Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health (NIH) unterstützt gewährt R01-DK080752 und P50-DK064540. Wir danken J. Loughman für ihre Bemühungen bei der Schaffung dieses Tests.

1. Kulti 5637 Blase Epithelzellen Führen Sie die folgenden Schritte in einer Laminar-Flow-Gewebekultur Kapuze mit UV-Bestrahlung vorbereitet und sich mit 70% Ethanol abgewischt. <ol><li> Vorbereitung RPMI-1640-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) [bezeichnet RPMI +], Filter sterilisiert unter Verwendung eines 0,22 &amp;mgr; m Porengröße filtriert und warm bis 37 ° C in einem Wasserbad. </li><li> Tauwetter ein Kryoröhrchen von 5637 Zellen (American Type Culture Collection HTB-9, von Blasenkarzinom abgeleitet) in einem 37 ° C Wasserbad. Schnelle Übertragung der aufgetauten Zellen in einer 75 cm 2 Zellkulturflasche mit 20 ml RPMI +. </li><li> Der Kolben wird bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2, bis die Zellen etwa 95% konfluent (~ 6 x 10 6 Zellen pro Kolben), ca. 4 Tage. </li><li> Um die 5637 Zellen Subkultur: <ol><li> Entfernen des Mediums aus der Flasche. Waschen der Zellen mit 10 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Saline (DPBS) bei Raumtemperatur. </li><li> 6 ml warmem (37 ° C) 0,05% Trypsin, 0,02% EDTA-Lösung in den Kolben gegeben, und bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 15 min. </li><li> Übertragen der Zellen in ein 15 ml konischen Röhrchen und Pellet durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min. Entfernen Sie die Trypsin / EDTA-Lösung. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 6 ml RPMI + (10 6 Zellen / ml) und 1 ml (10 6 Zellen) in eine neue 75 cm 2-Kolben mit 20 ml RPMI +. </li></ol></li><li> Wiederholen Sie Schritt 1,4 bis Subkultur Zellen alle 4 Tage oder, wenn die Zellen zu erreichen 95% Konfluenz. </li></ol> 2. Säen und Wachsen 5637 Zellen auf durchlässigem Unterstützt Führen Sie die folgenden Schritte in einer Gewebekultur Haube unter aseptischen Bedingungen. Für optimale Ergebnisse verwenden 5637 Zellen, die weniger als 10 Subkulturen unterzogen haben. <ol><li> Mit einer sterilen Pinzette, kehren die durchlässigen Träger in einer sterilen 25 mm tiefe Gewebekulturschale. </li><li&gt; Trypsinieren eine 75 cm 2-Kolben von 5637 Zellen bei 95% Konfluenz nach den Schritten 1.4.1-1.4.3. </li><li> Verwendung einer 1,000 ul-Pipette vorsichtig resuspendieren in ~ 2 ml RPMI + in einer Konzentration von 3 x 10 6 Zellen / ml, die durch Zellzählung unter Verwendung einer Zählkammer bestimmt. </li><li> Anwenden 50 ul der Zellsuspension (1,5 x 10 5 Zellen) in jede durchlässige Träger ohne Berührung der Membran. Den Deckel auf die Schüssel, und vorsichtig die Schale bei 37 ° C mit 5% CO 2 für nicht mehr als 16 Stunden. </li><li> Mit einer sterilen Pinzette, rechts die durchlässigen Träger in eine 24-Well-Platte mit 0,6 ml RPMI + pro Vertiefung. 0,1 ml RPMI + in den oberen Stausee von jedem durchlässigen Träger. Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2. </li><li> Ersetzen Sie das Medium alle 2 Tage. Zuerst saugen Medium aus dem Oberbecken, gefolgt von dem Unterbecken, und dann gilt frischem RPMI + in umgekehrter Reihenfolge, um das untere Reservoir (0,6 ml) und dann den oberen Reservoir (0,1 ml). </li><li> Sieben Tage nach dem Aussäen der durchlässigen Träger mit 5637 Zellen beurteilen Konfluenz der Zellen. Füllen Sie das Oberbecken mit RPMI + (~ 0,35 ml). Die Zellen konfluent genug, wenn das Medium nicht zwischen den oberen und unteren Behältern äquilibrieren. </li></ol> 3. Herstellung des bakteriellen Inokulums <ol><li> Unter aseptischen Bedingungen 20 ml geeigneten Kulturbrühe in einen 250-ml-Kolben mit einer Kappe. Verwenden Luria-Bertani (LB)-Bouillon für die E. coli-Kulturen, und Antibiotika hinzufügen, um die Brühe gegebenenfalls. </li><li> Mit einer sterilen Impföse, impfen die Brühe mit Bakterien aus einem Glycerin-Lager oder einem Streifen Platte. Für UPEC Stämme, Inkubation der Bakterienkultur bei 37 ° C für ca. 16 h ohne Schütteln (zur Förderung der Produktion von Typ-1-Pili). </li><li> Übertragen die Bakterienkultur in ein Zentrifugenröhrchen. Pellet die Bakterien durch Zentrifugation bei 8.000 × g für 10 min. </li><li> Den Überstand umfüllenUnd Resuspendieren der Bakterien in PBS auf eine OD 600 = 1,000, entsprechend ~ 10 9 CFU / ml. <ol><li> Um eine durch Wärme abgetöteten Bakterien Stimulus erzeugen, Inkubation eines Aliquots (z. B. ~ 1,5 × 10 8 CFU in 150 &amp;mgr; l) der resuspendierten Bakterien bei 55 ° C für 30 min. Platte einen aliquoten Teil der Hitze abgetötete Bakteriensuspension auf den Tod bestätigen. </li></ol></li><li> Unmittelbar vor der Anwendung verdünnen die Bakterien resuspendiert (live oder Hitze abgetöteten) 10-fach bis 10 8 CFU / ml in warmen Serum-freien RPMI [bezeichnet RPMI-] in ein Mikrozentrifugenröhrchen. </li></ol> 4. Isolierung menschlicher Neutrophile aus peripherem Blut Die Sammlung von Blut von erwachsenen Freiwilligen bedarf der vorherigen Prüfung und Genehmigung von einem Institutional Review Board. Tragen Sie geeignete Schutzausrüstung und entsorgen Gefahrstoffe, um die Exposition der menschlichen Blut zu vermeiden. <ol><li> Etwa 25 ml venöses Blut von gesunden Erwachsenen volunteer sollte durch geschultes Personal in Aderlass in 3 sterile Natrium-Heparin-haltigen Blutentnahmeröhrchen gezogen werden. <ol><li> Dicht wickeln eine Gummiaderpresse um den Oberarm, über dem Ellbogen. </li><li> Desinfizieren Sie die Eintrittsstelle, die Ellenbeuge, mit einer sterilen 70% Alkoholtupfer. </li><li> Bringen Sie ein Kunststoffrohrhalter zu einem geflügelten