אנו מודים לד&quot;ר הטושים Terashima של אוניברסיטת קובה, יפן, להוראת טכניקת הניתוח בגרון, וד&quot;ר לין אנקוויסט של אוניברסיטת פרינסטון לאספקת PRV-ברטה. מחקר נתמך על ידי הפרס חלוץ NIH DP1 OD000448 לאריך ד ג&#39;רוויס ופרס NSF בוגר מלגת המחקר לגוסטבו אריאגה. דמויות מהעבודה קודמת זוכה כראוי משמשות תחת רישיון PLoS ONE גישה פתוחה Creative Commons (CC-BY) בהתאם למדיניות העריכה של כתב העת.

הערה: כל נהלי בעלי החיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת דיוק. וירוס 1. אחסון Pseudorabies <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנו משיגים נגיף חי (PRV152) מהמעבדה של ד&quot;ר לין אנקוויסט באוניברסיטת פרינסטון בכייל של 1 x 10 9 pfu / מ &#39;. הפרוטוקול כדי ליצור את הווירוס כבר פורסם 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot הווירוס ב 20 μl לכל צינור בתוך ארון בטיחות ביולוגית BSL-2 ולאחסן ב -80 ° C בתנאי בטיחות ביולוגית מתאימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר aliquot של PRV מייד לפני הזרקה. </li></ol> 2. הכנת כירורגי לזריקות לתוך שריר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום הרדמה כללית על ידי זריקה תוך שרירית של קטמין-xylazine (100 מ&quot;ג / קילוגרם קטמין, 10 מ&quot;ג / קילוגרם xylazine) ולשמור על מטוס הרדמה מתאים באמצעות isofluorane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגן על הקרניות עם משחת עיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן tהוא אתר כירורגית על פי טכניקת aseptic ידי זמירה שיער וחיטוי האתר כירורגית עם סקראבס לסירוגין של פולידין ואלכוהול 70% (מינימום של 3 מחזורים). הקפד להשתמש בסדינים מעוקרים כדי לכסות אזורים כירורגית. הקפד לדבוק טכניקות סטרילי לאורך כל ההליכים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך בעור ולחשוף את השרירים של עניין. לדוגמא, כדי לגשת לשרירי גרון cricothyroid יש צורך להסיר את החלק ראשון שמעליה של שריר sternohyoid. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום כל שרירי transected עם דבק רקמות VetBond. </li></ol> 3. הזרקה של PRV לשריר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מערכת microsyringe 10 μl NanoFil עם פתרון PRV מופשר טרי, לצרף מחט נירוסטה 34 G, ולעגן אותה בזהירות על מכשיר stereotaxic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לנקות את השטח המת ולאמת פתרון שיוצא קצה microsyringe. בטל נוזל כפסולת bioharzard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות microp stereotaxicמכשיר ositioning למקם בזהירות את קצה microsyringe לתוך השריר של עניין ולמלא לאט השריר עד נפיחות קלה גלויה. שיעור ההזרקה ישתנה בהתאם לגודל של השריר והנפח להיות מוזרק. לדוגמא, חמש זריקות של 200 NL (סה&quot;כ μl 1) בשיעור של 4 NL / sec צריכים להיעשות בנפרד 1 דקות באותו האתר כדי למלא את שריר cricothyroid. הזז את המזרק לשריר הבא של ריבית (cricoarytenoid הרוחב במקרה זה) ולחזור על תהליך ההזרקה. לנקב כל שריר פעם אחת בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחזור microsyringe אחרי חמש דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם את ההפסקה בfascia באמצעות דבק רקמות VetBond. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הכל הזריקות הושלמו, לסגור את הפצע באמצעות דבק רקמות VetBond. בהתאם להנחיות שלך המקומיות institional שימוש בבעלי חיים, תפרים או קליפים פצע ניתן להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג בעלי החיים עד שכיבה sternal ולספק שיכוך כאבים, מזון, מים, ואכפת לי כנדרש על ידי yההנחיות לשימוש בבעלי חיים המוסדיים שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר זמן הישרדות בניסוי נקבע (במקרה זה, 90 שעות לתייג 2 nd להזמין נוירונים בקליפת המוח), להקריב את בעלי החיים על ידי ממנת יתר pentobarbital ותנקבנה transcardially עם מי מלח 0.9% ואחריו פורמלדהיד 4% ב 0.1 M PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ופוסט-לתקן