我々は、喉頭手術技術を教えるため、神戸大学、日本の博士俊夫寺島に感謝し、PRV-バーサを供給するためのプリンストン大学のDr.リンEnquist。研究は、エーリッヒ・D・ジャービスとグスタボ・アリアガにNSF大学院研究フェローシップ賞にNIHのパイオニア賞DP1 OD000448によってサポートされていました。適切に入金前作からフィギュアは、ジャーナルの編集方針に従ってPLoSのONEオープンアクセスクリエイティブ・コモンズ・ライセンス（CC-BY）の下で使用されています。

注：すべての動物の手順を見直し、デューク大学施設内動物管理と使用委員会により承認されています。 1.保存仮性狂犬病ウイルス<ol><li>私たちは、1×10 9 PFU /メートルの力価でプリンストン大学で博士リンEnquistの研究室から生ウイルス（PRV152）を得ました。ウイルスを生成するためのプロトコルは、2を公開されています。 </li><li>適切なバイオセーフティ条件の下で-80℃でBSL-2バイオセーフティキャビネットや店舗内チューブあたり20μlのでウイルスを等分。 </li><li>注入の直前にPRVのアリコートを解凍します。 </li></ol>筋肉内に注射するための2外科の準備<ol><li>ケタミン - キシラジン（100ミリグラム/ kgのケタミン、10mg / kgのキシラジン）の筋肉内注射により全身麻酔を誘導し、イソフルランを使用して、適切な麻酔薬平面を維持します。 </li><li>眼用軟膏で角膜を保護します。 </li><li>トンを準備彼の髪をトリミングし、ベタジンのスクラブと70％のアルコール（3サイクルの最小値）を交互に手術部位を消毒することにより、無菌技術による手術部位。外科的領域をカバーするために、滅菌ドレープを使用してください。手順を通して無菌技術に準拠していることを確認してください。 </li><li>皮膚切開を行い、目的の筋肉を明らかにしました。例えば、輪状甲状喉頭筋にアクセスするためには、まず胸骨筋の上に重なる部分を除去する必要があります。 </li><li> VetBond組織接着剤を用いて任意の離断筋肉をシール。 </li></ol>筋肉にPRVの3インジェクション<ol><li> 34 Gステンレス鋼針を取り付け、解凍したてのPRV溶液で10μlのNanoFilのマイクロシステムをロードし、慎重に定位デバイスにマウントします。 </li><li>ゆっくりとデッドスペースをクリアし、そのソリューションは、マイクロチップを出ることを確認します。 bioharzard廃棄物などの流体捨てます。 </li><li>定位micropを使用ositioningデバイスは慎重に興味のある筋肉にマイクロチップを配置し、わずかな腫脹が表示されるまで、ゆっくりと筋肉を埋めます。注入速度は、注入されるべき筋肉とボリュームのサイズに依存して変化します。例えば、4 NL /秒の速度で200 NL（1μlの合計）の5回の注射は、輪状甲状筋を埋めるために同じサイトに1分間隔で行われるべきです。関心の次の筋肉に注射器（この場合は横方向の輪状披裂）を移動し、注入手順を繰り返します。一度だけ各筋肉を穿刺。 </li><li> 5分後にマイクロシリンジを撤回。 </li><li> VetBondの組織接着剤を使用して、筋膜の断線をシール。 </li><li>すべての注射が完了した後、VetBond組織接着剤を使用して創傷を閉じます。お近くのinstitional動物使用のガイドラインに応じて、縫合糸または創傷クリップを使用することができます。 </li><li>胸骨の横臥位まで動物を監視し、鎮痛、食料、水を提供し、yで必要とされるケア当社の機関の動物の使用に関するガイドライン。 </li><li> （この場合、2 回目にラベルを付ける皮質ニューロンを注文する90時間）実験的に決定生存期間の後、ペントバルビタール過剰投与により動物を犠牲にし、0.1M PBS中の4％ホルムアルデヒドに続いて0.9％生理食塩水で経灌流。 </li><li> 24時間4％ホルムアルデヒドで脳を削除し、ポスト固定してください。 </li><li>少なくとも48時間、30％スクロースを含有するリン酸緩衝液中で脳をCryoprotect。 </li></ol> eGFPの4免疫化学的検出<ol><li>スライディングミクロトーム上で40μmのセクションをカットし、0.1MのPBSに浮遊セクションを保存します。取り付けられた切片を染色する際に薄肉部は、例えば、30μmとするために、使用されてもよいです。 </li><li>光から保護し、PBS中0.3％H 2 O 2で30分間、切片をクエンチしました。 </li><li> VECTASTAINエリートキット（キットVE）から正常ヤギ血清、0.3％Tween20を含むPBSで30分間、切片中の非特異的抗原を遮断します。 </li><liRTで：&gt;インキュベートは（千1）ウサギ抗-EGFPで3.5時間のためのセクションをブロックされています。 </li><li>インクルードを室温でキットをVEから、その後ヤギ抗ウサギ二次抗体で1時間のためにそれらをインキュベート、5分間のセクションをPBSで3回洗浄します。 </li><li>インクルードは、製造元の指示に従ってキットをVEからABC溶液を調製します。 </li><li> 5分間、切片をPBSで3回洗浄し、その後ザをRTでキットVEからABC溶液中で1時間のためにそれらを反応させます。 </li><li> 0.05％DAB（3、3&#39;-ジアミノベンジジン）および0.015％のH 2 O 2を含有する 、10分間、リン酸緩衝液中で切片を3回洗浄し、リン酸緩衝液中で8分間、pH7.4のために開発します。 </li><li>スーパーフロストプラススラ​​イド上のマウント部と段階的アルコールシリーズ（70％、95％、100％、5分間、それぞれ100％）を介してそれらを脱水します。 </li><li> 2キシレン回洗浄（各5分）を​​介してのセクションをクリアし、パーマウント封入剤でスライドをカバースリップ。 </li><li>画像顕微鏡に取り付けられたセクション。 DAB反応製品insidE細胞は茶色に表示されます。デジタル化された画像は色が細かいプロセスを強調するために反転させることができます。 </li></ol> PRVトレースによって検出された脳領域へのトレーサーの注射用5。外科の準備<ol><li>ケタミン - キシラジン（100ミリグラム/ kgのケタミン、10mg / kgのキシラジン）の筋肉内注射により全身麻酔を誘導し、イソフルランを使用して、適切な麻酔薬平面を維持します。 </li><li>眼用軟膏で角膜を保護します。 </li><li>適切な定位フレームに頭部を固定してください。 </li><li>髪をトリミングし、ベタジンのスクラブと70％のアルコール（3サイクルの最小値）を交互にサイトを消毒することにより、無菌技術による手術部位を準備します。 </li><li>頭皮の切開を行い、目的の脳領域上の皮膚を撤回。 </li><li>適切な定位座標で小開頭手術を行います。例えば、laryngeally接続運動皮質の座標はでPRVトレースによって識別n個の成体マウスは、1.2ミリメートル、横方向とブレグマに0.2ミリメートル吻側です。 </li></ol>脳へのビオチン化デキストランアミンの6インジェクション<ol><li>滅菌生理食塩水の333μlのBDA 25mgの（10,000 MW）を溶解することにより、7.5％のビオチン化デキストランアミン（BDA）を準備します。 </li><li>計画された注射用の十分なBDA溶液でNanoject IIマイクロピペットシステムをロードします。 </li><li>ゆっくりとデッドスペースをクリアし、そのソリューションは、マイクロピペットチップを出ていることを確認します。 </li><li>定位微細位置決め装置を使用して、慎重に関心のある脳領域にマイクロピペットの先端を下げ、ゆっくりBDAを注射します。領域の大きさに応じて、噴射率を標識するために調整します。例えば、4.6 NLの12注射は離れて0.2ミリメートル（吻側 - 尾側方向）は成体マウスでlaryngeally接続運動皮質をカバーするために、四つの異なる場所でも行われなければなりません。