Butterfly-Nadel-System. </li><li> Führen Sie die Nadel in eine Antekubitalvene in einem 30 °-Winkel oder weniger, Kegel nach oben ein. Die Nadel in die Vene punktiert, wenn ein Strahl von Blut in dem Kunststoffrohr angezeigt wird. </li><li> Legen Sie eine Blutentnahmeröhrchen in die Kunststoffrohrhalter. Wenn die erste Sammelrohr voll ist, ersetzen mit der zweiten Sammelrohr. Wiederholen Sie mit der dritten Röhre. </li><li> Wenn die dritte Sammelrohr ist etwa halb voll ist, entfernen Sie den Stauschlauch. </li><li> Decken Sie die Einstichstelle mit einem sterilen Wattebausch und langsam aus der Vene ziehen Sie die Nadel. Schieben Sie den Schutzschirm über der Nadel und Ort ina Biohazard Behälter für scharfe Gegenstände. </li><li> Üben Sie Druck auf die Einstichstelle. Decken Sie die Einstichstelle und Wattebausch mit einem Pflaster. </li><li> Vorsichtig invertieren die Blutentnahmeröhrchen, um die Heparin zu zerstreuen. </li></ol></li></ol> Führen Sie die folgenden Schritte in einer Gewebekultur Haube unter aseptischen Bedingungen. <ol start="2"><li> Mit einem 10 ml-Pipette vorsichtig das Blut zu übertragen, um eine frische, sterile 50 ml konischen Röhrchen. Hinzufügen eines äquivalenten Volumens von 3% (w / v) Dextran in 0,9% NaCl und mischen durch Umkehrung. Das Röhrchen stehend bei Raumtemperatur für 20 min. </li><li> Ohne Unterbrechung der unteren Schicht, sorgfältig absaugen obere Schicht und die Übertragung auf einen neuen 50 ml konischen Röhrchen. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min. Überstand verwerfen. </li><li> Zellpellet in einem Volumen von 0,9% NaCl äquivalent zu dem Ausgangsvolumen des Blutes. </li><li> Schicht 10 ml Dichtezentrifugation Lösung unter der Zellsuspension, S.Reservierung der Grenzfläche zwischen den beiden Phasen. Zentrifuge bei 400 × g für 30 min ohne Bremse. Überstand verwerfen. </li><li> Um verbleibenden roten Blutkörperchen lysiert, Zellpellet in 10 ml kaltem 0,2% NaCl. Inkubation für 30 Sekunden, und dann sofort 10 ml kaltem 1,6% NaCl in den Isotonie wieder herzustellen. </li><li> Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 6 min. Überstand verwerfen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte, bis 4,6-4,7 das Zellpellet erscheint frei von roten Blutzellen, in der Regel drei Runden der Lyse zu sein. </li><li> Verwendung eines 1,000 &amp;mgr; Pipette Zellpellet, in erster Linie PMN, in warmem (37 º C) RPMI in einer Konzentration von 10 7 Zellen / ml, die durch Zellzählung unter Verwendung einer Zählkammer bestimmt. Halten der Zellen bei 37 ° C bis zur Verwendung. Typischerweise PMN Lebensfähigkeit und Reinheit&gt; 99%, wie durch Trypanblau-Ausschluß und Visualisierung von Kernmorphologie nach Färbung bzw. beurteilt. </li></ol> 5. Transuroepithelial Neutrophilen-Migration alssagen Führen Sie die folgenden Schritte in einer Gewebekultur Haube unter aseptischen Bedingungen. Verwenden Sie nur durchlässigen Träger Lager 5637 konfluenten Zellschichten, wie in Schritt 2.7 bestimmt. Die 24-Well-Platten, enthaltend RPMI-können im Voraus hergestellt werden, und bei 37 ° C gehalten, mit 5% CO 2 bis zur Verwendung. <ol><li> Aliquot 1 ml RPMI-erwärmen pro Well in einer 24-Well-Platte; vorbereiten 3 Wells pro lässigen Träger. </li><li> Aspiration des Mediums von den oberen und unteren Reservoirs der durchlässigen Träger. </li><li> Mit einer sterilen Pinzette, übertragen Sie die durchlässigen Träger an die 24-Well-Platte in Schritt 5.1 vorbereitet. Drei Mal durch die Übertragung der Unterstützungen von Brunnen zu Brunnen Waschen der durchlässigen Träger. </li><li> Wenn eine bakterielle Inokulum verwendet werden, kehren die durchlässige Träger in einer sterilen 25 mm tiefe Gewebekulturschale. Wenn ein chemoattractant (zB N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF) oder IL-8) verwendet werden soll, gehen Sie zu Schritt 5.6. </li><li> Für Experimente mit lebenden oder getötet bactErial Stimuli inokulieren der apikalen Seite einer jeden durchlässigen Träger mit 60 ul RPMI-(Mock-Infektion) oder mit dem bakteriellen Inoculum (6 × 10 6 CFU) in Schritt 3.5 hergestellt. Den Deckel auf die Schüssel und bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 1 Stunde. </li><li> In 0,6 ml RPMI-pro auch auf eine 24-Loch-Low-Befestigungsplatte, bereiten ein gut durchlässigen Träger pro. Bereiten 3 Brunnen mit 0,5 ml RPMI-zu Eingangs PMN aufzuzählen. <ol><li> Wenn ein chemoattractant wird an Stelle von Bakterien verwendet wird, fügen Sie die chemoattractant auf 0,6 ml RPMI-in der 24-Well-Platte in Schritt 5.6 vorbereitet. </li></ol></li><li> Rechts die durchlässigen Träger in den 24-Loch-Low-Befestigungsplatte. </li><li> 0,1 ml PMN (10 6 PMN), die in Schritt 4.9 hergestellt, mit dem oberen Behälter (basolateralen Seite) einer jeden durchlässigen Träger. 100 l PMN direkt an Vertiefungen mit 500 ul RPMI-. Inkubieren bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 1 Stunde. </li><li> Mit einer sterilen Pinzette vorsichtig kratzen dieMembran des durchlässigen Träger gegen den Rand der Vertiefung zusätzliche PMN von der apikalen Seite zu entfernen, und dann entsorgt des Trägers. </li><li> Sammeln PMN durch leichtes Kratzen der Boden jeder gut mit dem 1000 ul Pipettenspitze und übertragen PMN Suspensionen Mikrozentrifugenröhrchen auf. </li><li> Auflisten von PMN mit einer Zählkammer. </li><li> Um die Gesamtzahl von PMN in das untere Reservoir berechnen, multiplizieren Sie die Anzahl der PMN in 1 mm 2 (100 nl) von 6000. Daten können als Prozentsatz der Eingangs PMN gemeldet werden, oder als PMN Nummern 10 6 PMN Eingangs normalisiert. </li></ol>