את המוח בפורמלין 4% למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryoprotect המוח בחיץ פוספט המכיל סוכרוז 30% לפחות 48 שעות. </li></ol> 4. immunochemical איתור של eGFP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך סעיפים 40 מיקרומטר על microtome הזזה ולשמור קטעים צף ל0.1M PBS. חלקים רזים יותר, למשל 30 מיקרומטר, ניתן להשתמש כאשר מכתימים סעיפים רכובים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות חלקים למשך 30 דקות בשיעור של 0.3% H 2 O 2 בPBS המוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסום אנטיגנים שאינם ספציפיים בסעיפים למשך 30 דקות ב PBS המכיל 0.3% Tween 20 עם סרום עז נורמלי מקיט VECTASTAIN העלית (VE ערכה). </li><li&gt; דגירה חסומה סעיפים 3.5 שעות בארנב נגד eGFP (1: 1000) ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות, ואז דגירה אותם במשך שעה 1 בנוגדנים משני עז נגד ארנב מVE ערכה ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון ABC מVE ערכה על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות, ולאחר מכן להגיב להם עבור שעה 1 בפתרון ABC מVE ערכה ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים שלוש פעמים בחיץ פוספט במשך 10 דקות, ולפתח עבור 8 דקות בחיץ פוספט, pH 7.4, המכיל 0.05% DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine) ו0.015% H 2 O 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקי הר בשקופיות SuperFrost פלוס ולייבש אותם באמצעות סדרת אלכוהול מדורגת (70%, 95%, 100% ובמשך 5 דקות כל אחד 100%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את החלקים באמצעות שתי שטיפות קסילן (5 דקות כל אחד) וcoverslip השקופיות עם הרכבה בינונית Permount. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת החלקים רכובים על מיקרוסקופ. מוצר תגובת DAB insidדואר התאים אמורים להופיע חום. תמונות דיגיטליות יכולות להיות צבע ההפוך כדי להדגיש תהליכים בסדר. </li></ol> 5. הכנת כירורגי להזרקה של קליעים נותבים לאזורים במוח שהתגלו על ידי PRV איתור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום הרדמה כללית על ידי זריקה תוך שרירית של קטמין-xylazine (100 מ&quot;ג / קילוגרם קטמין, 10 מ&quot;ג / קילוגרם xylazine) ולשמור על מטוס הרדמה מתאים באמצעות isofluorane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגן על הקרניות עם משחת עיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את הראש במסגרת stereotaxic מתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את האתר כירורגית על פי טכניקת aseptic ידי זמירה שיער וחיטוי האתר עם סקראבס לסירוגין של פולידין ואלכוהול 70% (מינימום של 3 מחזורים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך בקרקפת ולחזור העור מעל האזור במוח של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע craniotomy קטן בקואורדינטות stereotaxic המתאימות. לדוגמא, את הקואורדינטות לקליפת המוח מוטורי המחובר laryngeally זוהה על ידי התחקות PRV בהעכבר בוגר n הם 1.2 מ&quot;מ לרוחב ו -0.2 מ&quot;מ מקורי לגבחת. </li></ol> 6. הזרקה של אמיני Dextran Biotinylated למוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אמינים 7.5% biotinylated dextran (BDA) על ידי המסת 25 מ&quot;ג BDA (10,000 מגוואט) בשנת 333 μl של תמיסת מלח סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מערכת micropipette Nanoject השנייה עם פתרון BDA מספיק לזריקות המתוכננות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לנקות את השטח המת ולאמת פתרון שהוא יציאת קצה micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במכשיר micropositioning stereotaxic להוריד בזהירות את קצה micropipette לאזור במוח של עניין ולהזריק לאט BDA. התאם את קצב ההזרקה תלוי בגודל של האזור כדי להיות מתויג. לדוגמא, 12 זריקות של 4.6 NL צריכים להיות הסתפקו בארבעה מקומות שונים זה מזה 0.2 מ&quot;מ (כיוון rostro- הזנב) כדי לכסות את הקורטקס המוטורי המחובר laryngeally בעכברים בוגרים. סופי נפח ההזרקה צריך להיות מותאם לפי הגודל של האזור במוח של עניין, תוך התחשבות כי תווית עלולה להתפשט מליבת ההזרקה על ידי דיפוזיה דרך רקמת המוח ולאורך התהליכים של נוירונים שכותרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום craniotomy באמצעות מלט שיניים, ולסגור את הפצע בקרקפת באמצעות דבק רקמות VetBond. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג בעלי החיים עד שכיבה sternal ולספק שיכוך כאבים, מזון, מים, ואכפת לי כנדרש בהנחיות לשימוש בבעלי חיים המוסדיים שלך. </li></ol> 7. הזרקה של רעלן למקטע B כולרה לשריר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1% ב מקטע רעלן כולרה (CTB) על ידי המסת 1 מ&quot;ג של CTB בשל תמיסת מלח סטרילית 100 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שישה ימים לאחר הזרקת BDA לתוך המוח, לבצע הכנה כירורגית כפי שתואר לעיל לזריקות לתוך שריר PRV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את מערכת microsyringe 10 μl NanoFil עם פתרון CTB, לצרף מחט נירוסטה 34 G, ובזהירות לעלות אותו על מכשיר stereotaxic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע microinjections לתוך השריר (ים) של העניין כדה בעברscribed לPRV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג בעלי החיים עד שכיבה sternal ולספק שיכוך כאבים, מזון, מים, ואכפת לי כנדרש בהנחיות לשימוש בבעלי חיים המוסדיים שלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלושה ימים לאחר הזרקת CTB, להקריב בעלי החיים על ידי ממנת יתר pentobarbital וינקב transcardially עם מי מלח 0.9% ואחריו פורמלדהיד 4% ב 0.1 M PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ופוסט-לתקן את המוח בפורמלין 4% למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cryoprotect המוח בחיץ פוספט המכיל סוכרוז 30% לפחות 48 שעות. </li></ol> 8. איתור של BDA וCTB באותו הסעיפים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך סעיפים 40 מיקרומטר על microtome ולשמור קטעים צף ל0.1M PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרוות חלקים למשך 30 דקות בשיעור של 0.3% H 2 O 2 בPBS המוגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון ABC מVE ערכה על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות, ולאחר מכן להגיב להם עבור שעה 1 בפתרון ABC ב RT. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים שלוש פעמים בחיץ פוספט במשך 10 דקות, ולפתח עבור 8 דקות בחיץ פוספט, pH 7.4, המכיל 0.05% DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine), 0.015% H 2 O 2, ושל 0.05% כלוריד ניקל. מוצר תגובת DAB בתוך התאים אמור להופיע שחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקי בלוק למשך 30 דקות ב PBS המכילות 0.3% Tween 20 עם סרום ארנבת רגיל מקיט VECTASTAIN העלית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה חסמה חלקים לשעה 2 בעז אנטי CTB (1: 10,000) ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות, ואז דגירה אותם במשך שעה 1 בנוגדנים משני ארנב נגד עז מVE ערכה ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון ABC מVE ערכה על פי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות, ולאחר מכן להגיב להם למשך 30 דקות בתמיסת ABC ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף חלקים שלוש פעמים בחיץ פוספט במשך 10 דקות, ולפתח לעד 8 דקות בחיץ פוספט, pH 7.4, המכיל 0.05% DAB (3, 3&quot;-diaminobenzidine) ו0.015% H 2 O 2. מוצר תגובת DAB בתוך התאים אמור להופיע חום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלקי הר בשקופיות SuperFrost פלוס ולייבש אותם באמצעות סדרת אלכוהול מדורגת (70%, 95%, 100% ובמשך 5 דקות כל אחד 100%). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נקה את החלקים באמצעות שתי שטיפות קסילן (5 דקות כל אחד) וcoverslip השקופיות עם הרכבה בינונית Permount. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת החלקים רכובים על מיקרוסקופ. </li></ol>

