우리는 제조 혁신을위한 Fraunhofer 센터의 엔지니어와 학생들에게 감사드립니다. 실험 시스템의 설계, 가공 및 자동화를 돕기 위해 안드레아스 프린젠, 홀거 워스, 더그 포스, 데이비드 차긴, 수동 슈 박사에게 감사드립니다. 줄리아 쿠카르츠, 멜라니 짐머만, 니코 크라에츠마르, 팀 검벨, 조쉬 비야누에바, 미노리 시미즈, 카타르지나 쿨리가 실험 프로토콜 및 데이터 수집 테스트에 도움을 주신 것에 감사드립니다. 우리는 셀 프로파일러의 이미지 분석 루틴의 개발에 도움을 하버드와 MIT의 넓은 연구소에서 이미징 플랫폼의 박사 앤 E. 목수와 마크 앤서니 브레이 박사를 인정합니다. 설명된 이 프로젝트는 국립 알레르기 및 감염증 연구소의 R21AI079474 및 1R01AI101446에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 알레르기 및 전염병 연구소 또는 국립 보건 원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 이 프로젝트는 또한 프라운호퍼 미국에 의해 지원되었다.

1. PDMS 레이어 만들기(그림 1)
<ol><li>10:1 비율로 PDMS 및 경화제를 적극적으로 혼합합니다. 거품을 제거하려면 실온에서 1 시간 동안 진공 챔버에서 점성 혼합물을 탈가스합니다.</li>
	<li>스케일로 알루미늄 금형 위에 PDMS를 천천히 붓습니다. 중앙에서 붓고 금형을 수평상태로 유지합니다. 핀을 지키지 않도록 하십시오. 목표 중량이 달성되면 붓는 것을 중지합니다. 우리의 금형에는 PDMS 4 g과 경화 시약 0.4 g가 필요합니다.
</li>
	<li>오븐 내부의 금형을 평평하게 하고 밤새 37°C에서 치료합니다. 대체 경화 시간은 60°C에서 2시간 또는 90°C에서 1시간입니다.
</li>
	<li>경화 된 PDMS 층을 금형 가장자리를 따라 해부하고 조심스럽게 집게 한 쌍으로 금형 표면에서 벗겨냅니다. 70% 에탄올과 Q-tip으로 금형 표면을 청소합니다.</li>
</ol>2. 그림 2에 따라 흐름 셀을 조립합니다.
유리 슬라이드를 갖춘 PDMS의 표준 조립은 두 표면의 산소 플라즈마 처리를 통해 수행되며 PDMS와 현미경 유리 슬라이드 사이의 누출없는 결합을 보장합니다. 제시된 프로토콜에서, 플라즈마 처리는 유리 슬라이드에 화학 코팅을 파괴할 것입니다. 따라서 슬라이드는 플라즈마 처리가 아닌 압력 밀봉입니다.
<ol><li>유리 창을 유동 셀 포켓에 넣습니다.</li>
	<li>플로우 셀의 주머니 안쪽유리 창 위에 코팅된 유리 슬라이드를 놓고, 채널이 그 위에 내려다보이는 PDMS 층을 배치합니다. 채널 입력이 금속 판의 관통 구멍과 일치하는 방식으로 PDMS 슬라이드를 배치합니다. 레이어 사이에 공기를 부드럽게 밀어냅니다.</li>
	<li>PDMS가 유리 창을 향할 수 있도록 PDMS/유리 슬라이드 어셈블리를 뒤집습니다. PDMS 채널 입력을 금속 판의 관통 구멍과 겹칩니다.</li>
	<li>압력 플레이트를 위에 놓고 나사를 조입니다.</li>
	<li>조립된 유동 세포를 현미경 아래에 놓습니다. 현미경 배율을 60X로 설정하고 채널 위치를 미리 정렬합니다.</li>
</ol>3. 로그 단계 박테리아 준비
<ol><li>실험 전날: 세균 성 식민지와 2 % NaCl (MH2)을 포함하는 뮬러 힌턴 국물의 50 ml를 접종. 37 °C에서 하룻밤 250 rpm에서 흔들어. 하나 또는 두 개의 세균성 균주는 기술된 셋업을 위한 1개의 실험에서 공부될 수 있습니다.
</li>
	<li>실험 전: 하룻밤 박테리아 배양 50 μl을 MH2 배지 50ml에 섞는다. 박테리아가 로그 단계에 있는지 확인하기 위해 37 °C에서 3 시간 동안 250 rpm에서 흔들어.</li>
</ol>4. 실험 솔루션 구성 요소가 필요 하기 최소 10 분 전에 따뜻하게
<ol><li>실온에서 형광염료(5mM 스톡) 및 리조스타핀(10 μg/ml 스톡)을 해동한다.</li>
	<li>옥사실린 파우더를 실온으로 데우십시오.</li>
</ol>5. 세균 현탁액을 준비하고 적재합니다.
<ol><li>3 시간 하위 문화가 끝난 후 : 2 분 동안 1,650 x g에서 박테리아 배양 및 원심 분리기 10ml를 복용하십시오.</li>
	<li>상체를 제거하고 신선한 MH2 매체 1 ml에서 박테리아를 다시 중단하십시오.</li>
	<li>1ml 루어 잠금 주사기에 짧은 길이의 튜빙을 부착합니다. 주사기 튜빙을 1 ml의 미디어로 플러시합니다. 세균 현탁액에 그릴 때 기포를 피하기 위해 튜브에 약간의 미디어를 남겨 둡니다.</li>
	<li>주사기에 박테리아 타입 1의 0.7 ml를 로드합니다. 박테리아 유형 1로 유동 세포의 두 개의 채널을 채웁니다. 액체가 ca 후 채널의 반대편에 나타나는 것을 지켜보십시오. 150 μl. 채널의 투명성은 박테리아로 채워지면서 바뀝습니다.
</li>
	<li>여러 박테리아 유형을 실험하는 경우, 유동 세포의 두 개의 나머지 채널로 박테리아 유형 2에 대한 로딩 절차를 반복한다.</li>
	<li>인큐베이터 내부에 유동 셀을 37°C에서 45분 동안 배치하여 슬라이드 표면에 세균침착 및 부착을 허용합니다.</li>
</ol>6. 실험 용액을 준비하고 적재합니다.
<ol><li>형광염 육수(5mM)의 14 μl과 MH2 매체의 126 μl을 혼합하여 0.5mM형염염액 140μl을 준비한다.</li>
	<li>250 μg/ml 옥사실린의 최종 농도를 얻기 위해 MH2 매체의 40 ml에 옥사실린 10 mg을 희석.</li>
	<li>최종 농도0.25 μM 형광염과 0.7 ng/ml의 리조스타핀농도로 130ml의 제어 용액을 준비하십시오. 이렇게 하려면 형광 염료(0.5mMM), 리소스타핀 재고 의 9.12 μl(10 μg/ml) 및 MH2 미디어 130ml를 혼합하십시오.</li>
