وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) يمنح R01-P50-DK080752 وDK064540. نشكر J. Loughman لجهودها في إنشاء هذا الاختبار.

1. زراعة خلايا المثانة الظهارية 5637 نفذ الخطوات التالية في تدفق الصفحي هود الأنسجة الثقافة أعدت مع الأشعة فوق البنفسجية ومسحت أسفل مع الايثانول 70٪. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد المتوسطة RPMI-1640 تحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) [وصف RPMI +]، فلتر تعقيم باستخدام فلتر 0.22 ميكرون حجم المسام، ودافئة إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد على cryovial من 5637 الخلايا (أميركية نوع كوكتيل الثقافة HTB-9؛ المستمدة من سرطان المثانة) في 37 ° C حمام الماء. بسرعة نقل الخلايا إذابة إلى 75 سم 2 الأنسجة قارورة الثقافة تحتوي على 20 مل RPMI +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية في جو مرطب مع 5٪ CO 2 حتى الخلايا ما يقرب من 95٪ متموجة (~ 6 × 10 6 خلايا في قارورة)، حوالي 4 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى ثقافة فرعية الخلايا 5637: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة المتوسطة من القارورة. غسل الخلايا مع 10 مل Dulbecco والفوسفات مخزنة سالينه (DPBS) في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 6 مل دافئ (37 درجة مئوية) 0.05٪ التربسين، 0.02٪ محلول EDTA إلى القارورة، واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 مل، وبيليه بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة الحل التربسين / EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا في 6 مل RPMI + (10 6 خلية / مل)، ونقل 1 مل (10 6 خلايا) إلى 75 سم 2 الجديدة قارورة تحتوي على 20 مل RPMI +. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 1.4 إلى ثقافة فرعية الخلايا كل 4 أيام أو عندما تصل خلايا التقاء 95٪. </li></ol> 2. بذر وزراعة خلايا في 5637 يدعم نافذ نفذ الخطوات التالية في نسيج الثقافة هود باستخدام تقنية العقيم. لأفضل النتائج، استخدم 5637 الخلايا التي خضعت أقل من 10 ثقافات فرعية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط معقم، عكس الدعم نفاذية في العقيمة 25 ملم صحن زراعة الأنسجة العميقة. </li><lط&gt; يعرض للتريبسين 75 سم 2 قارورة من الخلايا في 5637 95٪ التقاء وفقا لخطوات 1.4.1-1.4.3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة ميكرولتر 1،000، resuspend بلطف الخلايا في ~ 2 مل RPMI + إلى تركيز 3 × 10 6 خلية / مل، والتي تحددها خلية العد باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق 50 ميكرولتر من تعليق خلية (1.5 × 10 5 خلايا) إلى كل الدعم نفاذية دون لمس الغشاء. وضع غطاء على طبق، ووضع بعناية الطبق عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2 لمدة لا تتجاوز 16 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط معقم، والحق يدعم نفاذية في لوحة 24 أيضا تحتوي على 0.6 مل لكل بئر RPMI +. إضافة 0.1 مل RPMI + إلى الخزان العلوي من كل الدعم منفذة. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المتوسطة كل أيام 2. الأولى والمتوسطة نضح من الخزان العلوي يليه الخزان السفلي، ومن ثم تطبيق الطازجة RPMI + في ترتيب عكسي، إلى انخفاض الخزان (0.6 مل) ثم الجزء العلوي RESErvoir (0.1 مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سبعة أيام بعد البذر يدعم نفاذية الخلايا مع 5637، تقييم التقاء الخلايا. ملء الخزان العلوي مع RPMI + (~ 0.35 مل). متموجة الخلايا بما فيه الكفاية عندما لا تتوازن المتوسط ​​بين الخزانات العلوية والسفلية. </li></ol> 3. إعداد اللقاح البكتيري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام تقنية العقيم، إضافة 20 مل من مرق الثقافة المناسبة لقارورة 250 مل مع غطاء. استخدام لوريا، BERTANI (LB) مرق لE. القولونية الثقافات، وإضافة المضادات الحيوية إلى مرق عند الاقتضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام التلقيح حلقة عقيمة، تطعيم المرق مع البكتيريا من مخزون الجلسرين أو لوحة متتالية. لسلالات UPEC، واحتضان ثقافة البكتيرية عند 37 درجة مئوية لمدة حوالي 16 ساعة، دون أن تهتز (لتعزيز إنتاج نوع الشعرة 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل ثقافة البكتيرية إلى أنبوب الطرد المركزي. بيليه البكتيريا عن طريق الطرد المركزي في 8000 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب طاف، و resuspend البكتيريا في برنامج تلفزيوني لOD 600 = 1.000، أي ما يعادل 10 ~ 9 كفو / مل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوليد التحفيز قتلت الحرارة البكتيرية، واحتضان قسامة (على سبيل المثال ~ 1.5 × 10 8 كفو في 150 ميكرولتر) من البكتيريا معلق على 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. لوحة قسامة لتعليق قتلوا الحرارة لتأكيد الوفاة البكتيرية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فورا قبل الاستخدام، تمييع البكتيريا معلق (حية أو قتلوا الحرارة) 10 أضعاف إلى 10 8 كفو / مل في الحارة خالية من المصل RPMI [وصف RPMI] في أنبوب microfuge. </li></ol> 4. عزل العدلات الإنسان من الدم المحيطي جمع الدم من المتطوعين الكبار يتطلب مراجعة والموافقة عليها مسبقا من مجلس المراجعة المؤسسية. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة والتخلص السليم من المواد الخطرة لتجنب التعرض للدم الإنسان. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حوالي 25 مل من الدم الوريدي من الخامس البالغين الأصحاءolunteer يجب الانتباه الى 3 الصوديوم العقيمة التي تحتوي على الهيبارين أنابيب جمع الدم عن طريق الموظفين المدربين في الفصد. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التفاف بإحكام وقف النزف المطاط حول الذراع العليا، فوق الكوع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطهير الموقع الدخول، والحفرة المرفقية، وذلك باستخدام العقيمة 70٪ كحول قضاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إرفاق حامل أنبوب بلاستيكي إلى نظام فراشة إبرة المجنح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج الإبرة في الوريد المرفقية في 30 ° زاوية أو أقل، شطبة مواجهة. الإبرة قد ثقب الوريد عند ظهور طفرة الدم في أنابيب بلاستيكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج أنبوب جمع الدم في حامل أنبوب بلاستيكي. عند أول أنبوب جمع هو كامل، مع استبدال أنبوب جمع الثانية. أكرر مع أنبوب ثالث. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما أنبوب جمع الثالثة ما يقرب من نصف كاملة، وإزالة عاصبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية موقع البزل مع كرة القطن المعقم وسحب ببطء الإبرة من الوريد. حرك درعا واقيا خلال إبرة ومكان طغ بيولوجية الأدوات الحادة الحاوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ممارسة الضغط على لموقع الثقب. تغطية موقع الوخز والقطن الكرة مع ضمادة لاصقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس بلطف أنابيب جمع الدم لتفريق الهيبارين. </li></ol></li></ol> نفذ الخطوات التالية في نسيج الثقافة هود باستخدام تقنية العقيم. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة 10 مل، ونقل بلطف الدم إلى 50 مل أنبوب مخروطي العقيمة الطازجة. إضافة حجم يعادل 3٪ (ث / ت) في ديكستران 0.9٪ كلوريد الصوديوم وتخلط بواسطة انقلاب. احتضان أنبوب تستقيم في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دون تعطيل الطبقة السفلى، ونضح بعناية الطبقة العليا وتحويلها إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية خلية في حجم كلوريد الصوديوم 0.9٪ أي ما يعادل حجم الانطلاق من الدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طبقة 10 مل من كثافة الحل الطرد المركزي في إطار التعليق الخلية، صحجز واجهة بين المرحلتين. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 30 دقيقة مع عدم وجود الفرامل. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لليز المتبقية خلايا الدم الحمراء، resuspend الكرية خلية في 10 مل الباردة 0.2٪ كلوريد الصوديوم. احتضان لمدة 30 ثانية، ثم على الفور إضافة 10 مل الباردة 1.6٪ كلوريد الصوديوم لاستعادة تساوي التوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 6 دقائق. تجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات من 4،6-4،7 حتى يظهر بيليه الخلية لتكون خالية من خلايا الدم الحمراء، وعادة 3 جولات من تحلل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة ميكرولتر 1،000، resuspend الكرية الخلية، في المقام الأول PMN، في الحارة (37 درجة مئوية) RPMI إلى تركيز 10 7 خلية / مل، والتي تحددها خلية العد باستخدام عدادة الكريات. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية حتى الاستخدام. عادة، PMN الجدوى والنقاء هي&gt; 99٪ وفقا لتقييم الاستبعاد التريبان الأزرق والتصور مورفولوجيا النووية بعد تلطيخ، على التوالي. </li></ol> 5. Transuroepithelial العدلات الهجرة وقول نفذ الخطوات التالية في نسيج الثقافة هود باستخدام تقنية العقيم. فقط استخدام دعامات قابلة للاختراق تحمل متموجة 5637 طبقات الخلية، كما هو محدد في الخطوة 2.7. في 24 لوحات جيدة تحتوي على RPMI يمكن أن تكون معدة مسبقا والاحتفاظ بها في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 حتى الاستخدام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 1 مل RPMI الحارة لكل بئر في لوحة 24 جيدا، وإعداد 3 آبار في دعم منفذة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح المتوسطة من الخزانات العلوية والسفلية من دعامات قابلة للاختراق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط معقم، ونقل الدعم نفاذية إلى 24 لوحة جيدا أعدت في الخطوة 5.1. غسل الدعم نفاذية ثلاث مرات عن طريق نقل الدعم من بئر إلى بئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان اللقاح الجرثومي هو للاستخدام، عكس الدعم نفاذية في العقيمة 25 ملم صحن زراعة الأنسجة العميقة. إذا كان جاذب كيميائي (على سبيل المثال، N-فورميل-الأرصاد-ليو-الفنيل ألانين (fMLF) أو IL-8) لاستخدامه، انتقل إلى الخطوة 5.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإجراء التجارب مع جرثومة حية أو قتلالمحفزات يريال، تطعيم الجانب قمية كل الدعم نفاذية مع 60 ميكرولتر RPMI (العدوى وهمية) أو مع اللقاح البكتيري (6 × 10 6 كفو) التي أعدت في الخطوة 3.5. وضع غطاء على طبق واحتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.6 مل RPMI لكل جيدا إلى 24 لوحة جيدا مرفق منخفضة؛ إعداد 1 جيدا في دعم منفذة. إعداد 3 آبار تحتوي على 0.5 مل RPMI لتعداد المدخلات PMN. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان يتم استخدام جاذب كيميائي بدلا من البكتيريا، إضافة إلى 0.6 مل جاذب كيميائي RPMI في 24 لوحة جيدا أعدت في الخطوة 5.6. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حق دعامات قابلة للاختراق في 24 لوحة جيدا مرفق منخفضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.1 مل PMN (10 6 السوداء)، التي أعدت في الخطوة 4.9، إلى الخزان العلوي (الجانب basolateral) كل الدعم منفذة. إضافة 100 ميكرولتر PMN مباشرة إلى الآبار تحتوي على 500 ميكرولتر RPMI. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط معقم، كشط بلطفغشاء من الدعم نفاذية ضد حافة البئر لإزالة PMN إضافية من الجانب قمية ومن ثم التخلص من الدعم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع PMN عن طريق كشط بلطف أسفل كل جيدا مع 1،000 ميكرولتر ماصة الحافة، ونقل إلى تعليق PMN microfuge الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعداد PMN باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لحساب مجموع عدد PMN في الخزان السفلي، مضاعفة عدد PMN في 1 مم 2 (100 NL) من خلال 6،000. ويمكن الإبلاغ عن البيانات كنسبة مئوية من المدخلات PMN، أو كأرقام PMN تطبيع 6 إلى 10 المدخلات PMN. </li></ol>