<ol>
	<li>Card, J. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transneuronal circuit analysis with pseudorabies viruses.Multiple values selected. Unit 1.5, 1.51-1.5.28 (2001).</li><li>Smith, B. N., Banfield, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudorabies+virus+expressing+enhanced+green+fluorescent+protein:+a+tool+for+in+vitro+electrophysiological+analysis+of+transsynaptically+labeled+neurons+in+identified+central+nervous+system+circuits.">Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: a tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (16), 9264-9269 (2000).</li><li>Aston Jones, G., Card, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+pseudorabies+virus+to+delineate+multisynaptic+circuits+in+brain+opportunities+and+limitations.">Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain opportunities and limitations.</a> Journal of Neuroscience Methods. 103 (1), 51-61 (2000).</li><li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+biology+of+pseudorabies+virus+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine.">Molecular biology of pseudorabies virus impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 462-500 (2005).</li><li>Brittle, E. E., Reynolds, A. E., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+modes+of+pseudorabies+virus+neuroinvasion+and+lethality+in+mice.">Two modes of pseudorabies virus neuroinvasion and lethality in mice.</a> Journal of Virology. 78 (23), 12951-12963 (2004).</li><li>Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+tracing+using+biotinylated+dextran+amines.">Pathway tracing using biotinylated dextran amines.</a> Journal of neuroscience. 103, 23-37 (2000).</li><li>Reiner, A., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroanatomical+tract-tracing+3+(Chapter+10).">Neuroanatomical tract-tracing 3 (Chapter 10).</a> Dextran Amines Versatile Tools for Anterograde and Retrograde Studies of Nervous System Connectivity. 10, 304-335 (2006).</li><li>Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylated+dextran+amine+as+an+anterograde+tracer+for+single+and+double+labeling+studies.">Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single and double labeling studies.</a> Journal of Neuroscience Methods. 41 (3), 239-254 (1992).</li><li>Rajakumar, N., Elisevich, K., Flumerfelt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylated+dextran+a+versatile+anterograde+and+retrograde+neuronal+tracer.">Biotinylated dextran a versatile anterograde and retrograde neuronal tracer.</a> Brain Research. 607 (1-2), 47-53 (1993).</li><li>Dederen, P. J. W. C., Gribnau, A. A. M., Curfs, M. H. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+neuronal+tracing+with+cholera+toxin+B+subunit:+comparison+of+three+different+visualization+methods.">Retrograde neuronal tracing with cholera toxin B subunit: comparison of three different visualization methods.</a> Histochemical Journal. 26 (11), 856-862 (1994).</li><li>Hattox, A. M., Priest, C. A., Keller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+circuitry+involved+in+the+regulation+of+whisker+movements.">Functional circuitry involved in the regulation of whisker movements.</a> The Journal of Comparative Neurology. 442 (3), 266-276 (2002).</li><li>Bartha, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+reduction+of+virulence+of+Aujeszkys+disease+virus.">Experimental reduction of virulence of Aujeszkys disease virus.</a> Magy Allatorv Lapja. 16, 42-45 (1961).</li><li>Kuypers, H., Ugolini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viruses+as+transneuronal+tracers.">Viruses as transneuronal tracers.</a> Trends in Neurosciences. 13 (2), 71-75 (1990).</li><li>Grinevich, V., Brecht, M., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monosynaptic+pathway+from+rat+vibrissa+motor+cortex+to+facial+motor+neurons+revealed+by+lentivirus-based+axonal+tracing.">Monosynaptic pathway from rat vibrissa motor cortex to facial motor neurons revealed by lentivirus-based axonal tracing.</a> The Journal of Neuroscience. 25 (36), 8250-8258 (2005).</li><li>Miyashita, E., Keller, A., Asanuma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Input+output+organization+of+the+rat+vibrissal+motor+cortex.">Input output organization of the rat vibrissal motor cortex.</a> Experimental Brain Research. 99 (2), 223-232 (1994).</li><li>Hsu, S. M., Soban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Color+modification+of+diaminobenzidine+(DAB)+precipitation+by+metallic+ions+and+its+application+for+double+immunohistochemistry.">Color modification of diaminobenzidine (DAB) precipitation by metallic ions and its application for double immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 30 (10), 1079-1082 (1982).</li><li>Hsu, S. M., Raine, L., Fanger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+avidin+biotin-peroxidase+complex+(ABC)+in+immunoperoxidase+techniques+a+comparison+between+ABC+and+unlabeled+antibody+(PAP)+procedures.">Use of avidin biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques a comparison between ABC and unlabeled antibody (PAP) procedures.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 29 (4), 577-580 (1981).</li><li>Wouterlood, F. G., Jorritsma Byham, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+anterograde+neuroanatomical+tracer+biotinylated+dextran+amine+comparison+with+the+tracer+Phaseolus+vulgaris+leucoagglutinin+in+preparations+for+electron+microscopy.">The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine comparison with the tracer Phaseolus vulgaris leucoagglutinin in preparations for electron microscopy.</a> Journal of Neuroscience Methods. 48 (1-2), 75-87 (1993).</li><li>Altschuler, S. M., Bao, X. M., Miselis, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+architecture+of+nucleus+ambiguus+motoneurons+projecting+to+the+upper+alimentary+tract+in+the+rat.">Dendritic architecture of nucleus ambiguus motoneurons projecting to the upper alimentary tract in the rat.</a> The Journal of Comparative Neurology. 309 (3), 402-414 (1991).</li><li>Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+mice+birds+and+men+the+mouse+ultrasonic+song+system+has+some+features+similar+to+humans+and+songlearning+birds.">Of mice birds and men the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and songlearning birds.</a> PLoS ONE. 7 (10), e46610 (2012).</li><li>Card, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+considerations+for+the+use+of+pseudorabies+virus+in+transneuronal+studies+of+neural+circuitry.">Practical considerations for the use of pseudorabies virus in transneuronal studies of neural circuitry.</a> Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 22 (6), 685-694 (1998).</li><li>Zuckerman, F. A., Zsak, L., Mettenleiter, T. C., Ben Porat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pseudorabies+virus+glycoprotein+gIII+is+a+major+target+antigen+for+murine+and+swine+virus-specific+cytotoxic+T+lymphocytes.">Pseudorabies virus glycoprotein gIII is a major target antigen for murine and swine virus-specific cytotoxic T lymphocytes.</a> Journal of Virology. 64 (2), 802-812 (1990).</li><li>Card, J. P., Enquist, L. W., Moore, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinvasiveness+of+pseudorabies+virus+injected+intracerebrally+is+dependent+on+viral+concentration+and+terminal+field+density.">Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density.</a> The Journal of Comparative Neurology. 407 (3), 438-452 (1999).</li><li>Pickard, G. E., Smeraski, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravitreal+injection+of+the+attenuated+pseudorabies+virus+PRV+Bartha+results+in+infection+of+the+hamster+suprachiasmatic+nucleus+only+by+retrograde+transsynaptic+transport+via+autonomic+circuits.">Intravitreal injection of the attenuated pseudorabies virus PRV Bartha results in infection of the hamster suprachiasmatic nucleus only by retrograde transsynaptic transport via autonomic circuits.</a> The Journal of Neuroscience. 22 (7), 2701-2710 (2002).</li><li>Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Herpesviruses+use+bidirectional+fast+axonal+transport+to+spread+in+sensory+neurons.">Herpesviruses use bidirectional fast axonal transport to spread in sensory neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466-3470 (2001).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