<ol>
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Biol. 341, 205-215 (2006).</li><li>S&#228;ve, S., Mohlin, C., Vumma, R., Persson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+adenosine+A2A+receptors+inhibits+neutrophil+transuroepithelial+migration.">Activation of adenosine A2A receptors inhibits neutrophil transuroepithelial migration.</a> Infect. Immun. 79, 3431-3437 (2011).</li><li>Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Escherichia+coli+induces+transuroepithelial+neutrophil+migration+by+an+intercellular+adhesion+molecule-1-dependent+mechanism.">Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism.</a> Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).</li><li>Hung, C. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+urinary+tract+infection.">A murine model of urinary tract infection.</a> Nat. Protoc. 4, 1230-1243 (2009).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Mit einem kultivierten Blasenzelllinie und frisch isolierten menschlichen PMN, haben wir ein in vitro Modell der transuroepithelial Migration von Neutrophilen. Dieses Modell wurde bei der Anfang, um die Komplexität der angeborenen Immunantwort während Harnwegsinfektion (HWI), eine extrem häufige bakterielle Infektion in der Regel durch UPEC 9 verursacht sezieren. Während der Infektion der Blase oder Zystitis ist Rekrutierung von PMN zu den Blasenlumen wichtig für bakterielle Clearance 10.</...