最終噴射量は、対象の脳領域の大きさに応じて調整されるべきです、ラベルは脳組織を通って、ラベルされたニューロンのプロセスに沿って拡散することにより、射出コアから広がる可能性があることを念頭に置いて。 </li><li>歯科用セメントを使用して開頭術を密封し、VetBond組織接着剤を使用して頭皮の傷を閉じます。 </li><li>胸骨の横臥位まで動物を監視し、鎮痛、食料、水を提供し、あなたの制度的動物使用のガイドラインによって要求されるように気になります。 </li></ol>筋肉へのコレラ毒素サブユニットBの7インジェクション<ol><li>滅菌生理食塩水100μlのCTbを1mgを溶解させることによって、1％コレラ毒素サブユニットB（CTB）を準備します。 </li><li>六日の脳へのBDA注射後、筋肉にPRV注射のために上記のように外科手術の準備を行います。 </li><li> 34 Gステンレス鋼針を取り付け、CTbを溶液で10μlのNanoFilのマイクロシステムをロードし、慎重に定位デバイスにマウントします。 </li><li>以前デとして関心の筋肉（複数可）にマイクロインジェクションを実行しますPRVのためのスクライブ。 </li><li>胸骨の横臥位まで動物を監視し、鎮痛、食料、水を提供し、あなたの制度的動物使用のガイドラインによって要求されるように気になります。 </li><li>三日のCTB注射の後、ペントバルビタール過剰投与により動物を犠牲にし、0.1M PBS中の4％ホルムアルデヒドに続いて0.9％生理食塩水で経灌流。 </li><li> 24時間4％ホルムアルデヒドで脳を削除し、ポスト固定してください。 </li><li>少なくとも48時間、30％スクロースを含有するリン酸緩衝液中で脳をCryoprotect。 </li></ol>同じセクション内BDAとCTbを8.検出<ol><li>ミクロトーム上で40μmのセクションをカットし、0.1MのPBSに浮遊セクションを保存します。 </li><li>光から保護し、PBS中0.3％H 2 O 2で30分間、切片をクエンチしました。 </li><li>インクルードは、製造元の指示に従ってキットをVEからABC溶液を調製します。 </li><li>切片を5分間PBSで3回洗浄し、その後、室温でABC溶液中で1時間のためにそれらを反応させます。 </LI&gt; <li> 10分間、リン酸緩衝液中で切片を3回洗浄し、0.05％DAB（3、3&#39;-ジアミノベンジジン）、0.015％のH 2 O 2、及び0.05％の塩化ニッケルを含有し、リン酸緩衝液中で8分間、pH7.4のために開発します。細胞内でのDAB反応生成物は、黒表示されます。 </li><li> VECTASTAINエリートキットから正常ウサギ血清を0.3％Tween 20を含むPBS中で30分間ブロックセクション。 </li><li> RTで：インキュベートは、（10,000 1）ヤギ抗CTbをで2時間のセクションをブロックされています。 </li><li>セクション5分間PBS中で3回洗浄し、その後、インクルードをRTでキットをVEからウサギ抗ヤギ二次抗体で1時間のためにそれらをインキュベートします。 </li><li>インクルードは、製造元の指示に従ってキットをVEからABC溶液を調製します。 </li><li> 5分間、切片をPBSで3回洗浄し、その後、室温でABC溶液中で30分間、それらを反応させます。 </li><li> 0.05％DAB（3、3を含む、10分間のセクションをリン酸緩衝液で3回洗浄し、リン酸緩衝液中に最大8分、pHが7.4のために開発「-diaminobenzidine）と0.015％H 2 O 2。細胞内でのDAB反応生成物は茶色に表示されます。 </li><li>スーパーフロストプラススラ​​イド上のマウント部と段階的アルコールシリーズ（70％、95％、100％、5分間、それぞれ100％）を介してそれらを脱水します。 </li><li> 2キシレン回洗浄（各5分）を​​介してのセクションをクリアし、パーマウント封入剤でスライドをカバースリップ。 </li><li>画像顕微鏡に取り付けられたセクション。 </li></ol>

