Agradecemos ao Dr. Toshio Terashima, da Universidade de Kobe, no Japão, para o ensino da técnica de cirurgia de laringe, e Dr. Lynn Enquist da Universidade de Princeton para o fornecimento de PRV-Bartha. A pesquisa foi financiado pelo NIH prêmio pioneiro DP1 OD000448 para Erich D. Jarvis e um prêmio NSF Graduate Research Fellowship para Gustavo Arriaga. Dados do adequadamente creditado trabalho anterior são usadas sob a PLoS ONE acesso aberto licença Creative Commons (CC-BY), em conformidade com as políticas editoriais da revista.

NOTA: Todos os procedimentos com animais foram revistos e aprovados pelo Comitê Animal Care Institucional e Uso da Universidade Duke. 1. Armazenando vírus da pseudo- <ol><li> Obtemos vírus vivo (PRV152) a partir do laboratório do Dr. Lynn Enquist na Universidade de Princeton com uma concentração de 1 x 10 9 pfu / m. O protocolo para gerar o vírus foi publicada 2. </li><li> Alíquota do vírus em 20 ul por tubo dentro de um gabinete de biossegurança BSL-2 e armazenar a -80 ° C em condições de biossegurança adequadas. </li><li> Descongelar uma alíquota de PRV imediatamente antes da injecção. </li></ol> 2. Preparação cirúrgica para injecções no músculo <ol><li> Induzir a anestesia geral por injeco intramuscular de cetamina-xilazina (100 mg / kg de cetamina, 10 mg / kg xilazina) e manter uma plano anestésico apropriado utilizando isofluorano. </li><li> Proteja as córneas com uma pomada oftálmica. </li><li> Prepare tele sítio cirúrgico de acordo com a técnica asséptica por aparar o cabelo e desinfecção do local cirúrgico com a alternância de scrubs de Betadine e álcool a 70% (mínimo de 3 ciclos). Certifique-se de usar campos estéreis para cobrir áreas cirúrgicas. Certifique-se a aderir às técnicas estéreis durante os procedimentos. </li><li> Faça uma incisão na pele e revelar o músculo de interesse. Por exemplo, para acessar a musculatura laríngea cricothyroid é necessário primeiro remover a parte sobreposta do músculo esterno. </li><li> Selar qualquer músculos transeccionados com adesivo de tecido Vetbond. </li></ol> 3. Injecção de PRV em músculo <ol><li> Carregue a 10 ul sistema de micro Nanofil com solução PRV recém-descongelado, coloque uma agulha de aço inoxidável 34 G, e montá-lo cuidadosamente no dispositivo estereotáxico. </li><li> Lentamente limpar o espaço morto e verifique se solução saia a ponta micro. Descarte fluido como resíduos bioharzard. </li><li> Usando um microp estereotáxicodispositivo ositioning coloque cuidadosamente a ponta da microsseringa no músculo de interesse e lentamente encher o músculo até um ligeiro inchaço é visível. A taxa de injecção variará dependendo do tamanho do músculo e o volume a ser injectado. Por exemplo, de cinco injecções de 200 nl (1 mL no total) a uma taxa de 4 nl / s deve ser feito para além de 1 min no mesmo local para preencher o músculo crico. Mova a seringa para o próximo músculo de interesse (cricoaritenóideo lateral, neste caso) e repita o procedimento de injeção. Apenas perfurar cada músculo uma vez. </li><li> Retrair o micro depois de cinco minutos. </li><li> Selar a ruptura na fáscia usando adesivo de tecido Vetbond. </li><li> Depois de todas as injecções foram concluídos, fechar a ferida utilizando adesivo de tecido Vetbond. Dependendo de suas diretrizes locais institional uso de animais, suturas ou clipes ferida pode ser usado. </li><li> Monitorar o animal até decúbito esternal e fornecer analgesia, comida, água e cuidados como exigido por ynossas diretrizes de uso de animais institucionais. </li><li> Após o tempo de sobrevivência determinados experimentalmente (neste caso, 90 h para rotular 2a ordem neurónios corticais), sacrifício do animal por dose excessiva de pentobarbital e perfundir transcardíaca com