	<li>최종 농도0.25 μM 형광염, 0.7 ng/ml 의 리소스타핀 및 50 μg/ml 옥사실린의 최종 농도로 130ml의 항생제 용액을 준비하십시오. 이렇게 하려면 형광 염료(0.5mM), 리소스타핀 재고 9.12 μl(10 μg/ml), 옥사실린 26ml(250 μg/ml), MH2 미디어 104ml를 섞는다.</li>
	<li>제어 용액으로 60ml 주사기 2개와 항생제 용액으로 60ml 주사기 2개를 채웁니다. 시약의 빛 유발 저하를 방지하기 위해 알루미늄 호일에 감싼 솔루션을 유지합니다. 튜빙의 플러시로 인한 손실을 설명하기 위해 주사기를 과다 채웁니다.
</li>
	<li>주사기에서 기포를 제거합니다. 실험용 솔루션으로 팁에 입력 튜브를 부착하고 채웁니다.</li>
	<li>펌프에 주사기를 장착합니다. 가장 작은 볼륨으로 주사기를 먼저 배치한 다음 플런저 위치를 잠급합니다. 나머지 주사기에 펌프에 맞고 필요에 따라 플런지를 압박합니다.</li>
	<li>펌프 속도를 1ml/분으로 설정하고 펌프 볼륨을 60ml로 설정합니다. 모든 주사기에서 꾸준한 액체 스트림이 보일 때까지 펌프와 함께 플러시하십시오.</li>
</ol>7. 현미경으로 유동 셀 설정
<ol><li>원심분리기에서 유동셀을 제거하고 현미경단계(도 3)에장착한다.</li>
	<li>각 흐름 셀 채널(채널당 하나의 입력/1 출력)에 입력/출력 튜브를 연결합니다. 4개의 다른 컨테이너로 출력을 수집하면 개별 채널 출력 볼륨을 측정할 수 있습니다.</li>
</ol>8. 60분 실험 실행
<ol><li>2.5단계에서 미리 정렬된 위치를 확인합니다. 현미경 필드 필드가 채널에 중심이 없거나 초점이 바 절되지 않은 경우 설정을 조정하고 새 위치를 저장합니다. 적재된 박테리아의 고밀도로 인해 흐름이 시작되기 전에 정밀한 초점 집중이 불가능할 수 있습니다.
</li>
	<li>위상 대비 획득 시간을 10msec로 설정하고 형광 획득 시간을 1,600msec로 설정합니다.</li>
	<li>흐름을 시작하기 전에 각 위치에 대한 위상 대비 및 형광 이미지를 가져옵니다. 이것은 로드된 세균성 조밀도의 질적 추정치를 제공합니다.
</li>
	<li>액체 흐름을 시작하고 현미경이 채널의 바닥에 초점을 맞추고 있는지 즉시 확인합니다.</li>
	<li>흐름의 첫 번째 분 이내에 대상 영역의 위상 대비 및 형광 이미지를 가져 가라.</li>
	<li>첫 번째 이미지 세트 가 60분까지 이미지를 수집합니다. 필요에 따라 다시 초점을 맞춥니다.</li>
</ol>9. 흐름 셀 소독
<ol><li>비커(100ml)로 표백제 용액을 10% 만듭니다. 혼합물 의 10ml와 함께 4 x 20ml 주사기를 채웁니다. 주사기를 디플로우하고 유량 셀에 부착합니다. 채널이 박테리아가 명확해지려면 ~ 1-2 분이 소요됩니다.
</li>
	<li>펌프 속도를 1ml/분으로 설정하고 펌프 볼륨을 3ml로 설정합니다. 3분 동안 실행하십시오.</li>
	<li>4 x 60ml 주사기를 60ml의 DI 워터로 채웁니다. 주사기를 디플로우하고 유량 셀에 부착합니다.</li>
	<li>펌프 속도를 1ml/분으로 설정하고 펌프 볼륨을 30ml로 설정합니다. 30분 동안 실행하십시오.</li>
	<li>현미경으로 채널 청소를 모니터링합니다.</li>
	<li>흐름 셀을 분해합니다. 사용 된 에폭시 슬라이드를 폐기하십시오. 20 분 동안 DI 물에 유동 셀 성분을 담급니다.</li>
</ol>10. 이미지를 분석하고 데이터를 생성합니다.
<ol><li>각 이미지의 박테리아 수를 계산합니다. 오픈 액세스 소프트웨어인 CellProfiler는 배치 이미지처리(16)를수행하는 데 사용됩니다. CellProfiler 루틴의 높은 수준의 윤곽선은 표 1에요약됩니다. 상 대비 영상(Np)에존재하는 박테리아의 수는 총 세균 수를 준다. 형광 이미지(Nf)에서보이는 박테리아의 수는 죽은 박테리아의 수를 준다.
</li>
	<li>시간의 함수로 정규화된 세균 세포 사멸 비율을 계산합니다.<ol>
<li>개별 이미지에 대한 Nf 및 Np를 데이터 분석 소프트웨어로 가져옵니다.</li>
		<li>t = T에서 분획(Nf/N p)에의해 주어진 특정 시점에서 각 채널의 죽은 박테리아의 분수를 계산합니다.</li>
		<li>실험 의 시작 부분에 존재하는 죽은 박테리아의 분획을 빼는다 (t = 1 분) 대조군 및 실험 채널 모두에 대한.</li>
		<li>다음 방정식으로 각 시점에서 실험 채널에 존재하는 것에서 제어 채널에 존재하는 죽은 박테리아의 분수를 뺍니다. <img alt="Data Analysis Equation" fo:content-width="6in" height="217" src="/files/ftp_upload/50828/Data_analysis_equation.png" width="620">
</li>
		 <li>실험 과정에 대한 그래프 DP규범 대 t. 세포 사망률이 1% 이상인 샘플은 취약하다고 판단되는 반면, 0.5% 미만의 사망은 저항성을 나타냅니다. 이 두 컷오프 사이에 떨어지는 백분율은 확정되지 않은 것으로 간주되며 샘플을 다시 테스트해야 합니다.
</li>
		<li>스프레드시트를 사용하여 다양한 실험의 결과를 요약하고 분석합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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미세 유체 방법은 특허 출원 중입니다: 사우어-버지 A, 샤론 A, 칼라쉬니코프 M, Wirz H, 발명가; 세균성 항생제 내성/감수성 특허 PCT/US10/33523의 신속한 검출을 위한 방법 및 장치.

