이 작품은 건강 (NIH)의 국립 연구소에 의해 지원되었다 R01 - DK080752 및 P50-DK064540을 부여합니다. 우리는이 분석을 설정하는 그녀의 노력에 대한 J. Loughman 감사합니다.

1. 5637 방광 상피 세포를 배양 층류 조직 문화 후드 UV 조사 준비 및 70 % 에탄올로 닦여에서 다음 단계를 수행합니다. <ol><li> 10 % 소 태아 혈청 (FBS) [칭했다 RPMI +]를 함유하는 RPMI-1640 배지를 준비 필터 수욕 0.22 ㎛의 세공 크기 필터를 사용하여 살균하고, 온난 한 37 ° C. </li><li> 5637 세포의 cryovial을 해동 (미국 유형 문화 수집 HTB-9, 방광 암에서 파생 된) 37 ° C의 물을 욕조에. 빠르게 20 ㎖ RPMI +를 포함하는 75cm 2 조직 문화 플라스크에 해동 세포를 전송합니다. </li><li> 세포가 약 95 %의 합류 (플라스크 당 ~ 6 × 10 6 세포), 약 5 일 때까지 5 % CO 2와 가습 분위기에서 37 ° C에서 플라스크를 품어. </li><li> 5637 세포를 배양하는 방법 : <ol><li> 플라스크에서 매체를 제거합니다. 10 ㎖ 둘 베코의 인산 완충 살린로 세포를 씻어실온에서 전자 (DPBS). </li><li> 6 ㎖의 따뜻한 (37 ° C) 0.05 % 트립신, 플라스크에 0.02 %의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 추가하고 15 분 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 5 분 300 XG에서 원심 분리하여 15 ML 원뿔 관, 펠릿에 세포를 전송합니다. 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션을 제거합니다. </li><li> 20 ml의 RPMI +를 포함하는 새로운 75cm 2 플라스크에 6 ㎖의 RPMI + (10 6 세포 / ml), 및 전사 1 ㎖ (10 6 세포)에서 세포를 재현 탁. </li></ol></li><li> 세포가 95 %의 합류에 도달하면 4 일마다 세포를 배양하는 단계 1.4를 반복하거나. </li></ol> 2. 침투성 서포트에 5637 셀 시드와 성장 무균 기술을 사용하여 조직 문화 후드에서 다음 단계를 수행합니다. 최적의 결과를 위해, 10 개 미만의 서브 컬쳐를받은 5637 세포를 사용합니다. <ol><li> 멸균 집게를 사용하여 멸균 25mm 깊은 조직 배양 접시에 투과 지원을 반전. </li><l난&gt; 1.4.1-1.4.3 단계에 따라 95 %의 합류에 5637 세포의 75cm 2 플라스크를 Trypsinize. </li><li> 1000 μL 피펫을 사용하여 조심스럽게 혈구 세포를 사용하여 계산에 의해 결정된 3 × 106 세포 / ml의 농도로 1 ~ 2 ㎖의 RPMI +의 세포를 재현 탁. </li><li> 멤브레인을 건드리지 않고 각 성의 지원에 세포 현탁액 (1.5 × 10 5 세포)의 50 μl를 적용합니다. 접시에 뚜껑을 배치하고주의 깊게 더 이상 16 이상의 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 접시를 놓습니다. </li><li> 물론 당 0.6 ML RPMI의 +를 포함하는 24 - 웰 플레이트에 살균 집게, 바로 투과 지원을 사용. 각 성의 지원의 상부 저수지에 0.1 ㎖의 RPMI +를 추가합니다. 5 % CO 2와 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 2 일마다 배지를 교체합니다. 먼저, 대기음 하부 저장조이어서 상부 리저버로부터 중간 및 하부 저장조 (0.6 ㎖)에 역순으로 신선한 RPMI +를 적용한 후 상부 rese에rvoir (0.1 mL)을 첨가 하였다. </li><li> 세븐 일 5637 세포 투과성 지원을 파종 한 후, 세포의 합류를 평가합니다. RPMI + (~ 0.35 ㎖)으로 상부 저수지를 입력합니다. 