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No conflicts of interest declared.

PRV152 4,21を用いた実験を計画する際に考慮に入れなければならない多くの問題があります。最も重要なのは、仮性狂犬病ウイルスは致命的です。前述したように、ヒトを含む大型類人猿は、感染に対して感受性ではなく、適切なケアは、他の動物を保護するために行使されなければなりません。成体マウスは通常、5〜7日間の弱毒PRV152株を接種​​した後に生き残ります。したがって...

経シナプストレースは多シナプス回路を介して周辺の目標を調整する中央遠心性を分析するために使用される強力なツールとなっています。このアプローチは、最も広くブタ病原体仮性狂犬病ウイルス（PRV）、PRV-バーサは、最初1961 12に記載とりわけ弱毒株を利用して、げっ歯類の脳に使用されている。ここでは、特定の筋肉の運動皮質の表現を識別するためのプロトコルを提示強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）レポーター遺伝子2を発現する組換え仮性狂犬病ウイルス株（PRV152）を使用して、または筋肉群。記載されている方法は、クロスシナプスが機能回路3,4,13内の他のニューロンに感染することは感染性の子孫を生み出す神経向性ウイルスの挙動を利用しています。 PRV-バーサと同質遺伝子であるPRV152は、唯一の&lt;離れ感染部位3,5からのシナプス結合の階層的なシーケンスを逆行性シナプスを横切ります/ SUP&gt;。正確感染末梢部位を制御することにより、運動ニューロンの特定のサブセットを介して脳へのウイルスの侵入を制限することができます。ウイルス順次接続されているニューロンのチェーンに感染したように、脳全体のeGFP信号の得られたパターンは、その後、最初に感染した細胞に接続されているニューロンのネットワークを解決します。 ニューラルトレースのウイルスを使用することのさらなる利点は、感染細胞内のレポータータンパク質（この場合はEGFP）の増幅です。この信号増幅も疎突起の検出を可能にする感度のレベルを提供します。例えば、ウィスカーを制御顔面運動ニューロンへの感覚毛の運動野からのスパース投影がウイルス発現緑色蛍光タンパク質14を用いて、ラットで発見されました。以前の研究は、レポーター遺伝子増幅11,15なしで古典的なトレーサーを使用して、この投影法を見つけることができませんでした。残念ながら、多くのウイルスベクターがトレース挙げ研究で使用したものと同様に、それによって多シナプス回路をトレースするためのそれらの使用を制限し、シナプスを横断しません。 モータ回路に参加した細胞のネットワークを識別するための明確な利点を提示しながら、PRV-152を使用したトレースの経シナプスの分散性が困難な回路内の特定の接続を解釈することができます。したがって、我々は、ビオチン化デキストランアミン（BDA）およびコレラ毒素サブユニットB（CTB）を使用して、二重標識によってPRV-152を使用して識別回路内の特定の接続を検証するための簡単​​な方法を提示します。 BDAとCTbをの併用は、ニューロン6-8,11の特定のセットの間の接続をトレースするための十分に確立された手法です。一緒に使用する場合、これらの二つのトレーサーは、2色DAB（3、3&#39;-ジアミノベンジジン）手順16を使用して同じ部分に可視化することができます。高分子量BDA（BDA10kDaは）それYので、このプロトコルを選択しました神経プロセス6,7,9の詳細なラベル付けをields。 BDA10kDaのさらなる利点は、以下のものがあります。それは、優先的に順行方向6-8に搬送されます。それは、イオン導入や圧力注入6-8で配信することができます。それは、単純なアビジン-ビオチン化HRP（ABC）の手順17で視覚化することができます。それは、光または電子顕微鏡6,7,18によって画像化することができます。それは、遠位樹状突起10,19を含む細胞プロセスを明らかにするのに有効であるため、ペルオキシダーゼおよびDABとCTbをの免疫化学的検出は、運動ニューロンの逆行性標識のために選ばれました。我々は最近、マウスでのボーカル運動経路を特定するために、以前に20存在しないと仮定した喉頭運動ニューロンへの一次運動野から疎な接続を明らかにするために、このアプローチを使用していました。

<table><tbody><tr><td>Name of Reagent/Material</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>NanoFil Microinjection System</td><td>World Precision Instruments</td><td>IO-Kit</td><td>34 G option</td></tr><tr><td>Stereotaxic frame</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Model 900</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II Auto-Nanoliter Injector</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Sliding microtome</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>VetBond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane (Forane)</td><td>Baxter&amp;nbsp;</td><td>1001936060</td><td></td></tr><tr><td>Betadine Swab Stick</td><td>Cardinal Health</td><td>2130-01</td><td>200 count</td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Biotinylated dextran amines</td><td>Invitrogen</td><td>D-1956</td><td>10,000 MW</td></tr><tr><td>Pseudorabies virus</td><td>Laboratory of Dr. Lynn Enquist (Princeton University)</td><td>PRV152</td><td>Titer &gt;1 x 10&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>Anti-Cholera Toxin B Subunit (Goat)</td><td>List Biological Laboratories</td><td>703</td><td></td></tr><tr><td>Cholera Toxin B Subunit</td><td>List Biological Laboratories</td><td>103B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-eGFP</td><td>Open Biosystems</td><td>ABS4528</td><td></td></tr><tr><td>3, 3&#039;-diaminobenzidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>10 mg tablets</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Dilute to 4%</td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3410</td><td>30%</td></tr><tr><td>Ketamine HCl &amp;amp; Xylazine HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4138</td><td>80 mg/ml &amp;amp; 6 mg/ml</td></tr><tr><td>Nickel chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3619</td><td>1.0 M; pH 7.4</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>10x; pH 7.4</td></tr><tr><td>Sodium Pentobarbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td>50 mg/ml dose</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>Histological grade</td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6101 (rabbit); PK-6105 (goat)</td><td></td></tr><tr><td>Optixcare opthalmic ointment</td><td>Vet Depot</td><td>1017992</td><td></td></tr></tbody></table>

transsynaptic tracing from peripheral targets with pseudorabies virus followed by cholera toxin and biotinylated dextran amines double labeling