יש מספר נושאים שיש לקחת בחשבון בעת תכנון ניסוי באמצעות PRV152 4,21. והכי חשוב, pseudorabies הווירוס קטלני. כפי שהוזכר קודם לכן, קופים גדולים, כולל בני אדם אינם רגישים לזיהום, אך הטיפול מתאים חייב להיות מופעל כדי להגן על בעלי חיים אחרים. עכברים בוגרים לשרוד בדרך כלל 5-7 ימים לא...

מעקב Transsynaptic הפך לכלי רב עוצמה המשמש לניתוח efferents המרכזי המסדירות מטרות היקפיים באמצעות מעגלים רב-סינפטי. גישה זו הייתה בשימוש נרחב ביותר במוח המכרסמים על ידי ניצול וירוס pseudorabies הפתוגן החזירים (PRV), במיוחד הזן המוחלש PRV-ברטה שתוארה לראשונה בשנת 1961 12 כאן., אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי הייצוג בקליפת המוח המוטורי של שרירים ספציפיים או קבוצות שרירים באמצעות מתח pseudorabies רקומביננטי וירוס (PRV152) המבטא את גן כתב חלבון פלואורסצנטי ירוק המשופר (eGFP) 2. השיטה המתוארת מנצלת את ההתנהגות של וירוסי neurotropic, אשר מייצרים צאצאים זיהומיות שסינפסות הצלב להדביק נוירונים אחרים בתוך מעגל פונקציונלי 3,4,13. PRV152, שהוא isogenic עם PRV-ברטה, רק חוצה סינפסות retrogradely דרך הרצף ההיררכי של קשרים סינפטיים מאתר הזיהום 3.5 &lt;/ Sup&gt;. על ידי שליטה מדויקת באתר ההיקפי של זיהום ניתן להגביל את הכניסה של הווירוס למוח דרך משנה ספציפי של הנוירונים מוטוריים. כרצף הווירוס מדביק רשתות של תאי עצב מחוברים, וכתוצאה מכך הדפוס של אות eGFP בכל רחבי המוח לאחר מכן לפתור את הרשת של נוירונים המחוברים לתאים הנגועים בתחילה. יתרון נוסף של שימוש בוירוס למעקב עצבי הוא ההגברה של חלבון הכתב (eGFP במקרה זה) בתאים נגועים. הגברה אות זו מספקת רמת הרגישות המאפשרת זיהוי של תחזיות אפילו דלילות. לדוגמא, הקרנה דלילה מהקורטקס מוטורי vibrissa לתאי העצב מוטורי פנים השליטה השפם נמצאה בחולדות באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק הביע באופן ויראלי 14; מחקרים קודמים לא הצליחו למצוא הקרנה זה באמצעות קליעים נותבים קלאסיים בלי ההגברה גן כתב 11,15. לרוע המזל, רבים וקטורי מעקב נגיפיים, כמו זה המשמש במחקר המצוטט, לא לחצות סינפסות, וכך להגביל את השימוש בם לאיתור מעגלים רב-סינפטי. תוך הצגת יתרונות ברורים לזיהוי הרשת של תאים המשתתפים במעגל מנוע, הטבע ממוינות transsynaptic התחקות עם PRV-152 הופך את פרשנות חיבורים ספציפיים בתוך המעגל הקשה. לכן, אנו מציגים שיטה פשוטה לאימות חיבורים ספציפיים בתוך מעגלים זוהו באמצעות PRV-152 על ידי דו-תיוג באמצעות אמינים biotinylated dextran (BDA) ו- B למקטע רעלן הכולרה (CTB). השימוש בשילוב של BDA וCTB הוא גישה מבוססת היטב לאיתור קשרים בין קבוצות הספציפיות של נוירונים 6-8,11. כאשר נעשה שימוש יחד, ניתן דמיינו שני קליעים נותבים אלה באותו הסעיף באמצעות DAB שני צבעים (3, 3&#39;-diaminobenzidine) הליך 16. משקל מולקולרי גבוה BDA (BDA10kDa) נבחר לפרוטוקול זה כי זה yields תיוג מפורט של תהליכים עצביים 6,7,9. יתרונות נוספים של BDA10kDa כוללים את הבאים: זה מועבר באופן מועדף בכיוון אנטרוגרדית 6-8; זה יכול להיות מועבר על ידי iontophoretic או הזרקה בלחץ 6-8; ניתן דמיין ידי HRP-biotinylated avidin פשוט (ABC) הליך זה 17; וניתן הדמיתו על ידי אור או מיקרוסקופי אלקטרונים 6,7,18. זיהוי immunochemical של CTB עם peroxidase וDAB נבחר לתיוג מדרדר של motoneurons כי הוא יעיל לגילוי תהליכים תאיים כוללים דנדריטים דיסטלי 10,19. לאחרונה השתמשו בגישה זו כדי לזהות את המסלול המוטורי הקולי בעכברים ולחשוף חיבור דליל מקליפת המוח מוטורי ראשונית לתאי העצב המוטוריים בגרון, שהונח בעבר להיעדר 20.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoFil Microinjection System</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>IO-Kit</td>
			<td>34 gauge option</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic frame</td>
			<td>David Kopf Instruments</td>
			<td>Model 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>3-000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SM2010 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VetBond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isofluorane (Forane)</td>
			<td>Baxter&#160;</td>
			<td>1001936060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Betadine Swab Stick</td>
			<td>Cardinal Health</td>
			<td>2130-01</td>
			<td>200 count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotinylated dextran amines</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D-1956</td>
			<td>10,000 MW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pseudorabies virus</td>
			<td>Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University)</td>
			<td>PRV152</td>
			<td>Titer &#62; 1 x 107</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat)</td>
			<td>List Biological Laboratories</td>
			<td>703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin B Subunit</td>
			<td>List Biological Laboratories</td>
			<td>103B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-eGFP</td>
			<td>Open Biosystems</td>
			<td>ABS4528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3, 3&#39;-diaminobenzidine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D5905</td>
			<td>10 mg tablets</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023</td>
			<td>200 proof</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td>Dilute to 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3410</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine HCl &#38; Xylazine HCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K4138</td>
			<td>80 mg/mL &#38; 6 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nickel chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>339350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3619</td>
			<td>1.0 M; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5493</td>
			<td>10X; pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pentobarbital</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3761</td>
			<td>50 mg/mL dose</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylenes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>534056</td>
			<td>Histological grade</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optixcare opthalmic ointment</td>
			<td>Vet Depot</td>
			<td>1017992</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transsynaptic tracing from peripheral targets with pseudorabies virus followed by cholera toxin and biotinylated dextran amines double labeling

