هذا البروتوكول مهم لأنه يسمح لتحليل في المختبر من العدلات يحتشدون ، والذي يتغلب على العديد من القيود على عدم قدرتنا الحالية على التجربة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يوفر سهولة الوصول إلى السيتوكينات المفرزة والوسطاء الدهون التي تطلق العدلات أثناء الاحتشاد وتسمح للتحليل الكمي للتصوير. في حين أننا تطبيقنا هذه التقنية على العدلات، يمكن أن تمتد لتحليل هجرة خلايا الدم البيضاء الأخرى مثل الخلايا الأحادية والخلايا التائية.
تبدأ من خلال إعداد 1.6 ملليغرام لكل ملليلتر البوليكتوليت، أو حل CP، عن طريق إضافة كمية مناسبة من مسحوق CP إلى الماء وخلطه على لوحة ضجة بين عشية وضحاها أو حتى يتم حل جميع المواد الصلبة. إذا رغبت في ذلك، يمكن إجراء الحل الفلورسنت بإضافة بولي-L-ليسين المسمى مع FITC. توليد رقاقة السيليكون الرئيسي باستخدام إجراءات التصوير الضوئي القياسية.
التصميم المستخدم هنا هو أربعة في أربعة ملليلتر صفيف مستطيلة من 30 ميكرومتر قطر شغل الدوائر في، مع مركز 150 ميكرومتر إلى تباعد المركز، ولكن يمكن تعديلها حسب الرغبة لتطبيقات مختلفة. تدور معطف طبقة سميكة 40 ميكرومتر من photoresist السلبية على رقاقة السيليكون. ثم خبز رقاقة في 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق يعرض رقاقة للأشعة فوق البنفسجية من خلال photomask الكروم مع 150 إلى 160 ملليجول لكل سنتيمتر مربع. خبز رقاقة مرة أخرى في 65 درجة مئوية لمدة خمس دقائق و 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
ثم غمره في مطور ا photoresist لمدة 10 دقائق. وشطفه بالكحول الأيزوبروبيل. وينبغي أن يكون النمط الآن مرئيا على الرقاقة.
المقبل, خلط شامل نسبة 10 إلى واحد من بوليديميثيلسيلوكسيان, أو PDMS, prepolymer وعامل علاج لها. وسكب الخليط غير المذبوح فوق الرقاقة الرئيسية في طبق بيتري. فراغ علاج خليط PDMS uncured حتى لا فقاعات الهواء موجودة.
ثم علاجها بين عشية وضحاها في 65 درجة مئوية. في اليوم التالي، استخدم مشرط لقطع حول الجزء الخارجي من الجزء المنقوش من رقاقة. وإزالة ببطء لوح PDMS الشفاء، ووضعها على لوحة قطع نظيفة مع الجانب منقوشة تواجه ما يصل.
لكمة من الطوابع الفردية من بلاطة PDMS مع لكمة خزعة ثمانية ملليمتر ووضع كل طابع الوجه إلى أسفل على الشريط اللاصق لإزالة الحطام. مع هذه الطوابع التي تواجه، رئيس كل طابع مع 100 ميكرولترات من الحل CP المعدة مسبقا، وضمان عدم وجود فقاعات الهواء تشكل بين الحل وختم. ثم عكس الطوابع على طبقة من حل CP وإزالتها بعد ساعة واحدة.
داب كل الرطب وجه الطابع إلى أسفل على شريحة زجاجية نظيفة من ست إلى ثماني مرات لإزالة السائل الزائد. ثم فراغ علاج الطوابع لمدة دقيقة إلى دقيقتين. الانضمام إلى ثمانية بشكل جيد، ثمانية ملليمتر قطر التصوير الفضاء على رأس شريحة زجاجية نظيفة كدليل لوضع الطوابع.
ضع وجه الطابع لأسفل على الشريحة الزجاجية في وسط كل بئر من مساحة التصوير. ثم ضع وزن متوازن 5.6 غرام فوق كل طابع واسمحوا 10 دقائق لختم. قم بإزالة الأوزان والطوابع من الشريحة واسمح لطبقة CP بالجفاف في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة قبل إضافة الجسيمات الحيوية.
إذا تم وضع علامة على CP مع FITC، تحقق من فعالية الختم باستخدام مجهر فلوري. قطع لوح PDMS فارغة إلى حجم الفضاء التصوير واستخدام لكمة خزعة ثمانية ملليمتر لإنشاء الآبار في PDMS التي تتماشى مع آبار الفضاء. ثم قم بالتصاق لوح PDMS إلى الشريحة الزجاجية.
ذوبان محلول من الجسيمات الحيوية وتمييعه إلى 500 ميكروغرام لكل ملليلتر في الماء للحقن. إضافة 100 ميكرولترات من محلول جسيمات حيوية لكل PDMS جيدا على الشريحة الزجاجية والصخور الشريحة لمدة 30 دقيقة. شطف الآبار جيدا بالماء والتحقق من نمط على الشريحة مع المجهر الفلورسنت.
