of+transsynaptically+labeled+neurons+in+identified+central+nervous+system+circuits.">Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).</li><li>Aston Jones, G., Card, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+pseudorabies+virus+to+delineate+multisynaptic+circuits+in+brain+opportunities+and+limitations.">Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations.</a> Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).</li><li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pseudorabies+virus+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine.">Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).</li><li>Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+pseudorabies+virus+neuroinvasion+and+lethality+in+mice.">Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice.</a> Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).</li><li>Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+tracing+using+biotinylated+dextran+amines.">Pathway tracing using biotinylated dextran amines.</a> Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).</li><li>Reiner, A., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroanatomical+tract-tracing+3+(Chapter+10).">Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10).</a> Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).</li><li>Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylated+dextran+amine+as+an+anterograde+tracer+for+single+and+double+labeling+studies.">Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).</li><li>Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylated+dextran+a+versatile+anterograde+and+retrograde+neuronal+tracer.">Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer.</a> Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).</li><li>Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+neuronal+tracing+with+cholera+toxin+B+subunit:+comparison+of+three+different+visualization+methods.">Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods.</a> Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).</li><li>Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+circuitry+involved+in+the+regulation+of+whisker+movements.">Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements.</a> The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).</li><li>Bartha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+reduction+of+virulence+of+Aujeszkys+disease+virus.">Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus.</a> Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).</li><li>Kuypers, H., Ugolini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruses+as+transneuronal+tracers.">Viruses as transneuronal tracers.</a> Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).</li><li>Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+pathway+from+rat+vibrissa+motor+cortex+to+facial+motor+neurons+revealed+by+lentivirus-based+axonal+tracing.">Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).</li><li>Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input+output+organization+of+the+rat+vibrissal+motor+cortex.">Input output organization of the rat vibrissal motor cortex.</a> Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).</li><li>Hsu, S. M., Soban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+modification+of+diaminobenzidine+(DAB)+precipitation+by+metallic+ions+and+its+application+for+double+immunohistochemistry.">Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).</li><li>Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+avidin+biotin-peroxidase+complex+(ABC)+in+immunoperoxidase+techniques+a+comparison+between+ABC+and+unlabeled+antibody+(PAP)+procedures.">Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).</li><li>Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anterograde+neuroanatomical+tracer+biotinylated+dextran+amine+comparison+with+the+tracer+Phaseolus+vulgaris+leucoagglutinin+in+preparations+for+electron+microscopy.">The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).</li><li>Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+architecture+of+nucleus+ambiguus+motoneurons+projecting+to+the+upper+alimentary+tract+in+the+rat.">Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).</li><li>Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+birds+and+men+the+mouse+ultrasonic+song+system+has+some+features+similar+to+humans+and+songlearning+birds.">Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds.</a> PLoS ONE. 7 (10), e46610 (2012).</li><li>Card, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+the+use+of+pseudorabies+virus+in+transneuronal+studies+of+neural+circuitry.">Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).</li><li>Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudorabies+virus+glycoprotein+gIII+is+a+major+target+antigen+for+murine+and+swine+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes.">Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes.</a> Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).</li><li>Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinvasiveness+of+pseudorabies+virus+injected+intracerebrally+is+dependent+on+viral+concentration+and+terminal+field+density.">Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density.</a> The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).</li><li>Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+injection+of+the+attenuated+pseudorabies+virus+PRV+Bartha+results+in+infection+of+the+hamster+suprachiasmatic+nucleus+only+by+retrograde+transsynaptic+transport+via+autonomic+circuits.">Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).</li><li>Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+use+bidirectional+fast+axonal+transport+to+spread+in+sensory+neurons.">Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

وهناك عدد من القضايا التي يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار عند التخطيط لتجربة استخدام PRV152 4،21. الأهم من ذلك، فيروس داء الكلب الكاذب قاتلة. كما ذكر سابقا، القردة العليا، بما في ذلك البشر ليست عرضة للإصابة، ولكن يجب توخي الحذر المناسبة لحماية الحيوانات الأخرى. فئران بال?...