제시된 프로토콜은 메티실린에 민감하고 메티실린 내성 황색포도상구균 10균을가진 실험 세트에서 검증되고 최적화되었다. 따라서 수정없이이 프로토콜은 세균성 세포 벽 생합성에 영향을 미치는 작용 메커니즘을 가진 S. 아우레우스 및 기타 항생제의 다른 균주에 직접 적용해야합니다. S. 아우레우스 이외의 박테리아 유형은 스트레스 매개 변수의 변이를 요구할 수 ?...

세균성 저항의 상승은 최후의 수단의 우리의 약을 보호하기 위하여 빠른 표현형 기지를 둔 항생제 감수성 시험에 대한 필요를 강화합니다. 표준 감수성 검사는 여러 (8-24) 시간이 걸리는 항생제의 존재에서 세균 성장 억제에 기초한다. 우리는 항생제의 작용을 가속화하기 위하여 생합성 통로의 긴장 활성화에 의존하는 미세유체 플랫폼에 새로운 항생제 감수성 시험을 개발했습니다.
미세 유체 척도에서 항생제 감수성 검사는 박테리아의 작은 숫자를 필요로하기 때문에 효과적인 샘플 사용의 이점을 수행합니다. 또한, 미세 유체 장치는 다중 조건1,2에서여러 샘플을 테스트하기 위해 멀티플렉스될 수 있다. 최근에는 항생제 감수성 검사를 위한 다수의 미세유체 방법이3-9로보고되고 있다. 이러한 방법에서, 박테리아는 나노 및 피콜리터 물방울3,7,미세 유체 채널4-6,8의전체 부피에서, 또는 채널9의바닥 표면에 전기적으로 국한된 단일 박테리아로서 재배된다. 이 시험은 미세 유체 채널에서 수행되지만, 그들은 모두 기존의 방법과 유사한 항생제의 존재와 부재에서 미생물 성장을 모니터링합니다. 성장 측정은 광학 밀도, pH 민감한 염료 또는 밝은 필드/위상 대비 또는 형광 이미지를 통해 수행됩니다. 이러한 테스트 중 일부는 전통적인 방법 보다 빠른, 그들은 각각 수동적으로 항생제 저항을 감지. 즉, 이러한 방법은 여전히 최종 판독으로 세균 성장을 기다려야 하는 사용자를 요구합니다.
대조적으로, 우리는 항생제에 민감한 생화학적 경로를 활성화하기 위해 전단과 효소 스트레스의 조합을 사용하는 방법을개발했다(10). 그 항생제로 스트레스 박테리아에 도전하는 것은 더 빠른 감수성 시험을 만듭니다. 항생제에 저항하는 박테리아는 스트레스가 많은 조건을 견딜 수 있습니다. 반면에, 민감성 박테리아는 결합된 응력에 의해 급속하게 죽습니다. 형광 죽은 세포 얼룩을 사용하여 현미경 검사법에 의해 측정 된 1 시간 후에 세포 사멸의 비율은 박테리아의 표현형을 정의합니다 (저항성 대 민감성).
우리의 방법의 성공적인 구현을 위해, 박테리아는 미세 유체 채널의 바닥 표면에 고정되어야합니다. 이러한 방식으로 박테리아는 단일 평면에서 현미경으로 다양한 스트레스를 받고 동시에 심을 수 있습니다. 코팅 된 현미경 유리 슬라이드는 박테리아 고정에 사용됩니다. 슬라이드는 비특이적 단백질 결합을 위해 에폭화물 군을 가진 제조 업체에 의해 미리 코팅됩니다. 세균성 표면 단백질에 이러한 에산화물의 비특이적 결합은 박테리아를 슬라이드 표면에 공유합니다.
균주는 항생제의 부재 (대조군) 및 존재 (실험)에서 동일한 조건 (전단 + 효소 스트레스)에서 테스트됩니다. 각 채널의 위상 대비 및 형광 현미경 사진은 1 시간 동안 2 분마다 자동으로 촬영됩니다. 저항 지정은 그 때 대조군 채널에 있는 죽은 박테리아의 백분율을 대조채널에 있는 것과 비교하여 만들어집니다. 1 시간 후에, 세포 죽음 백분율이 1% 보다 큰 견본은 저항의 표시인 동안, 영향을 받기 쉬운 것으로 간주됩니다. 이 두 컷오프 사이에 떨어지는 백분율은 확정되지 않은 것으로 간주되며 샘플을 다시 테스트해야 합니다.
미세 유체 채널은 PDMS에 정의되며, 이는 미세 유체장치(11)에대한 선택의 재료이다. PDMS는 광범위한 파장, 생체 적합성, 불활성, 가스에 투과성이 있는 광활한 범위에서 광학적으로 투명하며 액체에 대한 투과성이 낮습니다. 따라서 이러한 실험에 적합합니다.
기계적/전단 응력은 고정된 박테리아를 통해 실온 매체의 흐름에 의해 생성됩니다. (참고: 미디어를 37°C로 온난화하는 것은 분석 결과에 큰 영향을 미치지 않습니다.) 자동 주사기 펌프는 1 ml/분의 유속으로 미세 유체 채널(200 μm x 400 μm)을 통해 미디어(사구 얼룩 +/-항생제 포함)를 강제하여 6.25kPa의 전단 력 또는 전단 속도 6,000초-1을제공합니다. 이 비율은 황색포도상구균에이전에 연구된 전단 응력과 같거나 초과합니다.
효소, 리소스타핀은 황색포도상구균 세포벽에 직접적인 손상을 일으키기 때문에 예비 실험을 위해 선택되었다. 리소스타핀(0.7 ng/ml)의 농도는 세균성 세포벽 손상을 유발하기에 충분했지만, 실험 기간 내에 항생제 없이 세균세포사멸을 유발하는 것만으로는 충분하지 않았다. Lysostaphin세균성 감수성의 정확한 지정을 위해 필요하지 않습니다 그러나 그것은 영향을 받기 쉬운 긴장에 있는 증가한 세포 죽음으로 이끌어 내는 결과를 증강않습니다. 대조적으로, 전단 응력은 분석 기능에 중요합니다. 메티실린에 민감한 황색포도상구균균이 흐름이 없는 경우 리소스타핀과 옥사실린으로 치료될 때, 실험 과정에서 세포 사멸이 기록되지 않는다.
세포 생존가능성은 형광사세포얼룩(12)으로모니터링된다. 염료의 선택은 손상된 세포만 선택적으로 얼룩지게 하는 능력, 살아있는 세포에 대한 독성, 그리고 낮은 배경 형광에 기초하여, 추가 단계없이 세포 미디어에 직접 첨가할 수 있었습니다. 0.25 μM의 형광염 염료 농도의 선택은 형광 분광광에 대한 1.6초 노출 시간 동안 허용 가능한 신호 수준을 달성하기 위한 것이었다.
베타 락탐, 옥사실린, 우리의 예비 연구에서 사용 되었다. 메티실린 내성 S. 아우레우스(MRSA) 종은 옥사실린에 내성이 있으며 실험 기간 내에 상당한 세포 사멸을 나타내지 않습니다. 50 μg/ml의 농도는 예비 연구에서 결정되었다. 항생제의 낮은 농도는 저항과 영향을 받기 쉬운 긴장 사이 더 적은 분리를 주었습니다, 높은 농도는 실험 결과에 있는 감사한 다름을 일으키는 원인이 되지 않는 동안.
우리는 이전에 세포벽 생합성을 억제하는 항생제로 세균성세포벽(13)에 직접 영향을 미치는 기계적 및 효소 응력을 결합한 시험의 성공적인 개발에 대해보고하였다 14,15. 이러한 원칙 증명 실험은 MRSA 및 메티실린에 민감한 S. 아우레우스(MSSA)의 패널에서 수행되었다. 그러나, 적절 한 실험 매개 변수의 선택으로, 우리의 방법은 박테리아의 여러 종 및 항생제의 여러 클래스에 적용 해야 합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">SYTOX Green</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Invitrogen Corporation</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S7020</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Dead cell fluorescence stain</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">A9418-5G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Used for lysostaphin storage</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Sodium Acetate</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S8750-500G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Used for lysostaphin storage</td>
		</tr>
		<tr height="98">
			<td dir="LTR" height="98" style="height:98px;width:195px;">Lysostaphin&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Cell Sciences</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">CRL309A</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Arrives as 1 mg solid. For storage: Dissolve in 20 mM sodium acetate. Mix with BSA solution to final concentration of 1% BSA and 100 &#181;g/ml &#160;lysostaphin for storage&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Oxacillin salt</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrich, Inc</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">28221-1G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Antibiotic</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:195px;">Mueller Hinton Broth</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Fisher Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">DF0757-17-6</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">Sigma Aldrixh</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">S3014-500G</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">2% added to Mueller-Hilton broth prior to autoclaving</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">1 ml, Luer-lock syringe&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">14-823-2F</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:195px;">2 oz, Luer-lock syringe</td>
			<td dir="LTR" style="width:129px;">BD (Beckton, Dickinson and Comp.)</td>
			<td dir="LTR" style="width:136px;">309653 - 60 mL</td>