매체는 상부 및 하부 저장조 사이 평형화되지 않는 경우 셀을 충분히의 합류. </li></ol> 3. 세균 접종의 준비 <ol><li> 무균 기술을 사용하여, 모자와 250 ㎖의 플라스크에 적합한 배양액 20 ㎖를 추가합니다. E.에 루리아 - 베르 타니 (LB) 국물을 사용하여 대장균 문화, 그리고 적절한 국물에 항생제를 추가합니다. </li><li> 멸균 접종 루프를 사용하여 글리세롤 재고 세균이나 줄무늬 판과 국물을 접종. UPEC 균주를 들어, (1 형 필리의 생산을 촉진하기 위해) 동요하지 않고, 약 16 시간 동안 37 ° C에서 세균성 문화를 배양한다. </li><li> 원심 분리기 튜브에 박테리아 문화를 전송합니다. 10 분 8,000 XG에서 원심 분리하여 박테리아 펠렛. </li><li> 뜨는을 가만히 따르다와 ~ 10 9 CFU / ㎖에 해당 = 1.000 (600)를 과다 복용 PBS에있는 박테리아를 재현 탁. <ol><li> 열 살해 세균의 자극을 생성하려면, 나누어지는 30 분 동안 55 ° C에서 재 부유 세균 (150 μL의 예 ~ 1.5 × 10 8 CFU)을 배양한다. 세균의 죽음을 확인하기 위해 열 죽인 정지 나누어지는 플레이트. </li></ol></li><li> 즉시 사용하기 전에, 재 부유 세균 (라이브 또는 열 사망) 10 배 따뜻한 혈청 RPMI 8 CFU / ㎖ ~ 10은 미세 원심 분리 튜브에 [RPMI-되나] 희석. </li></ol> 4. 말초 혈액에서 인간의 호중구의 분리 성인 자원 봉사자의 혈액의 컬렉션은 사전 검토 및 기관 검토위원회의 승인을 필요로합니다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하고 적절하게 인간의 혈액에 노출을 방지하기 위해 유해 물질의 폐기. <ol><li> 건강한 성인 V에서 정맥 혈액의 약 25 ㎖의olunteer은 정맥 절개에 훈련 된 직원 3 멸균 나트륨 헤파린 함유 혈액 수집 튜브로 유입되어야한다. <ol><li> 단단히 팔꿈치 위, 팔 위쪽 주위에 고무 지혈대를 감 쌉니다. </li><li> 멸균 70 %의 알코올을 사용하여 닦아, 엔트리 사이트, 전주 포사 소독. </li><li> 나비 날개 바늘 시스템에 플라스틱 관 홀더를 부착합니다. </li><li> 를 향하도록 30 ° 각도 이하, 경사에서 전주 정맥에 바늘을 삽입합니다. 혈액의 분출은 플라스틱 튜브에 나타날 때 바늘이 정맥 구멍이있다. </li><li> 플라스틱 튜브 홀더에 채 혈관을 삽입한다. 제 포집 관이 가득 차면, 제 포집 관으로 대체. 세 번째 튜브를 반복합니다. </li><li> 세 번째 컬렉션 튜브 약 절반 가득 차있을 때, 지혈대를 제거합니다. </li><li> 멸균 면봉으로 구멍 사이트를 덮고 천천히 정맥에서 바늘을 철회. 바늘과 장소 난을 통해 방어 태세를 밀어NA의 생물은 용기를 날카로운 물건. </li><li> 펑크 사이트에 압력을 적용합니다. 접착 붕대 구멍 사이트와면 공을 커버. </li><li> 부드럽게 헤파린을 분산시키는 혈액 수집 튜브를 반전. </li></ol></li></ol> 무균 기술을 사용하여 조직 문화 후드에서 다음 단계를 수행합니다. <ol start="2"><li> 10 ㎖ 피펫을 사용하여 부드럽게 신선한, 멸균 50 ML 원뿔 튜브에 혈액을 전송합니다. 3 %의 해당하는 양 (W / V) 덱스 트란 0.9 % 염화나트륨의 추가와 반전으로 섞는다. 20 분 동안 실온에서 직립 관을 배양한다. </li><li> 하층을 방해하지 않고 조심스럽게 상층 대기음 새로운 50 ㎖ 원추형 튜브에 옮긴다. 10 분 300 XG에서 원심 분리하여 펠렛은 세포. 상층 액을 버린다. </li><li> 혈액의 초기 부피에 상당 0.9 %의 NaCl의 양에서 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 세포 현탁액, P 하에서 밀도 원심 용액 10 ㎖ 레이어두 개의 상 사이의 계면을 예약. 