أصبح البحث عن المفقودين عبر التشابك أداة قوية تستخدم لتحليل efferents المركزية التي تنظم أهداف الطرفية من خلال الدوائر المتعددة متشابك. وقد تم هذا النهج الأكثر استخداما على نطاق واسع في الدماغ القوارض من خلال الاستفادة من فيروس داء الكلب الكاذب الممرض الخنازير (PRV)، وخصوصا سلالة ضعيفة PRV-بارثا صفت لأول مرة في عام 1961 (12). وهنا، نقدم بروتوكول لتحديد التمثيل القشرية الحركية للعضلات محددة أو المجموعات العضلية باستخدام سلالة فيروس داء الكلب الكاذب المؤتلف (PRV152) معربا عن تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) مراسل الجين 2. الطريقة الموصوفة يستغل سلوك الفيروسات موجه للعصب، والتي تنتج ذرية المعدية التي تصيب لنقاط الاشتباك العصبي عبر الخلايا العصبية الأخرى داخل الدائرة الفنية 3،4،13. PRV152، وهو إسوي مع PRV-بارثا، والصلبان فقط نقاط الاشتباك العصبي retrogradely من خلال التسلسل الهرمي للاتصالات متشابك بعيدا عن موقع الإصابة 3،5 &lt;/ سوب&gt;. عن طريق التحكم بدقة الموقع الطرفية للعدوى فمن الممكن للحد من دخول الفيروس إلى الدماغ من خلال مجموعة فرعية معينة من الخلايا العصبية الحركية. كما يصيب فيروس بالتتابع سلاسل من الخلايا العصبية متصلة، فإن نمط الناتجة من إشارة EGFP في جميع أنحاء الدماغ ثم حل شبكة من الخلايا العصبية التي ترتبط إلى الخلايا المصابة في البداية. ميزة إضافية لاستخدام الفيروسات لتتبع العصبي هو التضخيم من البروتين مراسل (EGFP في هذه الحالة) داخل الخلايا المصابة. يوفر هذا التضخيم إشارة مستوى من الحساسية التي تتيح الكشف عن التوقعات حتى متفرق. على سبيل المثال، تم العثور على إسقاط متفرق من القشرة شعرة أنفية المحرك إلى الخلايا العصبية الحركية في الوجه السيطرة على شعيرات في الفئران باستخدام أعرب فيروسي بروتين الفلورية الخضراء 14؛ فشلت الدراسات السابقة للعثور على هذا الإسقاط باستخدام استشفاف الكلاسيكية دون مراسل التضخيم الجينات 11،15. لسوء الحظ، والعديد من ناقلات تتبع الفيروسية، مثل تلك المستخدمة في الدراسة المذكورة، لا يعبرون نقاط الاشتباك العصبي، مما يحد من استخدامها لتعقب الدوائر المتعددة متشابك. بينما تقدم مزايا واضحة لتحديد شبكة من الخلايا المشاركة في الدائرة الحركية، وطبيعة توزيع عبر التشابك البحث عن المفقودين مع PRV-152 يجعل تفسير اتصالات محددة داخل الدائرة الصعبة. ولذلك، فإننا نقدم وسيلة بسيطة للتحقق من صحة اتصالات محددة داخل الدوائر التي تم تحديدها باستخدام PRV-152 عن طريق مزدوج وضع العلامات باستخدام الأمينات المعقدة البيروكسيديز ديكستران (BDA) والسمية الكوليرا الوحيدات ب (CTB). الجمع بين استخدام BDA وCTB هو نهج راسخ لتعقب الاتصالات بين مجموعات محددة من الخلايا العصبية 6-8،11. عند استخدامها معا، وهذه استشفاف اثنين يمكن تصور في نفس القسم باستخدام DAB اللونين (3، 3&#39;-diaminobenzidine) إجراء 16. وقد تم اختيار ارتفاع الوزن الجزيئي BDA (BDA10kDa) لهذا البروتوكول لأنه ذields وضع العلامات مفصل من العمليات العصبية 6،7،9. وتشمل مزايا إضافية من BDA10kDa ما يلي: يتم نقل تفضيلي في الاتجاه تقدمي 6-8. يمكن أن يتم تسليمها من قبل iontophoretic أو ضغط الحقن 6-8. ويمكن تصور كتبها a-البيروكسيديز أفيدين HRP بسيط (ABC) إجراء 17؛ ويمكن تصويرها بواسطة الضوء أو المجهر الإلكتروني 6،7،18. وقد تم اختيار كشف مناعى من CTB مع الغلوثانيون وDAB لوضع العلامات رجعي من العصبونات الحركية لأنه فعال في الكشف عن العمليات الخلوية بما في ذلك التشعبات البعيدة 10،19. كنا مؤخرا هذا النهج لتحديد مسار السيارات صخبا في الفئران وللكشف عن اتصال متفرق من القشرة الحركية الأولية إلى الخلايا العصبية الحركية الحنجرة، والتي كان من المفترض سابقا أن تغيب 20.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil Microinjection System</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>IO-Kit</td>
			<td>34 gauge option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VetBond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane (Forane)</td>
			<td>Baxter&#160;</td>
			<td>1001936060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Swab Stick</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>2130-01</td>
			<td>200 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated dextran amines</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-1956</td>
			<td>10,000 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudorabies virus</td>
			<td>Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University)</td>
			<td>PRV152</td>
			<td>Titer &#62; 1 x 107</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat)</td>
			<td>List Biological Laboratories</td>
			<td>703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin B Subunit</td>
			<td>List Biological Laboratories</td>
			<td>103B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-eGFP</td>
			<td>Open Biosystems</td>
			<td>ABS4528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3, 3&#39;-diaminobenzidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5905</td>
			<td>10 mg tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Dilute to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3410</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl &#38; Xylazine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K4138</td>
			<td>80 mg/mL &#38; 6 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3619</td>
			<td>1.0 M; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>10X; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pentobarbital</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3761</td>
			<td>50 mg/mL dose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>Histological grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optixcare opthalmic ointment</td>
			<td>Vet Depot</td>
			<td>1017992</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transsynaptic tracing from peripheral targets with pseudorabies virus followed by cholera toxin and biotinylated dextran amines double labeling