			<td dir="LTR" style="width:175px;">Overfill to ~65 ml</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Microscope</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Inverted Fluoresccence Microscope Olympus IX-70</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Cambridge Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">9349</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">60X, Fluorescence/Phase contrast objective</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Olympus Corp.</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">LCPlan F1 60x/0.70 Ph2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Retiga 12-bit monochrome CCD camera</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">QImaging</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">RET-4000R-F-M-12-C&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Microscope automation</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Shutters phase contrast/fluorescence</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H204/H202</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">X/Y Stage&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H107AENN</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Focus motor</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H122</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Joystick for XYZ control</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">CS152EF</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Proscan Controller</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">PRIOR Scientific</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">H3-XY2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Image Acquisition Software</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Flow Cell Assembly and PDMS</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Flow Cell</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1044</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Engineering drawings were produced by Fraunhofer CMI</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td dir="LTR" height="33" style="height:33px;width:329px;">Glass window</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1054</td>
			<td dir="LTR" rowspan="2" style="width:269px;">Glass window was cut to the proper size at Fraunhofer CMI</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td dir="LTR" height="33" style="height:33px;width:329px;">BOROFLOAT Window 50 mm x 50 mm</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Edmund Optics Inc.</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">NT48-543</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td dir="LTR" height="50" style="height:50px;width:329px;">Sealing plate</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">BU Scientific Instruments Facility</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1045</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Epoxide glass slide</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Arrayit Corporation</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">SuperEpoxy 2</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td dir="LTR" height="45" style="height:45px;width:329px;">PDMS master</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1053</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Master machined in aluminum or brass with UPM-0005 (ultrapresicion fly-cutting machine)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">PDMS slide design</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">Fraunhofer CMI</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">3333-1053</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Tubing</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;"></td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td dir="LTR" height="50" style="height:50px;width:329px;">Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16 in, PEEK, green&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">M-644-03</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Flow cell inputs/outputs are tapped for this ferrule</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Ferrule, Tinytight, 1/16 in, 6-40, .030 in TH, PEEK w/ SS lock ring, black</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">M-657</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Nut, Super flangeless Tinytight, headless, 1/16-1/32 in, 1/4-28, PEEK, natural</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-255</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Ferrule, Super Falngeless, 1/16 in, Tefzel (ETFE), yellow</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-259</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;">Fits Luer-lock adapter</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td dir="LTR" height="22" style="height:22px;width:329px;">Tubing, Teflon FEP, .030 in x 1/16 in x 20 ft, green&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">1520G</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td dir="LTR" height="34" style="height:34px;width:329px;">Adapter, quick connect female Luer to female 1/4-28, PEEK, red&#160;</td>
			<td dir="LTR" style="width:163px;">IDEX Health &#38; Science</td>
			<td dir="LTR" style="width:155px;">P-658</td>
			<td dir="LTR" style="width:269px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stress-induced antibiotic susceptibility testing on a chip