없이 브레이크와 30 분 400 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버린다. </li><li> 잔류 적혈구를 용해하기 위해, 10 ㎖의 차가운 0.2 %의 NaCl에서 세포 펠렛을 재현 탁. 30 초 동안 배양 한 다음 즉시 등장 성을 복원하기 위해 10 ㎖ 차가운 1.6 %의 NaCl을 추가합니다. </li><li> 6 분 300 XG에서 원심 분리하여 펠렛은 세포. 상층 액을 버린다. </li><li> 세포 펠렛은 적혈구, 용해의 일반적으로 3 라운드를 무료로 나타날 때까지 반복 4.6-4.7 단계를 반복합니다. </li><li> 1000 μL 피펫을 사용하여, 소재, 세포 펠렛 주로 PMN을 재현 탁 따뜻한 (37 ° C)로 RPMI-세포 혈구를 사용하여 계산하여 결정될 10 7 세포 / ㎖의 농도. 사용할 때까지 37 ° C에서 세포를 유지합니다. 각각 염색 후 핵 형태의 트리 판 블루 배제 및 시각화에 의해 평가 일반적으로, PMN 생존 및 순도는&gt; 99 %이다. </li></ol> 5. Transuroepithelial 호중구 마이그레이션으로말 무균 기술을 사용하여 조직 문화 후드에서 다음 단계를 수행합니다. 단계 2.7에서의 결정에 따라, 융합 5637 세포층 베어링 만 투과 지원을 사용합니다. 포함하는 24 - 웰 플레이트 RPMI은 - 수 있습니다 사전에 준비하고, 5 % CO 2 사용할 때까지와 37 ° C로 유지 될 수있다. <ol><li> 나누어지는 1은 24 - 웰 플레이트에 RPMI 당을 잘 따뜻하게 밀리리터, 투과 지원 당 3 우물을 준비합니다. </li><li> 투과성 지지체의 상부 및 하부에서 저장조 매체 대기음. </li><li> 멸균 집게를 사용하여, 단계 5.1에서 제조 된 24 웰 플레이트에 투과 지원을 전송합니다. 잘에서 잘으로 지원을 전송하여 투과 지원을 세 번 씻으십시오. </li><li> 세균 접종 물이 사용되는 경우, 무균 25mm 깊은 조직 배양 접시에 투과성 지지체를 반전. 화학 유인 물질 (예를 들어, N-포르 밀 메트로 - 레우 - 반페 (fMLF) 또는 IL-8)를 사용하는 경우, 5.6 단계로 진행합니다. </li><li> 라이브 또는 사망 BACT와 실험erial 자극, 60 μL RPMI-(모의 감염)이나 세균 접종 단계 3.5에서 준비 (6 × 10 6 CFU)에 각 성의 지원의 혀끝의 측면을 접종. 접시에 뚜껑을 넣고 1 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 24 웰 로우 부착 판에 잘 RPMI 당 0.6 ML을 추가, 투과 지원 기준도 1을 준비합니다. RPMI이 -하는 PMN 입력을 열거 0.5 ㎖를 포함하는 3 우물을 준비합니다. <ol><li> 화학 유인 물질은 박테리아 대신에 사용되는 경우, 단계 14.3에서 제조 된 24 - 웰 플레이트 RPMI-0.6 ml로 화학 유인 물질을 추가한다. </li></ol></li><li> 24 웰 로우 부착 판에 마우스 오른쪽 투과 지원합니다. </li><li> 각 성의 지원의 상부 저수지 (기저 측)에, 단계 4.9 준비 0.1 ML PMN (10 6 PMN)를 추가합니다. 직접 500 μl를 포함하는 우물에 100 μL의 PMN 추가 RPMI을. 1 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 알을 품다. </li><li> 멸균 집게를 사용하여 부드럽게 긁어우물의 가장자리에 투과 지원의 멤브레인은 혀끝의 측면에서 추가 PMN을 제거하고 지원을 처분한다. </li><li> 부드럽게 1,000 μL 피펫 팁을 잘 각각의 바닥을 긁어 PMN를 수집하고, 튜브의 미세하기 PMN 현탁액을 전송합니다. </li><li> 혈구를 사용하여 PMN을 열거합니다. </li><li> 하부 리저버에 PMN의 총 수를 계산하기 위해, 6000에 의해 1mm이있는 PMN의 개수 (100 NL)를 곱한다. PMN 번호 10 6 입력 PMN 정상화로 데이터가 입력 PMN의 백분율로보고하거나 할 수있다. </li></ol>