أصبح البحث عن المفقودين عبر التشابك أداة قوية تستخدم لتحليل efferents المركزية التي تنظم أهداف الطرفية من خلال الدوائر المتعددة متشابك. وقد تم هذا النهج يستخدم بشكل مكثف في الدماغ من خلال الاستفادة من فيروس داء الكلب الكاذب الممرض الخنازير (PRV) 1. PRV لا تصيب القردة العليا، بما في ذلك البشر، لذلك فإن استخدامها الأكثر شيوعا في الدراسات على الثدييات الصغيرة، وخاصة القوارض. وPRV152 الكاذب سلالة يعبر عن تعزيز الخضراء بروتين فلوري (EGFP) مراسل الجينات ويعبر فقط نقاط الاشتباك العصبي وظيفية retrogradely من خلال التسلسل الهرمي للاتصالات متشابك بعيدا عن موقع الإصابة 2،3. سلالات PRV أخرى لها خصائص الميكروبيولوجية متميزة ويمكن نقلها في كلا الاتجاهين (PRV-بيكر وPRV-كابلان) 4،5. وهذا البروتوكول يتعامل حصرا مع PRV152. من خلال تقديم الفيروس في موقع الطرفية، مثل العضلات، فمن الممكن للحد من دخول الفيروس إلى ركان الدماغ من خلال مجموعة محددة من الخلايا العصبية. النمط الناتج من إشارة EGFP في جميع أنحاء الدماغ ثم يحل الخلايا العصبية التي ترتبط إلى الخلايا المصابة في البداية. لأن طبيعة وزعت من تتبع عبر التشابك مع فيروس داء الكلب الكاذب يجعل تفسير اتصالات محددة داخل الشبكة التي تم تحديدها من الصعب، نقدم طريقة حساسة وموثوق بها توظيف الأمينات المعقدة البيروكسيديز ديكستران (BDA) والكوليرا السم الوحيدات ب (CTB) لتأكيد صلات بين الخلايا التي تم تحديدها باستخدام PRV152. وقد تم اختيار كشف مناعى من BDA وCTB مع الغلوثانيون وDAB (3، 3&#39;-diaminobenzidine) لأنها فعالة في الكشف عن العمليات الخلوية بما في ذلك التشعبات البعيدة 11/06.

يجب تلطيخ لEGFP تبدأ تظهر إشارة ضعيفة في الخلايا العصبية الحركية الأولية حوالي 72 ساعة بعد الحقن PRV152 في العضلات. تكرار والنقل عبر التشابك من الفيروسات وtiter- و 4 تعتمد على الوقت. ما يقرب من 90 ساعة بعد الحقن، وEGFP تلطيخ تكشف إشارة قوية من أجل الخلايا المصابة 2 الثانية...

Watch this Scientific Journal Video about Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling at JoVE.com

Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

عبر التشابك تتبع من الأهداف الطرفية مع فيروس داء الكلب الكاذب تلاه سهم الكوليرا السمية والمعقدة البيروكسيديز ديكستران الأمينات مزدوجة وصفها

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

transsynaptic-tracing-from-peripheral-targets-with-pseudorabies-virus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K Views.  Duke University Medical Center. Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

Video: Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

في الرحم بعد Electroporation للثقافة متعلق بالخلايا العصبية الأولية لدراسة وظائف الجينات في مجموعة فرعية من العصبونات القشرية

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

وصفها الوراء من خلايا الشبكية العقدة في اسماك الزرد الكبار مع الأصباغ نيون

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

الكشف عن الجينوم والنصوص من الفيروسات الحمض النووي في الخلايا العصبية الأنسجة الثابتة التي كتبها نيون في الوضع الطبيعي التهجين جنبا إلى جنب مع المناعية