<ol>
	<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orientation+chamber+in+chemotaxis.">Orientation chamber in chemotaxis.</a> Methods Enzymol. 162, 65-72 (1988).</li><li>Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+direct-viewing+chemotaxis+chamber.">A new direct-viewing chemotaxis chamber.</a> J. Cell Sci. 99 (Pt. 4), 769-775 (1991).</li><li>Chin, A. C., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathobiology+of+neutrophil+transepithelial+migration:+implications+in+mediating+epithelial+injury.">Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury.</a> Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).</li><li>Zemans, R. L., Colgan, S. P., Downey, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transepithelial+migration+of+neutrophils:+mechanisms+and+implications+for+acute+lung+injury.">Transepithelial migration of neutrophils: mechanisms and implications for acute lung injury.</a> Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 40, 519-535 (2009).</li><li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+human+neutrophil+migration+and+function+by+uropathogenic+bacteria.">Attenuation of human neutrophil migration and function by uropathogenic bacteria.</a> Microbes Infect. 13, 555-565 (2011).</li><li>Lau, M. E., Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YbcL+of+uropathogenic+Escherichia+coli+suppresses+transepithelial+neutrophil+migration.">YbcL of uropathogenic Escherichia coli suppresses transepithelial neutrophil migration.</a> Infect. Immun. 80, 4123-4132 (2012).</li><li>Loughman, J. A., Hunstad, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+indoleamine+2,3-dioxygenase+by+uropathogenic+bacteria+attenuates+innate+responses+to+epithelial+infection.">Induction of indoleamine 2,3-dioxygenase by uropathogenic bacteria attenuates innate responses to epithelial infection.</a> J. Infect. Dis. 205, 1830-1839 (2012).</li><li>Foxman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology+of+urinary+tract+infection.">The epidemiology of urinary tract infection.</a> Nat. Rev. Urol. 7, 653-660 (1038).</li><li>Haraoka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+recruitment+and+resistance+to+urinary+tract+infection.">Neutrophil recruitment and resistance to urinary tract infection.</a> J. Infect. Dis. 180, 1220-1229 (1999).</li><li>Billips, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+host+innate+immune+response+in+the+bladder+by+uropathogenic+Escherichia+coli.">Modulation of host innate immune response in the bladder by uropathogenic Escherichia coli.</a> Infect. Immun. 75, 5353-5360 (2007).</li><li>Bozeman, P. M., Learn, D. B., Thomas, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+the+human+leukocyte+enzymes+myeloperoxidase+and+eosinophil+peroxidase.">Assay of the human leukocyte enzymes myeloperoxidase and eosinophil peroxidase.</a> J. Immunol. Methods. 126, 125-133 (1990).</li><li>Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+neutrophil+transepithelial+migration.">In vitro neutrophil transepithelial migration.</a> Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).</li><li>S&#228;ve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+adenosine+A2A+receptors+inhibits+neutrophil+transuroepithelial+migration.">Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration.</a> Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).</li><li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism.">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