우리는 스트레스 기반 환경에서 항생제 감수성 검사를 위한 신속한 미세 유체 방법을 개발했습니다. 유체는 미세 유체 채널의 바닥에 고정 된 박테리아를 통해 고속으로 전달됩니다. 스트레스와 항생제의 존재에서, 박테리아의 취약 한 긴장 은 급속 하 게 죽는다. 그러나, 저항하는 박테리아는 이 스트레스가 많은 조건에서 살아남습니다. 이 방법의 뒤에 가설은 새로운: 항생제의 표적인 생화확적인 통로의 스트레스 활성화는, 항생제 감수성 시험을 가속화할 수 있습니다. 표준 항생제 감수성 검사 방법에 비해, 속도 제한 단계 - 세균 성장 - 항생제 적용 중에 생략된다. 이 방법의 기술적 구현은 표준 기술과 혁신적인 접근 방식의 조합입니다. 이 방법의 표준 부분에는 세균 배양 프로토콜, 폴리디메틸실록산(PDMS)의 미세 유체 채널 정의, 형광을 이용한 세포 생존 가능성 모니터링, 박테리아 계수에 대한 배치 이미지 처리 등이 포함됩니다. 이 방법의 혁신적인 부분은 기계적 응력 적용을 위한 배양 매체 흐름의 사용, 박테리아를 손상시키지 만 손상시키지 않는 효소의 사용, 세균 부착을 위한 미세어기 기판의 사용에 있다. 개발 된 플랫폼은 항생제 및 비 항생제 관련 약물 개발 및 테스트에 사용할 수 있습니다. 표준 세균현절 실험과 비교하여, 약물의 효과는 조절 기간 동안 반복적으로 켜고 끌 수 있다. 동일한 세균 집단의 반복적인 관찰은 동일한 실험의 과정을 통해 가능하다.