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

رابيد التنميط الجيني للحيوانات تلاه إنشاء الثقافات الأولية من الخلايا العصبية في الدماغ

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

شرطي عبر التشابك الوراثية للبحث عن المفقودين في المخ الجنينية الماوس

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

المناعية وصفها متعددة مع الأجسام المضادة من نوع المضيف نفسه لدراسة الكبار الحصين تكوين الخلايا العصبية

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

موجهة بالليزر العصبية للبحث عن المفقودين في إإكسبلنتس الدماغ

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of its labeling was affected by various factors, here, we provide a refined protocol for the application of high molecular weight BDA for studying optimal neural labeling in the central nervous system. After stereotactic injection of BDA into the ventral posteromedial nucleus (VPM) of the thalamus in the rat through a delicate glass pipette, BDA was stained with fluorescent streptavidin-Alexa (AF) 594 and counterstained with fluorescent Nissl stain AF500/525. On the background of green Nissl staining, the red BDA labeling, including neuronal cell bodies and axonal terminals, was more distinctly demonstrated in the somatosensory cortex. Furthermore, double fluorescent staining for BDA and the calcium-binding protein parvalbumin (PV) was carried out to observe the correlation of BDA labeling and PV-positive interneurons in the cortical target, providing the opportunity to study the local neural circuits and their chemical characteristics. Thus, this refined method is not only suitable for visualizing high quality neural labeling with the high molecular weight BDA through reciprocal neural pathways between the thalamus and cerebral cortex, but also will permit the simultaneous demonstration of other neural markers with fluorescent histochemistry or immunochemistry.

Here, we present a refined protocol to effectively reveal biotinylated dextran amine (BDA) labeling with a fluorescent staining method through a reciprocal neural pathway. It is suitable for analyzing the fine structure of BDA labeling and distinguishing it from other neural elements under a confocal laser scanning microscope.

تحسين تطبيق أمين ديكستران بيوتينيلاتيد عالية الوزن الجزيئي للإسقاط ثالاموكورتيكال تتبع في الفئران

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate decisions, will be crucial to design therapeutic strategies for many diseases affecting the nervous system. Current methods to track cell populations rely on their final outcomes in still images and they generally fail to provide sufficient temporal resolution to identify behavioral features in single cells. Moreover, variations in cell death, behavioral heterogeneity within a cell population, dilution, spreading, or the low efficiency of the markers used to analyze cells are all important handicaps that will lead to incomplete or incorrect read-outs of the results. Conversely, performing live imaging and single cell tracking under appropriate conditions represents a powerful tool to monitor each of these events. Here, a time-lapse video-microscopy protocol, followed by post-processing, is described to track neural populations with single cell resolution, employing specific software. The methods described enable researchers to address essential questions regarding the cell biology and lineage progression of distinct neural populations.

A robust protocol to monitor neural populations by time-lapse video-microscopy followed by software-based post-processing is described. This method represents a powerful tool to identify biological events in a selected population during live imaging experiments.

يعيش تصوير متبوعاً بخلية واحدة تتبع لرصد خلية علم الأحياء وتطور نسب السكان العصبية متعددة

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. Additionally, epigenetic chromatin modifications, like histone methylation, have an important role for establishing and maintaining specific cell fates within this process. The vast majority of histone methylation occurs on the flexible histone tail, which is accessible to histone modifiers, erasers, and histone reader proteins. In contrast, H3K79 methylation is located in the globular domain of histone 3 and is implicated in different developmental functions. H3K79 methylation is evolutionarily conserved and can be found in a wide range of species from Homo sapiens to Saccharomyces cerevisiae. The modification occurs in different cell populations within organisms, including neural progenitors. The location of H3K79 methylation in the globular domain of histone 3 makes it difficult to assess. Here, we present methods to isolate and culture cortical progenitor cells (CPCs) from embryonic cortical brain tissue (E11.5-E14.5) or cerebellar granular neuron progenitors (CGNPs) from postnatal tissue (P5-P7), and to efficiently immunoprecipitate H3K79me2 for quantitative PCR (qPCR) and genome-wide sequencing.

We present an effective and reproducible method to isolate and culture neural progenitor cells from embryonic and postnatal brain tissue for chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - a histone mark located within the globular domain of histone 3.

عزل وزراعة المتكفل العصبية تليها الكروماتين-إيمونوبريسيبيتيشن من هستون 3 يسين 79 مارك ديميثيليشن

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...