Die Bewegung der Zellen im gesamten Körper, oft über lange Strecken, für Wachstum und Entwicklung, Wundheilung, Immunantwort und erforderlich. Zellmigration ist komplex und erfordert die Koordinierung der verschiedenen Verfahren, einschließlich Signalkaskaden und die Umlagerung von Zytoskelett-Komponenten. Die Zellen können nach dem Zufallsprinzip zu definierten chemischen Gradienten (Chemotaxis) bewegen (Chemokinese) sowie. Viele Techniken wurden entwickelt, um die Zellmigration in vitro zu studieren. Die älteste und am weitesten verbreitete Technik, die Boyden-Kammer, bestehend aus einer vertikalen Zweikammersystem, in dem eine chemoattraktive Substanz in der unteren Kammer und die interessierenden Zellen angeordnet sind in der oberen Kammer 1 angeordnet. Die Bewegung der Zellen über die durchlässige Filter mit Poren definierter Größe zwischen den beiden Kammern wird überwacht. Zusätzliche Techniken entwickelt worden, um Zellmigration zu untersuchen, einschließlich der Zigmond Kammer 2 und der Kammer Dunn3. Diese kollektive Ansätze wichtige Einblicke in die Bewegung von vielen verschiedenen Zelltypen ergeben. Zusätzlich zur Abfrage der Grundprinzipien der Chemokinese und Chemotaxis, haben Zweikammer-Tests für die Untersuchung von Zellmigration durch extrazelluläre Matrixkomponenten und sowohl endotheliale und epitheliale Zellschichten erleichtert. Ein Vorteil des Zweikammersysteme gegenüber anderen Techniken ist, dass die poröse Membran mit Proteinen wie Kollagen oder Fibrinogen beschichtet werden, und die Zellmigration in einem extrazellulären Matrix-ähnlichen Barriere kann beurteilt werden. Zusätzlich kann kultivierten Zelllinien gezüchtet und auf den durchlässigen Träger unterschieden werden. Um die Bewegung von Zellen in einer endothelialen Barriere zu untersuchen, werden kultivierte Endothelzellen ausgesät und in das obere Reservoir der durchlässigen Träger aufgewachsen. Bewegliche Zellen, wie Immunzellen, sind in den oberen Stausee und Migration in das untere Reservoir über die en hinzugefügtEndothel-Barriere in der physiologischen apikal-to-basolateralen Richtung beobachtet wird. Dieses Modell wurde im Verständnis Extravasation von Immunzellen aus dem Blutstrom von unschätzbarem Wert. Im Gegensatz zu transendotheliale Migration, die Bewegung von Zellen in einer epithelialen Barriere tritt typischerweise in der basolateralen-zu-apikal. Um diese Ereignisse in-vitro-Modell, Forschern und Samen wachsen kultivierten Epithelzellen an der Unterseite der durchlässigen Träger. Bewegliche Zellen werden in das obere Reservoir und Migration über die epitheliale Barriere, die die basolaterale-zu-apikal zugegeben wird überwacht. Solche Modelle der transepithelialen Migration haben wesentlich zu unserem Verständnis von Entzündungsreaktionen an Schleimhautoberflächen, insbesondere der Lunge und Darm 4,5 beigetragen. Im Gegensatz dazu hat Immunzelltransport durch das Epithel der Harnwege viel weniger Aufmerksamkeit erhalten. Um unsere understandi weiter(; Neutrophilen PMN) Bewegung über eine Blase epithelialen Barriere 6 ng der angeborenen Immunantwort in den Harnwegen während der Infektion mit uropathogenen Escherichia coli (UPEC), einem in-vitro-Test, der die Migration von Neutrophilen transuroepithelial Assay, die Untersuchung von polymorphkernigen Leukozyten ermöglicht entwickelten wir -8. Wie bei anderen Zweikammer-Modelle der transepithelialen Migration werden kultivierten humanen Epithelzellen der Blase an der Unterseite einer durchlässigen Träger gewachsen und bilden konfluente epitheliale Schichten. Menschliche Neutrophile aus venösem Blut isoliert werden zur basolateralen Seite der epithelialen Schicht aufgebracht, und die Migration in das Epithel im physiologisch relevanten basolateralen zu apikaler Richtung in Reaktion auf eine Infektion mit verschiedenen Stämmen von E. quantifiziert coli oder das Vorhandensein von chemoattraktiven Moleküle. Viel Forschung auf Neutrophilen Bewegung konzentriert hatte, sowohl Chemokinese und Chemotaxis, in Abwesenheit von zusätzlichen Zelltypen. Die transuroepithelial Migration von Neutrophilen-Test ist von Vorteil, da es berücksichtigt komplexen Wechselwirkungen zwischen Blase Epithelzellen und Immunzellen während der Infektion. Diese gefügig in vitro-Modell hat das Potenzial, um die detaillierte Untersuchung von Immunreaktionen bei uroepithelial Oberflächen zu ermöglichen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell Inserts (i.e.&#160;permeable supports)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3472</td>
			<td>6.5 mm, 3 &#956;m pore, polyester membrane insert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>366480</td>
			<td>16 mm x 100 mm x 10 ml green cap tubes containing sodium heparin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Safety-Lok Blood Collection and Infusion Set</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>367281</td>
			<td>21 G x 0.75 in needle x 12 in tubing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer one-use, nonstackable holder</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company (BD)</td>
			<td>364815</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4876</td>
			<td>From Leuconostoc mesenteroides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS density centrifugation solution</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-Low Attachment Plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3473</td>
			<td>24-well, clear flat bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLF)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3506</td>
			<td>Reconstituted in DMSO to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human CXCL8/IL-8</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>208-IL</td>
			<td>Reconstituted in PBS to 100 &#956;g/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative assessment of human neutrophil migration across a cultured bladder epithelium