מעקב Transsynaptic הפך לכלי רב עוצמה המשמש לניתוח efferents המרכזי המסדירות מטרות היקפיים באמצעות מעגלים רב-סינפטי. גישה זו הייתה בשימוש נרחב ביותר במוח על ידי ניצול וירוס pseudorabies הפתוגן החזירים (PRV) 1. PRV לא להדביק קופים גדולים, כולל בני אדם, כך שזה הוא נפוץ ביותר במחקרים על יונקים קטנים, בעיקר מכרסמים. PRV152 מתח pseudorabies מבטא את חלבון פלואורסצנטי הגן המשופר הירוק (eGFP) כתב ורק חוצה סינפסות הפונקציונלית retrogradely דרך הרצף ההיררכי של קשרים סינפטיים מאתר הזיהום 2,3. יש זני PRV אחרים מאפייני מיקרוביולוגים שונים ויכולים להיות מועברים בשני הכיוונים (PRV-בקר וPRV-קפלן) 4,5. פרוטוקול זה יעסוק באופן בלעדי עם PRV152. על ידי אספקת הווירוס באתר היקפי, כגון שרירים, ניתן להגביל את כניסתם של הווירוס לתוך tהוא המוח באמצעות סדרה ספציפית של נוירונים. הדפוס וכתוצאה מכך של אות eGFP בכל רחבי המוח אז פותר את הנוירונים הקשורים לתאים הנגועים בתחילה. כטבע חילק של מעקב transsynaptic עם pseudorabies וירוס גורם לפרש חיבורים ספציפיים בתוך רשת מזוהה קשה, אנו מציגים שיטה רגישה ואמינה המעסיקה אמינים biotinylated dextran (BDA) ו- B למקטע רעלן הכולרה (CTB) למאשרים את הקשרים בין התאים המזוהים באמצעות PRV152. זיהוי immunochemical של BDA וCTB עם peroxidase וDAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine) נבחר בגלל שהם יעילים בחושפים תהליכים תאיים כוללים דנדריטים דיסטלי 6-11.