도 4에 제시된 데이터는 항생제 함유 미세 유체 채널에서 시간이 지남에 따라 취약한 황색포도상구균 균주의 반응을 보여줍니다. 1분에서 획득한 위상 대비 이미지는 1시간 실험의 끝에 그림 4A 및 B로 나타낸다. 분석된 1시간 데이터는 적색(5,828)으로 강조표시된 박테리아와 함께 도 4C로 도시된다. 해당 형광 이미지는 그림 4D</s...

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Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

우리는 급속한 항생제 감수성 시험을 위한 미세유체 플랫폼을 개발했습니다. 유체는 미세 유체 채널의 바닥에 고정 된 박테리아를 통해 고속으로 전달됩니다. 스트레스와 항생제의 존재에서, 박테리아의 취약 한 긴장 은 급속 하 게 죽는다. 그러나, 저항하는 박테리아는 이 스트레스가 많은 조건을 살아남을 수 있습니다.

칩에 스트레스 유발 항생제 감수성 테스트

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

stress-induced-antibiotic-susceptibility-testing-on-a-chip

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.3K 조회수.  Fraunhofer USA Center for Manufacturing Innovation. 우리는 급속한 항생제 감수성 시험을 위한 미세유체 플랫폼을 개발했습니다. 유체는 미세 유체 채널의 바닥에 고정 된 박테리아를 통해 고속으로 전달됩니다. 스트레스와 항생제의 존재에서, 박테리아의 취약 한 긴장 은 급속 하 게 죽는다. 그러나, 저항하는 박테리아는 이 스트레스가 많은 조건을 살아남을 수 있습니다.

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Lensless Fluorescent Microscopy on a Chip

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for high-throughput screening applications. This emerging technology platform has the potential to eliminate the need for bulky and/or costly optical components through the help of novel theories and digital reconstruction algorithms. Along the same lines, here we demonstrate an on-chip fluorescent microscopy modality that can achieve e.g., &lt;4&mu;m spatial resolution over an ultra-wide field-of-view (FOV) of &gt;0.6-8 cm2 without the use of any lenses, mechanical-scanning or thin-film based interference filters. In this technique, fluorescent excitation is achieved through a prism or hemispherical-glass interface illuminated by an incoherent source. After interacting with the entire object volume, this excitation light is rejected by total-internal-reflection (TIR) process that is occurring at the bottom of the sample micro-fluidic chip. The fluorescent emission from the excited objects is then collected by a fiber-optic faceplate or a taper and is delivered to an optoelectronic sensor array such as a charge-coupled-device (CCD). By using a compressive-sampling based decoding algorithm, the acquired lensfree raw fluorescent images of the sample can be rapidly processed to yield e.g., &lt;4&mu;m resolution over an FOV of &gt;0.6-8 cm2. Moreover, vertically stacked micro-channels that are separated by e.g., 50-100 &mu;m can also be successfully imaged using the same lensfree on-chip microscopy platform, which further increases the overall throughput of this modality. This compact on-chip fluorescent imaging platform, with a rapid compressive decoder behind it, could be rather valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