Die Rekrutierung von Immunzellen von der Peripherie zum Ort der Entzündung ist ein wesentlicher Schritt bei der angeborenen Immunantwort zu jedem Schleimhautoberfläche. Während der Infektion der Harnblase, polymorphkernige Leukozyten (PMN; Neutrophile) wandern aus dem Blutkreislauf zu durchqueren und die Blase Epithel. Nicht Infektion in Abwesenheit einer Antwort neutrophilen beheben zeigt die Bedeutung der PMN in der Blase Verteidigung. Zur Besiedlung der Blase Epithel, uropathogenen Escherichia coli (UPEC) zu erleichtern, der Erreger der Mehrheit der Harnwegsinfektionen (HWI), dämpfen die akute Entzündungsreaktion mit einer Vielzahl von teilweise definierten Mechanismen. Zur weiteren Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Wirt und Bakterien-Pathogen, ein in vitro-Modell von diesem Aspekt der angeborenen Immunantwort zu UPEC entwickelten wir. In der transuroepithelial Migration von Neutrophilen-Test, eine Variante der Boyden-Kammer, kultivierte Blase epithElial Zellen gezüchtet werden, um auf die Unterseite eines durchlässigen Träger Konfluenz. PMN aus menschlichem venösem Blut isoliert und zur basolateralen Seite der Blase epithelialen Zellschichten aufgebracht. PMN-Migration, das die physiologisch relevante basolateralen zu apikaler Richtung in Reaktion auf eine bakterielle Infektion oder chemoattraktive Moleküle mit einer Zählkammer gezählt. Dieses Modell kann verwendet werden, um Wechselwirkungen zwischen UPEC und eukaryontischen Zellen zu untersuchen sowie die molekularen Anforderungen für die Durchquerung von Blasen Epithelien von PMN abzufragen. Die Migration von Neutrophilen transuroepithelial Modell wird unser Verständnis der Anfangs entzündliche Reaktion auf UPEC in der Blase zu fördern.