מכתים לeGFP צריך להתחיל להראות אות חלשה בנוירונים מוטוריים ראשוניים כ 72 שעות לאחר הזרקה לתוך שריר PRV152. השכפול והתחבורה transsynaptic של וירוס הם titer- ותלוי זמן 4. כ -90 שעות לאחר ההזרקה, צביעת eGFP תגלה אות חזקה בתאים נגועים כדי 2 nd. פעמים הישרדות ארוכות יותר יגלו -3...

Watch this Scientific Journal Video about Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling at JoVE.com

Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

Transsynaptic איתור ממטרות היקפית עם וירוס Pseudorabies אחריו רעלן כולרה ותיוג Biotinylated Dextran אמינים זוגי

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

transsynaptic-tracing-from-peripheral-targets-with-pseudorabies-virus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K Views.  Duke University Medical Center. Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

Video: Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג&#39;ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

תיוג מדרדר של תאים ברשתית גנגליון מבוגרים דג הזברה עם צבעי ניאון

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

איתור של הגנום והתמלילים של וירוס ה-DNA מתמיד ברקמות עצבית על ידי פלורסנט באתרו הכלאת שילוב עם Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis of primary cultures of neurons. We describe a set of procedures for: labeling newborn mice to be genotyped, rapid genotyping, and establishing low-density cultures of brain neurons from these mice. Individual mice are labeled by tattooing, which allows for long-term identification lasting into adulthood. Genotyping by the described protocol is fast and efficient, and allows for automated extraction of nucleic acid with good reliability. This is useful under circumstances where sufficient time for conventional genotyping is not available, e.g., in mice that suffer from neonatal lethality. Primary neuronal cultures are generated at low density, which enables imaging experiments at high spatial resolution. This culture method requires the preparation of glial feeder layers prior to neuronal plating. The protocol is applied in its entirety to a mouse model of the movement disorder DYT1 dystonia (&#916;E-torsinA knock-in mice), and neuronal cultures are prepared from the hippocampus, cerebral cortex and striatum of these mice. This protocol can be applied to mice with other genetic mutations, as well as to animals of other species. Furthermore, individual components of the protocol can be used for isolated sub-projects. Thus this protocol will have wide applications, not only in neuroscience but also in other fields of biological and medical sciences.

We describe procedures for labeling and genotyping newborn mice and generating primary neuronal cultures from them. The genotyping is rapid, efficient and reliable, and allows for automated nucleic-acid extraction. This is especially useful for neonatally lethal mice and their cultures that require prior completion of genotyping.