solução salina a 0,9%, seguido por 4% de formaldeído em PBS a 0,1 M. </li><li> Retire e pós-fixar o cérebro em formaldeído 4% durante 24 horas. </li><li> Cryoprotect o cérebro em tampão de fosfato contendo 30% de sacarose pelo menos durante 48 horas. </li></ol> 4. detecção imunoquímica de eGFP <ol><li> Cortar secções de 40 um em um micrótomo deslizante e salvar seções flutuantes em 0,1 M PBS. Cortes mais finos, por exemplo de 30 um, pode ser utilizado quando a coloração secções montadas. </li><li> Extingue-se secções durante 30 minutos em 0,3% de H 2 O 2 em PBS protegidas da luz. </li><li> Bloquear antigénios não específicos nas secções durante 30 minutos em PBS contendo 0,3% de Tween 20 com soro de cabra normal a partir do kit Vectastain Elite (VE kit). </li><li&gt; Incubar secções bloqueados durante 3,5 horas em coelho anti-EGFP (1: 1.000), à TA. </li><li> Lave os cortes três vezes em PBS durante 5 min, em seguida incubar durante 1 h em anticorpo secundário de cabra anti-coelho a partir do kit de VE, à TA. </li><li> Preparar a solução ABC do VE kit de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Lave os cortes três vezes em PBS durante 5 min, em seguida, eles reagem, durante 1 h em solução ABC do kit de VE, à TA. </li><li> Lave os cortes três vezes em tampão de fosfato durante 10 min, e desenvolver durante 8 minutos em tampão de fosfato, pH 7,4, contendo 0,05% de DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidina) e 0,015% de H 2 O 2. </li><li> Seções de montagem em lâminas SuperFrost Bonés e desidratar-los através de uma série álcool graduado (70%, 95%, 100% e 100% durante 5 minutos cada). </li><li> Desmarque as secções através de duas lavagens xileno (5 min cada) e lamela as lâminas com Permount meio de montagem. </li><li> Imagem as seções montadas em um microscópio. O produto da reacção DAB inside as células devem aparecer marrom. Imagens digitalizadas podem ser cor invertida para realçar processos finas. </li></ol> 5. Preparação cirúrgica para a injeção de Tracers em regiões do cérebro Descoberto por PRV Tracing <ol><li> Induzir a anestesia geral por injeco intramuscular de cetamina-xilazina (100 mg / kg de cetamina, 10 mg / kg xilazina) e manter uma plano anestésico apropriado utilizando isofluorano. </li><li> Proteja as córneas com uma pomada oftálmica. </li><li> Fixe a cabeça em um quadro estereotáxico apropriado. </li><li> Prepare o local cirúrgico de acordo com a técnica asséptica por aparar o cabelo e desinfecção do local com a alternância de scrubs de Betadine e álcool a 70% (mínimo de 3 ciclos). </li><li> Faça uma incisão no couro cabeludo e retrair a pele sobre a região do cérebro de interesse. </li><li> Realize uma pequena craniotomia nas coordenadas estereotáxica adequadas. Por exemplo, as coordenadas para córtex motor laryngeally conectado identificado por PRV rastreamento em umn rato adulto são 1,2 milímetros lateral e 0,2 mm rostral para Bregma. </li></ol> 6. Injecção da biotinilados Dextran Aminas em Cérebro <ol><li> Prepare a 7,5% biotinilados aminas dextrano (BDA) por dissolução de 25 mg de BDA (MW 10.000) em 333 ul de solução salina estéril. </li><li> Carregar o sistema micropipeta Nanoject II com solução BDA suficiente para as injeções planejadas. </li><li> Lentamente limpar o espaço morto e verificar que a solução é sair da ponta da micropipeta. </li><li> Usando um dispositivo estereotáxico microposicionamento cuidadosamente abaixe a ponta da micropipeta para a região do cérebro de juros e injetar lentamente BDA. Ajustar a velocidade de injecção, dependendo do tamanho da região a ser marcado. Por exemplo, 12 injeções de 4,6 nl deve ser fez em quatro locais diferentes 0,2 milímetros distante (sentido rostro-caudal) para cobrir o córtex motor