A lensless on-chip fluorescent microscopy platform is demonstrated that can image fluorescent objects over an ultra-wide field-of-view of e.g., &#62;0.6-8 cm2 with &#60;4&#956;m resolution using a compressive sampling based decoding algorithm. Such a compact and wide-field fluorescent on-chip imaging modality could be valuable for high-throughput cytometry, rare-cell research and microarray-analysis.

칩에 Lensless 형광 현미경

On-chip lensless imaging in general aims to replace bulky lens-based optical microscopes with simpler and more compact designs, especially for ...

연구

생체공학

On-Chip Endothelial Inflammatory Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial dysfunction. However, early functional changes in endothelium that signify an individual's level of risk are not directly assessed clinically to help guide therapeutic strategy. Moreover, the regulation of inflammation by local hemodynamics contributes to the non-random spatial distribution of atherosclerosis, but the mechanisms are difficult to delineate in vivo. We describe a lab-on-a-chip based approach to quantitatively assay metabolic perturbation of inflammatory events in human endothelial cells (EC) and monocytes under precise flow conditions. Standard methods of soft lithography are used to microfabricate vascular mimetic microfluidic chambers (VMMC), which are bound directly to cultured EC monolayers.1 These devices have the advantage of using small volumes of reagents while providing a platform for directly imaging the inflammatory events at the membrane of EC exposed to a well-defined shear field. We have successfully applied these devices to investigate cytokine-,2 lipid-3, 4 and RAGE-induced5 inflammation in human aortic EC (HAEC). Here we document the use of the VMMC to assay monocytic cell (THP-1) rolling and arrest on HAEC monolayers that are conditioned under differential shear characteristics and activated by the inflammatory cytokine TNF-&alpha;. Studies such as these are providing mechanistic insight into atherosusceptibility under metabolic risk factors.

Microfluidic flow chambers etched by photolithography and fabricated from PDMS are applied to probe functional outcomes associated with EC dysfunction and inflammation. In a representative experiment, the ability of differential shear stress to modulate monocytic cell adhesion to cytokine activated EC monolayers is demonstrated.

온칩 내피 염증성 Phenotyping

Atherogenesis is potentiated by metabolic abnormalities that contribute to a heightened state of systemic inflammation resulting in endothelial ...

Procedure for the Development of Multi-depth Circular Cross-sectional Endothelialized Microchannels-on-a-chip

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, and observation and quantification are very challenging. However, conventional in vitro microvessel assays have limitations when representing in vivo microvessels with respect to three-dimensional (3D) geometry and providing continuous fluid flow. Using a combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics, we have developed a multi-depth circular cross-sectional endothelialized microchannels-on-a-chip, which mimics the 3D geometry of in vivo microvessels and runs under controlled continuous perfusion flow. A positive reflowable photoresist was used to fabricate a master mold with a semicircular cross-sectional microchannel network. By the alignment and bonding of the two polydimethylsiloxane (PDMS) microchannels replicated from the master mold, a cylindrical microchannel network was created. The diameters of the microchannels can be well controlled. In addition, primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) seeded inside the chip showed that the cells lined the inner surface of the microchannels under controlled perfusion lasting for a time period between 4 days to 2 weeks.

A microchannels-on-a-chip platform was developed by the combination of photolithographic reflowable photoresist technique, soft lithography, and microfluidics. The endothelialized microchannels platform mimics the three-dimensional (3D) geometry of in vivo microvessels, runs under controlled continuous perfusion flow, allows for high-quality and real-time imaging&#160;and can be applied for microvascular research.

멀티 깊이 원형 단면 Endothelialized 마이크로 채널 - 온 - 칩의 개발을위한 절차

Efforts have been focused on developing in vitro assays for the study of microvessels because in vivo animal studies are more time-consuming, expensive, ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

드라이 필름 포토 레지스트 기반 전기 화학 미세 바이오 센서 플랫폼: 장치 제작, 온 칩 시험 준비 및 시스템 운영

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

제조 및 통합된 전극 Transendothelial 전기 저항을 직접 측정 하는 기관-온-칩 시스템의 유효성 검사

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

A Lab-On-A-Chip Platform for Stimulating Osteocyte Mechanotransduction and Analyzing Functional Outcomes of Bone Remodeling