<ol>
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배양 방광 상피 세포 라인과 갓 고립 된 인간의 PMN을 사용하여, 우리는 transuroepithelial 호중구 이주의 체외 모델을 설립했다. 이 모델은 요로 감염 (UTI) 동안 선천성 면역 반응, 일반적으로 UPEC (9)에 의해 발생하는 매우 흔한 세균 감염의 복잡성을 해부하기 시작있는 수단이되었습니다. 방광이나 방광염의 감염 동안, 방광 루멘 PMN 모집 세균 통관 (10)을 위해 필수적입니다. 염?...

몸 전체 세포의 이동은 종종 긴 거리에 걸쳐, 성장과 발달, 상처 치유 및 면역 반응에 필요합니다. 세포 이동은 복잡하고 신호 폭포와 골격 구성 요소의 재 배열 등 다양한 프로세스의 조정을 필요로한다. 세포는 정의 화학 그라데이션 (화성)으로 무작위로 (chemokinesis)를 이동뿐만 아니라 수 있습니다. 대부분의 기술은 체외에서 세포의 이동을 연구하기 위해 개발되었다. 가장 오래되고 가장 일반적인 방법, 보이든 챔버, 화학 주성 물질이 바닥 챔버와 그 세포에 배치 수직 두 개의 챔버 시스템의 구성은 상단 챔버 (1)에 배치됩니다. 두 개의 챔버를 분리 정의 된 크기의 기공을 가진 투과 필터를 통해 세포의 이동, 감시된다. 그 밖의 기술은 Zigmond 챔버 (2) 및 던 챔버 포함한 세포 이동을 조사하기 위해 개발되었다3. 이러한 집단적인 접근 방식은 다양한 세포 유형의 운동으로 상당한 통찰력을 수득했다. chemokinesis 및 주 화성의 기본 원리를 질의 이외에,이 챔버 분석법은 세포 외 기질 성분과 모두 내피와 상피 세포층을 통한 세포 이동의 조사를 용이하게했다. 다른 기술을 통해 두 챔버 시스템의 장점은 다공성 멤브레인이 콜라겐 또는 피브리노겐과 같은 단백질로 코팅 될 수 있으며, 세포 외 기질 같은 절연막의 세포 이동이 평가 될 수 있다는 점이다. 또한, 배양 된 세포주 성장 및 투과성 지지체에 차별화 될 수있다. 내피 세포 장벽을 가로 질러 세포의 움직임을 조사하기 위해, 배양 된 내피 세포 투과성 지지체의 상부 리저버에 접종하고 성장시킨다. 이러한 면역 세포와 같은 운동성 세포, EN에 걸쳐 낮은 저수지에 상부 저수지 및 마이그레이션에 추가생리적 정점 - 투 - 기저 방향으로 내피 장벽이 관찰된다. 이 모델은 혈류 중 면역 세포의 혈관 외 유출을 이해하는 귀중한되었습니다. 옮기는 내피 달리 상피 장벽을 가로 질러 세포의 이동은 일반적 측저에서 첨단으로의 방향에서 발생한다. 시험관에 이러한 이벤트를 모델링하기 위하여, 연구자들은 시드 및 투과성 지지체의 아랫면에 배양 된 상피 세포 성장. 운동성 세포 측저에서 첨단으로의 방향을 나타내는 상피 장벽을 가로 질러 상부 리저버와 이주에 첨가되고 모니터링된다. transepithelial 이주의 이러한 모델은 크게 점막 표면에서 염증 반응, 특히 폐의 그와 4,5 창자에 대한 우리의 이해에 기여했다. 반면, 요로 상피 세포를 통해 면역 세포의 인신 매매는 훨씬 적은 관심을 받고있다. 우리 understandi를 더하려면방광 상피 장벽 (6)를 통해 이동, (호중구 PMN) NG uropathogenic 대장균 (UPEC) 감염 중 요로의 선천성 면역 반응, 우리는 다형 핵 백혈구의 조사를 가능하게하는 시험 관내 분석, transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석을 개발 -8. transepithelial 이주의 다른 두 개의 챔버 모델과 마찬가지로, 배양 된 방광 상피 세포 투과성 지원의 밑바닥에 성장과 합류 상피 층을 형성하고 있습니다. 정맥혈로부터 단리 인간 호중구는, 상피 층 측저 측에인가되고, 생리 학적으로 관련 측저에서 첨단으로 방향 상피 전반 마이그레이션 E. 다른 균주 감염에 반응하여 정량화 대장균 또는 화학 유인 물질 분자의 존재. 많은 연구가 추가로 세포 유형의 부재에서, 호중구의 이동에 chemokinesis 및 화성 모두를 집중했다. 이 계정에 감염 동안 방광 상피 세포와 면역 세포 사이의 복잡한 상호 작용을 걸립니다 transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석은 유리하다. 이 다루기 쉬운 체외 모델 Uroepithelial에 표면에 면역 반응의 상세한 조사를 허용 할 가능성이있다.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Inserts (i.e.&#160;permeable supports)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td>6.5 mm, 3 &#956;m pore, polyester membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>366480</td>
			<td>16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>367281</td>
			<td>21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer one-use, nonstackable holder</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>364815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4876</td>
			<td>From Leuconostoc mesenteroides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td>24-well, clear flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reconstituted in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CXCL8/IL-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL</td>
			<td>Reconstituted in PBS to 100 &#956;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative assessment of human neutrophil migration across a cultured bladder epithelium