laryngeally conectado em ratos adultos. O volume final de injecção deve ser ajustada de acordo com o tamanho da região do cérebro de interesse, Tendo em mente que a etiqueta pode difundir a partir do núcleo de injecção por difusão através do tecido cerebral e ao longo dos processos de neurónios marcados. </li><li> Selar a craniotomia com cimento dental, e fechar o ferimento no couro cabeludo usando adesivo de tecido Vetbond. </li><li> Monitorar o animal até decúbito esternal e fornecer analgesia, comida, água e cuidados como exigido por suas diretrizes de uso de animais institucionais. </li></ol> 7. Injecção da toxina da cólera Subunidade b no músculo <ol><li> Prepare 1% Toxina da Cólera subunidade b (CTB) por dissolução de 1 mg de CTB em 100 ul de solução salina estéril. </li><li> Seis dias após a injecção BDA no cérebro, realizar a preparação cirúrgica, como acima descrito para injecções PRV no músculo. </li><li> Carregue a 10 ul sistema de micro Nanofil com solução CTb, anexar uma agulha de aço inoxidável 34 G, e cuidadosamente montá-lo no dispositivo estereotáxico. </li><li> Execute as microinjeções no músculo (s) de interesse como anteriormente descrito para PRV. </li><li> Monitorar o animal até decúbito esternal e fornecer analgesia, comida, água e cuidados como exigido por suas diretrizes de uso de animais institucionais. </li><li> Três dias após a injecção de CTB, sacrifício do animal por dose excessiva de pentobarbital e perfundir transcardíaca com solução salina a 0,9%, seguido por 4% de formaldeído em PBS a 0,1 M. </li><li> Retire e pós-fixar o cérebro em formaldeído 4% durante 24 horas. </li><li> Cryoprotect o cérebro em tampão de fosfato contendo 30% de sacarose pelo menos durante 48 horas. </li></ol> 8. Detecção de BDA e CTb nas mesmas seções <ol><li> Cortar secções de 40 um em um micrótomo e salvar seções flutuantes em 0,1 M PBS. </li><li> Extingue-se secções durante 30 minutos em 0,3% de H 2 O 2 em PBS protegidas da luz. </li><li> Preparar a solução ABC do VE kit de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Lave os cortes três vezes em PBS durante 5 min, em seguida, eles reagem, durante 1 h em solução ABC à TA. </li&gt; <li> Lave os cortes três vezes em tampão de fosfato durante 10 min, e desenvolver durante 8 minutos em tampão de fosfato, pH 7,4, contendo 0,05% de DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidina), 0,015% de H 2 O 2, e 0,05% de cloreto de níquel. O produto da reacção DAB no interior das células deve aparecer preto. </li><li> Secções de blocos de 30 min em PBS contendo 0,3% de Tween 20 com soro normal de coelho a partir do kit Vectastain Elite. </li><li> Incubar secções bloqueados durante 2 horas em cabra anti-CTB (1: 10.000), à TA. </li><li> Lave os cortes três vezes em PBS durante 5 min, depois incubar durante 1 h em anticorpo secundário de coelho anti-cabra a partir do kit de VE, à TA. </li><li> Preparar a solução ABC do VE kit de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Lave os cortes três vezes em PBS durante 5 min, em seguida, eles reagem durante 30 min em solução ABC à TA. </li><li> Lave os cortes três vezes em tampão de fosfato durante 10 min, e para desenvolver até 8 min em tampão de fosfato, pH 7,4, contendo 0,05% de DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine) e 0,015% de H 2 O 2. O produto da reacção de DAB no interior das células deve aparecer castanho. </li><li> Seções de montagem em lâminas SuperFrost Bonés e desidratar-los através de uma série álcool graduado (70%, 95%, 100% e 100% durante 5 minutos cada). </li><li> Desmarque as secções através de duas lavagens xileno (5 min cada) e lamela as lâminas com Permount meio de montagem. </li><li> Imagem as seções montadas em um microscópio. </li></ol>