経シナプストレースは多シナプス回路を介して周辺の目標を調整する中央遠心性を分析するために使用される強力なツールとなっています。このアプローチは、最も広くブタ病原体仮性狂犬病ウイルス（PRV）1を利用して脳内で使用されています。 PRVは、ヒトを含む大型類人猿を、感染していないので、それは、最も一般的に小型哺乳類、特にげっ歯類での研究で使用されています。仮性狂犬病株PRV152は、高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）レポーター遺伝子を発現し、逆行だけ離れた感染部位から2,3シナプス結合の階層的なシーケンスを機能的シナプスを横切ります。他のPRV株は、異なる微生物学的特性を有し、両方向（PRV-ベッカーとPRV-カプラン）4,5に搬送することができます。このプロトコルは、PRV152を独占的に扱います。筋肉のような末梢部位にウイルスを送達することによって、それがTへのウイルスの侵入を制限することが可能です神経細胞の特定のセットを通じ、彼は脳。脳全体のeGFP信号の得られたパターンは、その後、最初に感染した細胞に接続されているニューロンを解決します。仮性狂犬病ウイルスを使用したトレースの経シナプスの分散性が困難な識別されたネットワーク内の特定の接続を解釈させるように、私たちは使用して識別されたセル間の接続を確認するために、ビオチン化デキストランアミン（BDA）およびコレラ毒素サブユニットB（CTB）を使用する高感度かつ信頼性の高い方法を提示PRV152。彼らは、遠位樹状突起6-11を含む細胞プロセスを明らかにするのに効果的であるため、ペルオキシダーゼおよびDAB（3、3&#39;-ジアミノベンジジン）とBDAとCTbをの免疫化学的検出を選択しました。

eGFPのための染色は、一次運動ニューロンの筋肉にPRV152を注入した後、約72時間の弱い信号を示す開始する必要があります。ウイルスの複製および経シナプス輸送はtiter-と時間依存4されています。約90時間の注入後、eGFPの染色は、2 番目の順に感染した細胞において強いシグナルを明らかにします。より長い生存期間は、3 回目を明らかにし、より高次の細胞が、生存?...

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Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

コレラ毒素とビオチン化デキストランアミン二重標識が続く仮性狂犬病ウイルスとペリフェラルターゲットからトレース経シナプス

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

transsynaptic-tracing-from-peripheral-targets-with-pseudorabies-virus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.6K ビュー.  Duke University Medical Center. Transsynaptic tracing has become a powerful tool for analyzing central efferents regulating peripheral targets through multi-synaptic circuits. Here we present a protocol that exploits the transsynaptic pseudorabies virus to identify and localize a functional brain circuit, followed by classical tract tracing techniques to validate specific connections in the circuit between identified groups of neurons.

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Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus (RABV), and more recently vesicular stomatitis virus (VSV), for studying circuitry, is becoming increasingly popular. These higher throughput methods use viruses that transmit between neurons in either the anterograde or retrograde direction.
Recently, a modified RABV for monosynaptic retrograde tracing was developed. (Figure 1A). In this method, the glycoprotein (G) gene is deleted from the viral genome, and resupplied only in targeted neurons. Infection specificity is achieved by substituting a chimeric G, composed of the extracellular domain of the ASLV-A glycoprotein and the cytoplasmic domain of the RABV-G (A/RG), for the normal RABV-G1. This chimeric G specifically infects cells expressing the TVA receptor1. The gene encoding TVA can been delivered by various methods2-8. Following RABV-G infection of a TVA-expressing neuron, the RABV can transmit to other, synaptically connected neurons in a retrograde direction by nature of its own G which was co-delivered with the TVA receptor. This technique labels a relatively large number of inputs (5-10%)2 onto a defined cell type, providing a sampling of all of the inputs onto a defined starter cell type.
We recently modified this technique to use VSV as a transsynaptic tracer9. VSV has several advantages, including the rapidity of gene expression. Here we detail a new viral tracing system using VSV useful for probing microcircuitry with increased resolution. While the original published strategies by Wickersham et al.4 and Beier et al.9 permit labeling of any neurons that project onto initially-infected TVA-expressing-cells, here VSV was engineered to transmit only to TVA-expressing cells (Figure 1B). The virus is first pseudotyped with RABV-G to permit infection of neurons downstream of TVA-expressing neurons. After infecting this first population of cells, the virus released can only infect TVA-expressing cells. Because the transsynaptic viral spread is limited to TVA-expressing cells, presence of absence of connectivity from defined cell types can be explored with high resolution. An experimental flow chart of these experiments is shown in Figure 2. Here we show a model circuit, that of direction-selectivity in the mouse retina. We examine the connectivity of starburst amacrine cells (SACs) to retinal ganglion cells (RGCs).