염증의 사이트에 주변에서 면역 세포의 모집은 점막 표면에서의 선천성 면역 반응에 필수적인 단계입니다. 방광의 감염시, 다형 핵 백혈구 (PMN, 호중구)는 혈류에서 마이그레이션 및 방광 상피 세포를 통과. 호중구 응답이없는 상태에서 감염을 해결하지 않으면 방광 방어 PMN의 중요성을 보여줍니다. 방광 상피 uropathogenic 대장균 (UPEC)의 정착을 촉진하기 위하여, 요로 감염 (요로 감염)의 대부분의 원인 물질은, 부분적으로 정의 된 다양한 메커니즘을 사용하여 급성 염증 반응을 저해. 추가 호스트 및 세균성 병원체 사이의 상호 작용을 조사하기 위해, 우리는 UPEC에 타고난 면역 반응의 이러한 측면의 체외 모델을 개발했다. transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석에서, 보이든 챔버의 변형, 배양 방광 epithelial 세포 투과성 지원의 아래쪽에 합류로 성장하고 있습니다. PMN 인간 정맥 혈액으로부터 격리되어 방광 상피 세포층의 측저 측에인가된다. 세균 감염이나 화학 유인 물질 분자에 대한 응답으로 생리학 관련 기저 첨단으로 방향을 나타내는 PMN 마이그레이션은 혈구를 사용하여 열거됩니다. 이 모델은 UPEC 및 진핵 세포 사이의 상호 작용을 조사 할뿐만 아니라 PMN 의해 방광 상피의 순회를위한 분자 요구를 심문하는 데 사용될 수있다. transuroepithelial 호중구 마이그레이션 모델은 방광에 UPEC에 대한 초기 염증 반응에 대한 우리의 이해를 증진 할 것이다.

transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석은 다양한 자극 (그림 1B)에 대한 응답에서 배양 방광 상피 세포 층에 걸쳐 인간의 PMN 이동의 정량적 인 평가를 가능하게한다. 프로토콜은 간단하지만, PMN 이주 영향 결과적으로 본 분석의 재현성에 영향을 미칠 수있는 변수의 개수가있다. 기술 및 생물 복제물 사이의 변동성을 감소시키는 투과성 지지체와 PMN을 준비하는 동안의 대책이되어야?...

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Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

우리는 uropathogenic 대장균 방광 감염 동안 급성 염증 반응의 중요 성분을 모방 체외 모델을 개발 하였다. transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석은 세균 감염이나 화학 유인 물질에 대한 응답으로, 투과 지원에서 배양, 방광 상피를 통해 인간의 호중구 이주의 양적 평가를 할 수 있습니다.