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No conflicts of interest declared.

Há uma série de questões que devem ser levadas em consideração ao planejar uma experiência usando PRV152 4,21. Mais importante ainda, vírus da pseudo é letal. Como mencionado anteriormente, grandes macacos, incluindo os seres humanos não são suscetíveis à infecção, mas cuidado apropriado deve ser exercido para proteger outros animais. Ratos adultos normalmente sobreviver cinco a sete dias após a inoculação com a estirpe atenuada PRV152. Portanto, PRV152 não é adequado para experiências que...

Rastreamento transsináptica tornou-se uma poderosa ferramenta utilizada para analisar eferentes centrais que regulam alvos periféricos através de circuitos multi-sinápticos. Esta abordagem tem sido o mais amplamente utilizado no cérebro de roedor, utilizando o vírus da pseudo-raiva de agentes patogénicos suína (PRV), especialmente a estirpe atenuada de PRV-Bartha descrita pela primeira vez em 1961 12. A seguir, apresentamos um protocolo para a identificação da representação cortical motora dos músculos específicos ou grupos musculares utilizando uma estirpe do vírus da pseudo-raiva recombinantes (PRV152) que expressa o reforçada proteína verde fluorescente (eGFP) gene repórter 2. O método descrito explora o comportamento de vírus neurotrópico, que produzem progénie infeccioso que sinapses cruzadas para infectar outros neurónios dentro de um circuito funcional 3,4,13. PRV152, que é isogênico com PRV-Bartha, única atravessa sinapses retrogradamente através da seqüência hierárquica das conexões sinápticas longe do local de infecção 3,5 &lt;/ sup&gt;. Ao controlar com precisão o local periférico de infecção é possível limitar a entrada do vírus para o cérebro através de um subconjunto específico de neurónios motores. À medida que o vírus infecta sequencialmente cadeias de neurónios ligados, o padrão resultante de sinal eGFP em todo o cérebro, em seguida resolver a rede de neurónios que estão ligados às células inicialmente infectadas. Uma vantagem adicional da utilização de vírus, para um rastreio neural é a amplificação da proteína repórter (eGFP, neste caso) no interior das células infectadas. Esta amplificação de sinal fornece um nível de sensibilidade que permite a detecção de projeções ainda esparsas. Por exemplo, uma projecção a partir de córtex motor esparso vibrissa para os neurónios motores faciais que controlam os bigodes foi encontrada em ratos utilizando viralmente expressa a proteína fluorescente verde 14; Estudos anteriores não conseguiram encontrar essa projeção usando marcadores clássicos sem amplificação do gene repórter 11,15. Infelizmente, Muitos vectores virais de rastreio, tal como o utilizado no estudo citado, não atravessam sinapses, limitando assim o seu uso para o rastreamento de circuitos multi-sinápticos. Ao apresentar vantagens distintas para identificar a rede de células que participam em um circuito de motor, a natureza distribuída da transsináptica rastreamento com PRV-152 torna a interpretação de conexões específicas dentro do circuito difícil. Por isso, apresentamos um método simples para a validação de conexões específicas dentro de circuitos identificados usando PRV-152 by-dupla rotulagem utilizando aminas biotinilados dextrano (BDA) e toxina da cólera subunidade b (CTB). O uso combinado do BDA e CTb é uma abordagem bem estabelecido para rastreamento de conexões entre conjuntos específicos de neurônios 6-8,11. Quando utilizados em conjunto, estes dois marcadores podem ser visualizados na mesma secção utilizando um DAB duas cores (3, 3&#39;-diaminobenzidina) Procedimento 16. Alto peso molecular BDA (BDA10kDa) foi selecionada para este protocolo porque yfields rotulagem detalhada dos processos neuronais 6,7,9. As vantagens adicionais da BDA10kDa incluem o seguinte: ele é preferencialmente transportados na direcção anterógrada 6-8; que podem ser entregues por iontoforese ou de injecção a pressão 6-8; que pode ser visualizada por uma simples HRP (ABC) Procedimento 17 biotinilada-avidina; e pode ser fotografada pela luz ou microscopia eletrônica 6,7,18. Detecção imunoquímica da CTB com peroxidase e DAB foi escolhido para a marcação retrógrada de neurónios motores, pois é eficaz em processos celulares, incluindo revelando dendritos distais 10,19. Nós recentemente utilizado esta abordagem para identificar a via motora vocal em camundongos e para revelar uma conexão escasso de córtex motor primário para os neurônios motores da laringe, que foi previamente assumidos estar ausente 20.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil Microinjection System</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>IO-Kit</td>
			<td>34 gauge option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VetBond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane (Forane)</td>
			<td>Baxter&#160;</td>
			<td>1001936060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Swab Stick</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>2130-01</td>
			<td>200 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated dextran amines</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-1956</td>
			<td>10,000 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudorabies virus</td>
			<td>Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University)</td>
			<td>PRV152</td>
			<td>Titer &#62; 1 x 107</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat)</td>
			<td>List Biological Laboratories</td>
			<td>703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin B Subunit</td>
			<td>List Biological Laboratories</td>
			<td>103B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-eGFP</td>
			<td>Open Biosystems</td>
			<td>ABS4528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3, 3&#39;-diaminobenzidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5905</td>
			<td>10 mg tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Dilute to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3410</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl &#38; Xylazine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K4138</td>
			<td>80 mg/mL &#38; 6 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3619</td>
			<td>1.0 M; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>10X; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pentobarbital</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3761</td>
			<td>50 mg/mL dose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>Histological grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optixcare opthalmic ointment</td>
			<td>Vet Depot</td>
			<td>1017992</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transsynaptic tracing from peripheral targets with pseudorabies virus followed by cholera toxin and biotinylated dextran amines double labeling