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical environment. During this process, mechanosensitive osteocytes regulate the opposing responses between the catabolic osteoclasts and anabolic osteoblasts. To better understand the highly intricate signaling pathways that regulate this process, our lab has developed a foundationary lab-on-a-chip (LOC) platform for analyzing functional outcomes (formation and resorption) of bone remodeling within a small scale system. As bone remodeling is a lengthy process that occurs on the order of weeks to months, we developed long-term cell culturing protocols within the system. Osteoblasts and osteoclasts were grown on functional activity substrates within the LOC and maintained for up to seven weeks. Afterward, chips were disassembled to allow for the quantification of bone formation and resorption. Additionally, we have designed a 3D printed mechanical loading device that pairs with the LOC platform and can be used to induce osteocyte mechanotransduction by deforming the cellular matrix. We have optimized cell culturing protocols for osteocytes, osteoblasts, and osteoclasts within the LOC platform and have addressed concerns of sterility and cytotoxicity. Here, we present the protocols for fabricating and sterilizing the LOC, seeding cells on functional substrates, inducing mechanical load, and disassembling the LOC to quantify endpoint results. We believe that these techniques lay the groundwork for developing a true organ-on-a-chip for bone remodeling.

Here, we present protocols for analyzing bone remodeling within a lab-on-a-chip platform. A 3D printed mechanical loading device can be paired with the platform to induce osteocyte mechanostransduction by deforming the cellular matrix. The platform can also be used to quantify bone remodeling functional outcomes from osteoclasts and osteoblasts (resorption/formation).

골연세포 메카노트랜스덕션 을 자극하고 뼈 리모델링의 기능적 결과 분석을 위한 Lab-On-A-Chip 플랫폼

Bone remodeling is a tightly regulated process that is required for skeletal growth and repair as well as adapting to changes in the mechanical ...

3D Cell-Printed Hypoxic Cancer-on-a-Chip for Recapitulating Pathologic Progression of Solid Cancer

Cancer microenvironment has a significant impact on the progression of the disease. In particular, hypoxia is the key driver of cancer survival, invasion, and chemoresistance. Although several in vitro models have been developed to study hypoxia-related cancer pathology, the complex interplay of the cancer microenvironment observed&#160;in vivo has not been reproduced yet owing to the lack of precise spatial control. Instead, 3D biofabrication approaches have been proposed to create microphysiological systems for better emulation of cancer ecology and accurate anticancer treatment evaluation. Herein, we propose a 3D cell-printing approach to fabricate a hypoxic cancer-on-a-chip. The hypoxia-inducing components in the chip were determined based on a computer simulation of the oxygen distribution. Cancer-stroma concentric rings were printed using bioinks containing glioblastoma cells and endothelial cells to recapitulate a type of solid cancer. The resulting chip realized central hypoxia and aggravated malignancy in cancer with the formation of representative pathophysiological markers. Overall, the proposed approach for creating a solid-cancer-mimetic microphysiological system is expected to bridge the gap between in vivo and in vitro models for cancer research.

Hypoxia is a hallmark of tumor microenvironment and plays a crucial role in cancer progression. This article describes the fabrication process of a hypoxic cancer-on-a-chip based on 3D cell-printing technology to recapitulate a hypoxia-related pathology of cancer.

고형암의 병리학적 진행을 재구성하기 위한 3D 세포 인쇄 저산소암-온-어칩

Cancer microenvironment has a significant impact on the progression of the disease. In particular, hypoxia is the key driver of cancer survival, invasion, ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

마이크로머신 마이크로유체 플랫폼의 간소화된 3차원 스킨 온-어칩 모델 생성

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target joint disorders are mostly palliative. The unmet need for effective disease-modifying OA drugs (DMOADs) has been primarily caused by the absence of appropriate models for studying the disease mechanisms and testing potential DMOADs. Herein, we describe the establishment of a miniature synovial joint-mimicking microphysiological system (miniJoint) comprising adipose, fibrous, and osteochondral tissue components derived from human mesenchymal stem cells (MSCs). To obtain the three-dimensional (3D) microtissues, MSCs were encapsulated in photocrosslinkable methacrylated gelatin before or following differentiation. The cell-laden tissue constructs were then integrated into a 3D-printed bioreactor, forming the miniJoint. Separate flows of osteogenic, fibrogenic, and adipogenic media were introduced to maintain the respective tissue phenotypes. A commonly shared stream was perfused through the cartilage, synovial, and adipose tissues to enable tissue crosstalk. This flow pattern allows the induction of perturbations in one or more of the tissue components for mechanistic studies. Furthermore, potential DMOADs can be tested via either &#34;systemic administration&#34; through all the medium streams or &#34;intraarticular administration&#34; by adding the drugs to only the shared &#34;synovial fluid&#34;-simulating flow. Thus, the miniJoint can serve as a versatile in vitro platform for efficiently studying disease mechanisms and testing drugs in personalized medicine.

We provide detailed methods for generating four types of tissues from human mesenchymal stem cells, which are used to recapitulate the cartilage, bone, fat pad, and synovium in the human knee joint. These four tissues are integrated into a customized bioreactor and connected through microfluidics, thus generating a knee joint-on-a-chip.

관절 질환 모델링 및 약물 테스트를 위한 무릎 관절 칩 생성

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...