המהיר Genotyping של בעלי חיים ואחרי הקמת תרבויות עיקריות של נוירונים במוח

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

מותנה הגנטי Transsynaptic איתור במוח העכבר עוברי

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

אימונוהיסטוכימיה ותיוג מרובה עם נוגדנים ממיני Host אותו ללימוד למבוגרים בהיפוקמפוס נוירוגנזה

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

Explants מוח מונחי לייזר עצבי איתור ב

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of its labeling was affected by various factors, here, we provide a refined protocol for the application of high molecular weight BDA for studying optimal neural labeling in the central nervous system. After stereotactic injection of BDA into the ventral posteromedial nucleus (VPM) of the thalamus in the rat through a delicate glass pipette, BDA was stained with fluorescent streptavidin-Alexa (AF) 594 and counterstained with fluorescent Nissl stain AF500/525. On the background of green Nissl staining, the red BDA labeling, including neuronal cell bodies and axonal terminals, was more distinctly demonstrated in the somatosensory cortex. Furthermore, double fluorescent staining for BDA and the calcium-binding protein parvalbumin (PV) was carried out to observe the correlation of BDA labeling and PV-positive interneurons in the cortical target, providing the opportunity to study the local neural circuits and their chemical characteristics. Thus, this refined method is not only suitable for visualizing high quality neural labeling with the high molecular weight BDA through reciprocal neural pathways between the thalamus and cerebral cortex, but also will permit the simultaneous demonstration of other neural markers with fluorescent histochemistry or immunochemistry.

Here, we present a refined protocol to effectively reveal biotinylated dextran amine (BDA) labeling with a fluorescent staining method through a reciprocal neural pathway. It is suitable for analyzing the fine structure of BDA labeling and distinguishing it from other neural elements under a confocal laser scanning microscope.

שיפור היישום של משקל מולקולרי גבוה Biotinylated לתוספי אמין עבור היטל Thalamocortical עקיבה בחולדה

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

Live Imaging Followed by Single Cell Tracking to Monitor Cell Biology and the Lineage Progression of Multiple Neural Populations

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate decisions, will be crucial to design therapeutic strategies for many diseases affecting the nervous system. Current methods to track cell populations rely on their final outcomes in still images and they generally fail to provide sufficient temporal resolution to identify behavioral features in single cells. Moreover, variations in cell death, behavioral heterogeneity within a cell population, dilution, spreading, or the low efficiency of the markers used to analyze cells are all important handicaps that will lead to incomplete or incorrect read-outs of the results. Conversely, performing live imaging and single cell tracking under appropriate conditions represents a powerful tool to monitor each of these events. Here, a time-lapse video-microscopy protocol, followed by post-processing, is described to track neural populations with single cell resolution, employing specific software. The methods described enable researchers to address essential questions regarding the cell biology and lineage progression of distinct neural populations.

A robust protocol to monitor neural populations by time-lapse video-microscopy followed by software-based post-processing is described. This method represents a powerful tool to identify biological events in a selected population during live imaging experiments.

חיים הדמיה ואחריו תא בודד מעקב צג Cell Biology, ההתקדמות שושלת היוחסין של אוכלוסיות עצבית מרובים

Understanding the mechanisms that control critical biological events of neural cell populations, such as proliferation, differentiation, or cell fate ...

Isolation and Cultivation of Neural Progenitors Followed by Chromatin-Immunoprecipitation of Histone 3 Lysine 79 Dimethylation Mark

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. Additionally, epigenetic chromatin modifications, like histone methylation, have an important role for establishing and maintaining specific cell fates within this process. The vast majority of histone methylation occurs on the flexible histone tail, which is accessible to histone modifiers, erasers, and histone reader proteins. In contrast, H3K79 methylation is located in the globular domain of histone 3 and is implicated in different developmental functions. H3K79 methylation is evolutionarily conserved and can be found in a wide range of species from Homo sapiens to Saccharomyces cerevisiae. The modification occurs in different cell populations within organisms, including neural progenitors. The location of H3K79 methylation in the globular domain of histone 3 makes it difficult to assess. Here, we present methods to isolate and culture cortical progenitor cells (CPCs) from embryonic cortical brain tissue (E11.5-E14.5) or cerebellar granular neuron progenitors (CGNPs) from postnatal tissue (P5-P7), and to efficiently immunoprecipitate H3K79me2 for quantitative PCR (qPCR) and genome-wide sequencing.

We present an effective and reproducible method to isolate and culture neural progenitor cells from embryonic and postnatal brain tissue for chromatin immunoprecipitation (ChIP) of histone 3 lysine 79 dimethylation (H3K79me2) - a histone mark located within the globular domain of histone 3.

בידוד, טיפוח של אבות עצבית ואחריו Immunoprecipitation-כרומטין של היסטון 3 ליזין 79 Dimethylation מארק

Brain development is a complex process, which is controlled in a temporo-spatial manner by gradients of morphogens and different transcriptional programs. ...