باستخدام خط الخلية الظهارية المثانة مثقف والمعزولة حديثا PMN الإنسان، أنشأنا نموذجا في المختبر للهجرة العدلات transuroepithelial. وكان هذا النموذج فعال في بداية لتشريح تعقيدات الاستجابة المناعية الفطرية أثناء التهاب المسالك البولية (UTI)، وهو عدوى بكتيرية شائعة جدا تسبب ...

حركة الخلايا في جميع أنحاء الجسم، وغالبا عبر مسافات طويلة، ومطلوب من أجل النمو والتنمية، التئام الجروح، والاستجابة المناعية. الهجرة الخلية معقد ويتطلب تنسيق العديد من الإجراءات المختلفة، بما في ذلك إشارة الشلالات وإعادة ترتيب مكونات هيكل الخلية. الخلايا يمكن ان تتحرك بشكل عشوائي (تنشيط كيميائي)، وكذلك نحو التدرجات الكيميائية المحددة (الكيميائي). وقد تم تطوير العديد من التقنيات لدراسة الهجرة خلية في المختبر. توضع هذه التقنية الأقدم والأكثر شيوعا، وغرفة بويدن، يتكون من نظام من مجلسين الرأسي حيث يتم وضع مادة جاذب كيميائي في الغرفة السفلي وخلايا الفائدة في أعلى الغرفة 1. ويتم رصد حركة الخلايا عبر مرشح قابلة للاختراق، مع مسام حجم محددة، تفصل بين الغرفتين. وقد تم تطوير تقنيات إضافية لتحقيق الهجرة الخلية، بما في ذلك غرفة زيجموند 2 وغرفة دن3. وقد أسفرت هذه النهج الجماعي نظرة كبيرة في الحركة من العديد من أنواع مختلفة من الخلايا. بالإضافة إلى استجواب المبادئ الأساسية لتنشيط كيميائي والكيميائي، والمقايسات من مجلسين سهلت التحقيق الهجرة الخلية من خلال مكونات المصفوفة خارج الخلية وكل من طبقات الخلايا البطانية والظهارية. ميزة النظم من مجلسين أكثر من غيرها من التقنيات هو أن غشاء مسامي يمكن المغلفة مع البروتينات مثل الكولاجين أو الفيبرينوجين، والهجرة الخلية عبر الجدار مثل المصفوفة خارج الخلية يمكن تقييمها. بالإضافة إلى ذلك، خطوط خلايا مستنبتة يمكن زراعتها ومتباينة على دعامات قابلة للاختراق. للتحقيق في حركة الخلايا عبر حاجز غشائي، هي المصنفة الخلايا البطانية مثقف ونمت في الخزان العلوي من دعامات قابلة للاختراق. خلايا متحركة، مثل الخلايا المناعية، تضاف إلى الخزان العلوي والهجرة إلى الخزان السفلي عبر ENويلاحظ الحاجز dothelial في القمي، لbasolateral اتجاه الفسيولوجية. وكان هذا النموذج لا تقدر بثمن في فهم التسرب من الخلايا المناعية من مجرى الدم. وعلى النقيض من transendothelial الهجرة، وحركة الخلايا عبر حاجز الظهارية يحدث عادة في الاتجاه basolateral-إلى القمي. من أجل نمذجة هذه الأحداث في المختبر، والبذور الباحثين وتنمو الخلايا الظهارية مثقف على الجانب السفلي من دعامات قابلة للاختراق. تضاف خلايا متحركة إلى الخزان العلوي والهجرة عبر حاجز الظهارية، وتمثل الاتجاه basolateral-إلى القمي، يتم رصدها. وقد ساهمت هذه النماذج من الهجرة بطريق الظهارة بشكل كبير في فهمنا للالاستجابات الالتهابية في الأسطح المخاطية، وخاصة تلك التي في الرئة والأمعاء 4،5. في المقابل، الاتجار الخلايا المناعية من خلال ظهارة المسالك البولية تلقت اهتماما أقل بكثير. لمزيد من understandi لدينانانوغرام من الاستجابات المناعية الفطرية في المسالك البولية خلال العدوى مع uropathogenic القولونية (UPEC)، ونحن وضعت في المختبر فحص، وtransuroepithelial فحص الهجرة العدلة، التي تمكن التحقيق من النوى الكريات البيض (السوداء؛ العدلة) التنقل عبر حاجز المثانة الظهارية 6 -8. كما هو الحال مع نماذج من مجلسين أخرى من الهجرة بطريق الظهارة، وتزرع الخلايا المستزرعة المثانة الإنسان الظهارية على الجانب السفلي من دعم نفاذية وتشكل طبقات متموجة الظهارية. العدلات الإنسان، معزولة عن الدم الوريدي، يتم تطبيقها على الجانب basolateral من الطبقة الظهارية، وكميا الهجرة عبر ظهارة في الاتجاه basolateral-لقمية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في الاستجابة للعدوى مع سلالات مختلفة من E. كولاي أو وجود جزيئات جاذب كيميائي. وكانت أبحاث بكثير تركز على حركة العدلة، سواء تنشيط كيميائي والكيميائي، في ظل غياب أنواع الخلايا إضافية. وtransuroepithelial العدلة فحص الهجرة هو مفيد لأنه يأخذ بعين الاعتبار التفاعلات المعقدة بين الخلايا الظهارية المثانة والخلايا المناعية أثناء العدوى. هذا لين العريكة في المختبر نموذج لديه القدرة للسماح تحقيق مفصل من الاستجابات المناعية على السطوح uroepithelial.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Inserts (i.e.&#160;permeable supports)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td>6.5 mm, 3 &#956;m pore, polyester membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>366480</td>
			<td>16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>367281</td>
			<td>21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer one-use, nonstackable holder</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>364815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4876</td>
			<td>From Leuconostoc mesenteroides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td>24-well, clear flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reconstituted in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CXCL8/IL-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL</td>
			<td>Reconstituted in PBS to 100 &#956;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative assessment of human neutrophil migration across a cultured bladder epithelium