A method of tracing synaptically connected neurons is described. We use TVA specificity of an upstream cell to probe whether a cell population of interest receives synaptic input from genetically defined cell types.

遺伝的に定義された神経回路のトレースウイルス

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

神経科学

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

マウス胎児の脳のトレース条件付き遺伝経シナプス

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake through electroporation in brain explants with targeted laser illumination and matching filter goggles during the procedure. The described technique of in vitro electroporation by itself yields relatively good visual control for targetting certain areas of the brain. By combining it with laser excitation of fluorescent genetic markers and their read-out through band-passing filter goggles, which can pick up the emissions of the genetically labeled cells/nuclei and the fluorescent tracing dye, a researcher can substantially increase the accuracy of injections by finding the area of interest and controlling for the dye-spread/uptake in the injection area much more efficiently. In addition, the laser illumination technique allows to study the functionality of a given neurocircuit by providing information about the type of neurons projecting to a certain area in cases where the GFP expression is linked to the type of transmitter expressed by a subpopulation of neurons.

We describe a technique to label neurons and their processes via anterograde or retrograde tracer injections into brain nuclei using an in vitro preparation. We modified an existing method of in vitro tracer electroporation by taking advantage of fluorescently labeled mouse mutants and basic optical equipment in order to increase labeling accuracy.

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon microscopy in Thy1-GFP transgenic mouse line. This approach creates a possibility to investigate the correlation of behavioural manipulations with changes in neuronal morphology in vivo.
The cranial window implantation procedure was considered to be limited only to the easily accessible cortex regions such as the barrel field. Our approach allows visualization of neurons in the highly vascularized RSC. RSC is an important element of the brain circuit responsible for spatial memory, previously deemed to be problematic for in vivo two-photon imaging.
The cranial window implantation over the RSC is combined with an injection of mCherry-expressing recombinant adeno-associated virus (rAAVmCherry) into the dorsal hippocampus. The expressed mCherry spreads out to axonal projections from the hippocampus to RSC, enabling the visualization of changes in both presynaptic axonal boutons and postsynaptic dendritic spines in the cortex. 
This technique allows long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in mouse retrosplenial cortex using in vivo two photon microscopy in Thy1-GFP transgenic line. This approach is combined with injection of mCherry-expressing adeno-associated virus into dorsal hippocampus. These techniques allow long-term monitoring of experience-dependent structural plasticity in RSC.

同時2光子<em&gt;インビボ</emマウス脳梁膨大後部皮質におけるシナプス入力とシナプス後ターゲットの&gt;イメージング

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

Large-scale Reconstructions and Independent, Unbiased Clustering Based on Morphological Metrics to Classify Neurons in Selective Populations

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a comprehensive survey of the morphological characteristics observed among a selective neuronal population. Combination of these techniques constitutes a novel approach for the collection and analysis of neuroanatomical data. Together, these techniques enable large-scale, and therefore more comprehensive, sampling of selective neuronal populations and establish unbiased quantitative methods for describing morphologically unique neuronal classes within a population.
The protocol outlines the use of modified rabies virus to selectively label neurons. G-deleted rabies virus acts like a retrograde tracer following stereotaxic injection into a target brain structure of interest and serves as a vehicle for the delivery and expression of EGFP in neurons. Large numbers of neurons are infected using this technique and express GFP throughout their dendrites, producing &#34;Golgi-like&#34; complete fills of individual neurons. Accordingly, the virus-mediated retrograde tracing method improves upon traditional dye-based retrograde tracing techniques by producing complete intracellular fills.
Individual well-isolated neurons spanning all regions of the brain area under study are selected for reconstruction in order to obtain a representative sample of neurons. The protocol outlines procedures to reconstruct cell bodies and complete dendritic arborization patterns of labeled neurons spanning multiple tissue sections. Morphological data, including positions of each neuron within the brain structure, are extracted for further analysis. Standard programming functions were utilized to perform independent cluster analyses and cluster evaluations based on morphological metrics. To verify the utility of these analyses, statistical evaluation of a cluster analysis performed on 160 neurons reconstructed in the thalamic reticular nucleus of the thalamus (TRN) of the macaque monkey was made. Both the original cluster analysis and the statistical evaluations performed here indicate that TRN neurons are separated into three subpopulations, each with unique morphological characteristics.