교양 방광 상피 세포 간 인간 호중구 이주의 정량 평가

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

quantitative-assessment-human-neutrophil-migration-across-cultured

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.0K 조회수.  Washington University School of Medicine.  우리는 uropathogenic 대장균 방광 감염 동안 급성 염증 반응의 중요 성분을 모방 체외 모델을 개발 하였다. transuroepithelial 호중구 마이그레이션 분석은 세균 감염이나 화학 유인 물질에 대한 응답으로, 투과 지원에서 배양, 방광 상피를 통해 인간의 호중구 이주의 양적 평가를 할 수 있습니다. 

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Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular matrix proteins. The precise spatiotemporal activation of integrins from a low affinity state to a high affinity state at the cell leading edge is important for T lymphocyte migration 1. Likewise, retraction of the cell trailing edge, or uropod, is a necessary step in maintaining persistent integrin-dependent T lymphocyte motility 2. Many therapeutic approaches to autoimmune or inflammatory diseases target integrins as a means to inhibit the excessive recruitment and migration of leukocytes 3. To study the molecular events that regulate human T lymphocyte migration, we have utilized an in vitro system to analyze cell migration on a two-dimensional substrate that mimics the environment that a T lymphocyte encounters during recruitment from the vasculature. T lymphocytes are first isolated from human donors and are then stimulated and cultured for seven to ten days. During the assay, T lymphocytes are allowed to adhere and migrate on a substrate coated with intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), a ligand for integrin LFA-1, and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1). Our data show that T lymphocytes exhibit a migratory velocity of ~15 &mu;m/min. T lymphocyte migration can be inhibited by integrin blockade 1 or by inhibitors of the cellular actomyosin machinery that regulates cell migration 2.

Human T Lymphocyte Isolation, Culture and Analysis of Migration In Vitro

T lymphocyte migration occurs during homing to lymphoid organs, exit from the vasculature, and entering into peripheral tissues. Here, we describe a protocol that can be used to analyze T lymphocyte migration in vitro.

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서</em

The migration of T lymphocytes involves the adhesive interaction of cell surface integrins with ligands expressed on other cells or with extracellular ...

연구

면역학 및 감염병학

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

확장, 정화, 그리고 사람 말초혈 NK 세포 기능 평가

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

추적 호중구 Intraluminal 크롤링, Intravital 비디오 현미경에 의한 조직의 Transendothelial 마이 그 레이션 및 Chemotaxis

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

Phagokinetic 트랙 운동성 분석에 의한 세포 마이그레이션의 수량 평가

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

시험관 내 병원균 유도 호중구 트랜스 상피 이동을 평가하는 공동 문화 분석

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

인간 호중구 유량 용기 접착 분석

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role in fighting infections, recent research has demonstrated that they may be involved in many other disease processes, including cancer progression. Isolating purified NETs is a crucial element to allow the study of these functions.
In this video, we demonstrate a simplified method of cell free NET isolation from human whole blood using readily available reagents. Isolated NETs can then be used for immunofluorescence staining, blotting or various functional assays. This enables an assessment of their biologic properties in the absence of the potential confounding effects of neutrophils themselves.
A density gradient separation technique is employed to isolate neutrophils from healthy donor whole blood. Isolated neutrophils are then stimulated by phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) to induce NETosis. Activated neutrophils are then discarded, and a cell-free NET stock is obtained.
We then demonstrate how isolated NETs can be used in an adhesion assay with A549 human lung cancer cells. The NET stock is used to coat the wells of a 96 well cell culture plate O/N, and after ensuring an adequate NET monolayer formation on the bottom of the wells, CFSE labeled A549 cells are added. Adherent cells are quantified using a Nikon TE300 fluorescent microscope. In some wells, 1000U DNAse1 is added 10 min before counting to degrade NETs

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

In the following protocol, we describe a very simple way to isolate Neutrophil Extracellular traps (NETs) from human whole blood using readily available reagents. We then demonstrate how the isolated NETs can be used in an in vitro adhesion assay with cancer cells.

단순화 된 인간 호중구 세포 외 트랩 (그물)의 분리 및 처리

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

인간 호중구 유래 거 식세포의 소설 모집단의 개발 및 식별<em&gt; 체외</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

생체 외에서 형광 현미경 검사 법에 의해 개 호 중구 Extracellular 함정 형성: 역동적이 고 양적 분석

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

교양 방광 상피 세포 간 인간 호중구 이주의 정량 평가

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