تجنيد الخلايا المناعية من المحيط إلى موقع الالتهاب هو خطوة ضرورية في الاستجابة المناعية الفطرية في أي سطح الغشاء المخاطي. خلال العدوى في المثانة البولية، والكريات البيض النوى (السوداء؛ العدلات) ترحيل من مجرى الدم واجتياز ظهارة المثانة. الفشل في حل العدوى في حالة عدم وجود استجابة عدلة يدل على أهمية PMN في الدفاع المثانة. لتسهيل استعمار ظهارة المثانة، uropathogenic القولونية (UPEC)، العامل المسبب لغالبية التهابات المسالك البولية (عدوى المسالك البولية)، يثبط الاستجابة الالتهابية الحادة باستخدام مجموعة متنوعة من الآليات المحددة جزئيا. لمزيد من التحقيق في التفاعل بين المضيف والممرض الجرثومي، وضعنا نموذجا في المختبر من هذا الجانب من الاستجابة المناعية الفطرية لUPEC. في مقايسة transuroepithelial الهجرة العدلة، والاختلاف على غرفة بويدن والمثانة مثقف epithتزرع الخلايا الليل إلى نقطة التقاء على الجانب السفلي من دعم منفذة. يتم عزل PMN من الدم الوريدي الإنسان ويتم تطبيقها على الجانب basolateral من طبقات الخلايا الظهارية المثانة. الهجرة PMN تمثل الاتجاه basolateral-لقمية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية في استجابة لعدوى بكتيرية أو الجزيئات جاذب كيميائي يتم تعداد باستخدام عدادة الكريات. هذا النموذج يمكن استخدامها لتحقيق التفاعل بين UPEC والخلايا حقيقية النواة وكذلك لاستجواب المتطلبات الجزيئية لاجتياز المثانة بواسطة ظهائر PMN. فإن نموذج الهجرة العدلة transuroepithelial تعزيز فهمنا للاستجابة التهابية الأولي لUPEC في المثانة.

وtransuroepithelial فحص الهجرة العدلة تمكن التقييم الكمي للهجرة PMN الإنسان عبر مثقف طبقات الخلايا الظهارية المثانة استجابة لمختلف المحفزات (الشكل 1B). في حين أن بروتوكول واضح ومباشر، وهناك عدد من المتغيرات التي يمكن أن تؤثر الهجرة PMN وبالتالي تؤثر على استنساخ هذا الا?...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium at JoVE.com

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

قمنا بتطوير نموذج في المختبر الذي يحاكي عنصرا هاما من عناصر الاستجابة الالتهابية الحادة خلال العدوى من المثانة مع uropathogenic القولونية. وtransuroepithelial فحص الهجرة العدلة يتيح التقييم الكمي للهجرة العدلات الإنسان عبر المثانة ظهائر، مثقف على دعامات قابلة للاختراق، واستجابة لعدوى بكتيرية أو مواد جاذب كيميائي.