يمكن تخزين الجسيمات الحيوية في بيئة خالية من الغبار عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر. إعداد الخلايا عن طريق إعادة تعليق لهم في 7.5 مرات 10 إلى الخلايا الخامسة لكل ملليلتر في IMDM مع 0.4٪ البوم المصل البشري. إضافة 100 ميكرولترات من التعليق إلى PDMS جيدا تحتوي على الجسيمات الحيوية microarray، والتأكد من أن تعليق الخلية هو محدب على الجزء العلوي من PDMS جيدا ولا يحتوي على أي فقاعات.
ختم البئر مع زلة غطاء قطرها 12 ملليمتر واضغط على أسفل بلطف مع ملاقط حتى نظام التعليق الخلية الزائدة يهرب إلى حافة البئر، ثم استخدام الأنسجة لإزالة الزائدة. لتصوير الخلايا، قم بتحميل صفيف الجسيمات الدقيقة بالخلايا على محطة تصوير الخلايا الحية في مجهر مجهز بحضانة قفص ية منضبطة إلى 37 درجة مئوية، و5٪ ثاني أكسيد الكربون، ورطوبة نسبية بنسبة 90٪. استخدم الفاصل الزمني، والفلورسنت، والمجهر الميداني الساطع لتسجيل الصور بمعدل 10X كل 10 ثوانٍ عند 405 نانومتر، و594 نانومتر، ومجال مشرق.
احتضان العدلات في الآبار مع الجسيمات الحيوية في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات، وأخذ عينات في النقاط الزمنية المطلوبة. استخدام المجهر الميداني مشرق للتحقق من أن يتم تشكيل أسراب على microarray. جمع كامل حجم من فوق البئر من بئر واحد، وتحميله في أنبوب تصفية الطرد المركزي ميكرومتر 0.45، مع التأكد من تحليل كل نقطة زمنية في ثلاث ية.
أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 190 مرة G و 20 درجة مئوية لمدة خمس دقائق، وجمع حجم المصفاة. ثم تخزين العينات في ناقص 80 درجة مئوية حتى وقت المعالجة. عند محاولة هذا البروتوكول، العمل مع المصورين الضوئيين والمطور في غطاء محرك الدخان.
أن يكون هناك بروتوكول معتمد من IRB قبل أخذ الدم من المتبرعين البشريين. تذكر أن المواد المشتقة من الدم البشري هي BSL2. عندما تضاف العدلات إلى الجزئيات الحيوية microarray، العدلات التي تتصل مجموعات جسيمات حيوية تصبح نشطة وتبدأ الاستجابة يحتشدون.
تم التحقق من صغر الجسيمات الحيوية باستخدام المجهر الفلورسنت الفاصل الزمني لتتبع هجرات العدلات نحو مجموعات الجسيمات الحيوية. يتم تشكيل أسراب العدلات المستقرة حول كل مجموعة بعد 30 إلى 60 دقيقة من التعرض. وعلى النقيض من ذلك، لا تظهر العدلات هجرة جماعية في غياب مجموعات جسيمات بيولوجية.
تم استخدام كثافة الفلوريس من نوى العدلات الملون لتحديد أن متوسط حجم سرب حول مجموعات الجسيمات الحيوية كان حوالي 1490 ميكرومتر مربع. وفي غياب المجموعات، ظلت حالة الفلور من منطقة معينة من مناطق الاهتمام ثابتة مع مرور الوقت. وتبين مسارات هجرة العدلات أن العدلات تتقارب في مجموعة جسيمات بيولوجية عندما كان أحدها حاضراً، ولكن لم يُلاحظ أي تقارب في نظام التحكم.
تم قياس سرعة العدلات المحتشدة وغير المعطلة ، وتم العثور على اختلاف مهم إحصائيًا في توزيعات السرعة. وكان متوسط سرعة العدلات المحتشدة 20.6 ميكرومتر في الدقيقة الواحدة، في حين أن متوسط سرعة العدلات التحكمية كان اثنين من ميكرومتر في الدقيقة. تم تحليل تركيزات 16 بروتينًا تطلقها العدلات أثناء الحشد بمرور الوقت.
زيادة 10 بروتينات في التركيز. اثنين انخفض. والأربعة المتبقية زادت خلال الساعة الأولى من الحشد ولكن انخفضت بعد ذلك.
أثناء تنفيذ هذا الإجراء، تأكد من أن كل شيء نظيف والطوابع الخاصة بك تجفف بشكل صحيح، لأن هذه ضرورية لنجاح النقش من الجسيمات البكتيرية. تطوير هذه التقنية سوف تمكن الباحثين من استكشاف أسئلة جديدة في مجال حشد العدلات، بما في ذلك كيفية الوسطاء الحرة والحويصلات خارج الخلية وتشارك في الاتصالات بين الخلايا العدلات.