This protocol describes large-scale reconstructions of selective neuronal populations, labeled following retrograde infection with a modified rabies virus expressing fluorescent markers, and independent, unbiased cluster analyses that enable comprehensive characterization of morphological metrics among distinct neuronal subclasses.

大規模な再建と選択的集団のニューロンを分類するために形態学的指標に基づいて独立、不偏クラスタリング

This protocol outlines large-scale reconstructions of neurons combined with the use of independent and unbiased clustering analyses to create a ...

Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of its labeling was affected by various factors, here, we provide a refined protocol for the application of high molecular weight BDA for studying optimal neural labeling in the central nervous system. After stereotactic injection of BDA into the ventral posteromedial nucleus (VPM) of the thalamus in the rat through a delicate glass pipette, BDA was stained with fluorescent streptavidin-Alexa (AF) 594 and counterstained with fluorescent Nissl stain AF500/525. On the background of green Nissl staining, the red BDA labeling, including neuronal cell bodies and axonal terminals, was more distinctly demonstrated in the somatosensory cortex. Furthermore, double fluorescent staining for BDA and the calcium-binding protein parvalbumin (PV) was carried out to observe the correlation of BDA labeling and PV-positive interneurons in the cortical target, providing the opportunity to study the local neural circuits and their chemical characteristics. Thus, this refined method is not only suitable for visualizing high quality neural labeling with the high molecular weight BDA through reciprocal neural pathways between the thalamus and cerebral cortex, but also will permit the simultaneous demonstration of other neural markers with fluorescent histochemistry or immunochemistry.

Here, we present a refined protocol to effectively reveal biotinylated dextran amine (BDA) labeling with a fluorescent staining method through a reciprocal neural pathway. It is suitable for analyzing the fine structure of BDA labeling and distinguishing it from other neural elements under a confocal laser scanning microscope.

トレースのラットにおける視床皮質投射のビオチン標識デキストランの高分子量アミンの運用の改善

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

An Optical Assay for Synaptic Vesicle Recycling in Cultured Neurons Overexpressing Presynaptic Proteins

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane proteins become exposed at the cell surface. One of these proteins is Synaptotagmin-1 (Syt1). An antibody directed against the luminal domain of Syt1, once added to the culture medium, is taken up during the exo-endocytotic cycle. This uptake is proportional to the amount of SV recycling and can be quantified through immunofluorescence. Here, we combine Syt1 antibody uptake with double transfection of cultured hippocampal neurons. This allows us to (1) localize presynaptic sites based on expression of recombinant presynaptic marker Synaptophysin, (2) determine their functionality using Syt1 uptake, and (3) characterize the targeting and effects of a protein of interest, GFP-Rogdi.

We describe an optical assay for synaptic vesicle (SV) recycling in cultured neurons. Combining this protocol with double transfection to express a presynaptic marker and protein of interest allows us to locate presynaptic sites, their synaptic vesicle recycling capacity, and determine the role of the protein of interest.

シナプス小胞の培養神経細胞シナプス蛋白質の過剰発現でリサイクルのため光アッセイ

At active presynaptic nerve terminals, synaptic vesicles undergo cycles of exo- and endocytosis. During recycling, the luminal domains of SV transmembrane ...

Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a premise for determining the role of neuron types within a neural circuit, and their significance in information encoding relative to learning. Likewise, the method can be used to test the physiological significance of two or more connected brain regions in awake and anesthetized animals. The current study demonstrates how VTA glutamate neurons modulate the firing rate of putative pyramidal neurons in the CA1 (hippocampus) of anesthetized mice. This protocol employs adeno-associated virus (AAV)-dependent labeling of VTA glutamate neurons for the tracing of VTA presynaptic glutamate terminals in the layers of the hippocampus. Expression of light-controlled opsin (channelrhodopsin; hChR2) and fluorescence protein (eYFP) harbored by the AAV vector permitted anterograde tracing of VTA glutamate terminals, and photostimulation of VTA glutamate neuron cell bodies (in the VTA). High-impedance acute silicon electrodes were positioned in the CA1 to detect multi-unit and single-unit responses to VTA photostimulation in vivo. The results of this study demonstrate the&#160;layer-dependent distribution of presynaptic VTA glutamate terminals in the hippocampus (CA1, CA3, and DG). Also, the photostimulation of VTA glutamate neurons increased the firing and burst rate of putative CA1 pyramidal units in vivo.

The current protocol demonstrates a simple method for tracing of ventral tegmental area (VTA) glutamate projections to the hippocampus. Photostimulation of VTA glutamate neurons was combined with CA1 recording to demonstrate how VTA glutamate terminals modulate CA1 putative pyramidal firing rate in vivo.

海馬の腹側テグメンタル領域グルタミン酸末端のインビボ解剖学的および機能的なトレース

Optogenetic modulation of neuron sub-populations in the brain has allowed researchers to dissect neural circuits in vivo and ex vivo. This provides a ...

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. Traditional in vitro electrophysiological techniques use electrical stimulation to evoke synaptic transmission. A major drawback of this method is its nonspecific nature; all axons in the region of the stimulating electrode will be activated, making it difficult to attribute an effect to a particular afferent connection. This issue can be overcome by replacing electrical stimulation with optogenetic-based stimulation. We describe a method for combining optogenetics with in vitro patch-clamp recordings. This is a powerful tool for the study of both basal synaptic transmission and synaptic plasticity of precise anatomically defined synaptic connections and is applicable to almost any pathway in the brain. Here, we describe the preparation and handling of a viral vector encoding channelrhodopsin protein for surgical injection into a pre-synaptic region of interest (medial prefrontal cortex) in the rodent brain and making of acute slices of downstream target regions (lateral entorhinal cortex). A detailed procedure for combining patch-clamp recordings with synaptic activation by light stimulation to study short- and long-term synaptic plasticity is also presented. We discuss examples of experiments that achieve pathway- and cell-specificity by combining optogenetics and Cre-dependent cell labeling. Finally, histological confirmation of the pre-synaptic region of interest is described along with biocytin labeling of the post-synaptic cell, to allow further identification of the precise location and cell type.

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Here we present a protocol describing viral transduction of discrete brain regions with optogenetic constructs to permit synapse-specific electrophysiological characterization in acute rodent brain slices.

エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

コレラ毒素とビオチン化デキストランアミン二重標識が続く仮性狂犬病ウイルスとペリフェラルターゲットからトレース経シナプス

要約

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この動画の章

遺伝的に定義された神経回路のトレースウイルス

マウス胎児の脳のトレース条件付き遺伝経シナプス

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

同時2光子

大規模な再建と選択的集団のニューロンを分類するために形態学的指標に基づいて独立、不偏クラスタリング

トレースのラットにおける視床皮質投射のビオチン標識デキストランの高分子量アミンの運用の改善

シナプス小胞の培養神経細胞シナプス蛋白質の過剰発現でリサイクルのため光アッセイ

海馬の腹側テグメンタル領域グルタミン酸末端のインビボ解剖学的および機能的なトレース

エクスビボ内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

軸索輸送の In Vivo イメージングのためのツールキットの拡張

コレラ毒素とビオチン化デキストランアミン二重標識が続く仮性狂犬病ウイルスとペリフェラルターゲットからトレース経シナプス

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遺伝的に定義された神経回路のトレースウイルス

マウス胎児の脳のトレース条件付き遺伝経シナプス

脳の外植片にレーザー誘導神経トレース

同時2光子

大規模な再建と選択的集団のニューロンを分類するために形態学的指標に基づいて独立、不偏クラスタリング

トレースのラットにおける視床皮質投射のビオチン標識デキストランの高分子量アミンの運用の改善

シナプス小胞の培養神経細胞シナプス蛋白質の過剰発現でリサイクルのため光アッセイ

海馬の腹側テグメンタル領域グルタミン酸末端のインビボ解剖学的および機能的なトレース

エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

軸索輸送の In Vivo イメージングのためのツールキットの拡張

エクスビボ内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