التقييم الكمي للهجرة العدلات الإنسان وعبر مثقف المثانة الظهارة

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

quantitative-assessment-human-neutrophil-migration-across-cultured

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.9K Views.  Washington University School of Medicine.  قمنا بتطوير نموذج في المختبر الذي يحاكي عنصرا هاما من عناصر الاستجابة الالتهابية الحادة خلال العدوى من المثانة مع uropathogenic القولونية. وtransuroepithelial فحص الهجرة العدلة يتيح التقييم الكمي للهجرة العدلات الإنسان عبر المثانة ظهائر، مثق?...

Video: Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

توسيع وتنقية ، والتقييم الوظيفي للخلايا الدم المحيطية الإنسان NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

تتبع الزحف داخل اللمعة العدلات ، والهجرة والانجذاب الكيميائي Transendothelial في الأنسجة بواسطة الميكروسكوب فيديو Intravital

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

A التقييم الكمي للهجرة الخليوي من قبل مصلحة دمغ المصوغات المسار على الحركة Phagokinetic

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

في المختبر المقايسة المشتركة لتقييم الهجرة العدلية المستحثة المسببة للأمراض عبر الظهارية

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

غرفة تدفق العدلات الإنسان التصاق الفحص

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

التنمية وتحديد جزء من السكان رواية من المستمدة العدلات-الإنسان البالعات العملاق<em&gt; في المختبر</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

في المختبر تشكيل الكلاب العَدلات فخ خارج الخلية: التحليل الكمي ودينامية بالفحص المجهري الأسفار

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

تقييم هجرة الخلايا الليمفاوية في نظام الهجرة فيفو السابقين

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water while preventing passage of luminal bacteria and exogenous substances. A breach of this layer results in increased permeability to luminal contents and recruitment of immune cells, both of which are hallmarks of pathologic states in the gut including inflammatory bowel disease (IBD). 
Mechanisms regulating epithelial barrier function and transepithelial migration (TEpM) of polymorphonuclear neutrophils (PMN) are incompletely understood due to the lack of experimental in vivo methods allowing quantitative analyses. Here, we describe a robust murine experimental model that employs an exteriorized intestinal segment of either ileum or proximal colon. The exteriorized intestinal loop (iLoop) is fully vascularized and offers physiological advantages over ex vivo chamber-based approaches commonly used to study permeability and PMN migration across epithelial cell monolayers.
We demonstrate two applications of this model in detail: (1) quantitative measurement of intestinal permeability through detection of fluorescence-labeled dextrans in serum after intraluminal injection, (2) quantitative assessment of migrated PMN across the intestinal epithelium into the gut lumen after intraluminal introduction of chemoattractants. We demonstrate feasibility of this model and provide results utilizing the iLoop in mice lacking the epithelial tight junction-associated protein JAM-A compared to controls. JAM-A has been shown to regulate epithelial barrier function as well as PMN TEpM during inflammatory responses. Our results using the iLoop confirm previous studies and highlight the importance of JAM-A in regulation of intestinal permeability and PMN TEpM in vivo during homeostasis and disease. 
The iLoop model provides a highly standardized method for reproducible in vivo studies of intestinal homeostasis and inflammation and will significantly enhance understanding of intestinal barrier function and mucosal inflammation in diseases such as IBD.

Dysregulated intestinal epithelial barrier function and immune responses are hallmarks of inflammatory bowel disease that remain poorly investigated due to a lack of physiological models. Here, we describe a mouse intestinal loop model that employs a well-vascularized and exteriorized bowel segment to study mucosal permeability and leukocyte recruitment in vivo.

التقييم الوظيفي نفاذية الأمعاء والهجرة العدلية عبر الإبط في الفئران باستخدام نموذج حلقة معوية موحدة

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...