Rastreamento transsináptica tornou-se uma poderosa ferramenta utilizada para analisar eferentes centrais que regulam alvos periféricos através de circuitos multi-sinápticos. Esta abordagem tem sido mais amplamente utilizado no cérebro, utilizando o vírus da pseudo-raiva de agentes patogénicos suína (PRV) 1. O PRV não infectar grandes macacos, incluindo os seres humanos, por isso é mais comumente usado em estudos sobre pequenos mamíferos, especialmente roedores. O PRV152 pseudorabies estirpe expressa a proteína fluorescente (eGFP) gene repórter verde reforçada e só atravessa sinapses funcionais retrogradamente através da seqüência hierárquica das conexões sinápticas de distância do local da infecção 2,3. Outras estirpes de PRV têm propriedades microbiológicas distintas e pode ser transportado em ambas as direcções (PRV-Becker e PRV-Kaplan) 4,5. Este protocolo tratará exclusivamente com PRV152. Ao fornecer o vírus num sítio periférico, tais como o músculo, é possível limitar a entrada do vírus em tele cérebro através de um conjunto específico de neurônios. O padrão resultante de sinal eGFP em todo o cérebro, em seguida, resolve os neurónios que são ligados às células inicialmente infectadas. Como a natureza distribuída de rastreamento transsináptica com o vírus da pseudo-raiva faz interpretar conexões específicas dentro de uma rede identificada difícil, apresentamos um método sensível e confiável que emprega aminas biotinilados dextrano (BDA) e toxina da cólera subunidade b (CTB) para confirmar as conexões entre as células identificadas usando PRV152. Detecção imunoquímica de BDA e CTB e com peroxidase de DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidina) foi escolhida, porque eles são eficazes em processos celulares, incluindo revelando dendritos distais 6-11.

A coloração para eGFP deve começar mostrando sinal fraco em neurônios motores primários de aproximadamente 72 horas após a injecção de PRV152 em músculo. A replicação e transporte transsináptica de vírus são titer- e 4 dependente do tempo. Aproximadamente 90 horas após a injecção, coloração eGFP irá revelar sinal robusto em células infectadas 2ª ordem. Tempos mais longos de sobrevivência irá revelar 3 e células de ordem superior, mas o tempo de sobrevivência sã...

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Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

Transsináptica Rastreamento de Alvos periféricos com vírus da pseudo-Seguido por cólera toxina e Biotinilado Dextran aminas Duplo Labeling

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K visualizações.  Duke University Medical Center. Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.