Die transuroepithelial Neutrophilenmigration Assay ermöglicht die quantitative Bewertung der menschlichen PMN-Migration in kultivierten Epithelzellen Blasenschichten als Reaktion auf verschiedene Reize (Abbildung 1B). Während das Protokoll ist einfach, es gibt eine Reihe von Variablen, die PMN-Migration zu beeinflussen und folglich auf die Reproduzierbarkeit des Assays kann. Die Maßnahmen sollten während der Vorbereitung die durchlässigen Träger und der PMN an Variabilität zwischen technischen un...

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Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Wir entwickelten ein in vitro-Modell, das eine wichtige Komponente der akuten Entzündungsreaktion während der Infektion der Blase mit uropathogenen Escherichia coli nachahmt. Die transuroepithelial Neutrophilenmigration Assay erlaubt die quantitative Beurteilung der humanen neutrophilen Migration über Blasen Epithelien auf lässigen Träger kultiviert, in Reaktion auf eine bakterielle Infektion oder chemoattraktiven Stoffen.

Quantitative Bewertung der humanen neutrophilen Migration Über eine Zucht Blasenepithel

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

quantitative-assessment-human-neutrophil-migration-across-cultured

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.0K Aufrufe.  Washington University School of Medicine.  Wir entwickelten ein in vitro-Modell, das eine wichtige Komponente der akuten Entzündungsreaktion während der Infektion der Blase mit uropathogenen Escherichia coli nachahmt. Die transuroepithelial Neutrophilenmigration Assay erlaubt die quantitative Beurteilung der humanen neutrophilen Migration über Blasen Epithelien auf lässigen Träger kultiviert, in Reaktion auf eine bakterielle Infektion oder chemoattraktiven Stoffen. 

Serie: Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

Expansion, Reinigung und Functional Assessment of Human peripheren Blut NK-Zellen

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

Tracking-Neutrophil Intraluminale Crawling, transendotheliale Migration und Chemotaxis in Tissue durch Intravital Video-Mikroskopie

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular organisms towards a source of nutrients or away from unsuitable conditions, as well as in multicellular organisms for tissue development, immune surveillance and wound healing, just to mention a few roles1,2,3. Deregulation of this process can lead to serious neurological, cardiovascular and immunological diseases, as well as exacerbated tumor formation and spread4,5. Molecularly, actin polymerization and receptor recycling have been shown to play important roles in creating cellular extensions (lamellipodia), that drive the forward movement of the cell6,7,8. However, many biological questions about cell migration remain unanswered.
The central role for cellular motility in human health and disease underlines the importance of understanding the specific mechanisms involved in this process and makes accurate methods for evaluating cell motility particularly important. Microscopes are usually used to visualize the movement of cells. However, cells move rather slowly, making the quantitative measurement of cell migration a resource-consuming process requiring expensive cameras and software to create quantitative time-lapsed movies of motile cells. Therefore, the ability to perform a quantitative measurement of cell migration that is cost-effective, non-laborious, and that utilizes common laboratory equipment is a great need for many researchers.
The phagokinetic track motility assay utilizes the ability of a moving cell to clear gold particles from its path to create a measurable track on a colloidal gold-coated glass coverslip9,10. With the use of freely available software, multiple tracks can be evaluated for each treatment to accomplish statistical requirements. The assay can be utilized to assess motility of many cell types, such as cancer cells11,12, fibroblasts9, neutrophils13, skeletal muscle cells14, keratinocytes15, trophoblasts16, endothelial cells17, and monocytes10,18-22. The protocol involves the creation of slides coated with gold nanoparticles (Au&deg;) that are generated by a reduction of chloroauric acid (Au3+) by sodium citrate. This method was developed by Turkevich et al. in 195123 and then improved in the 1970s by Frens et al.24,25. As a result of this chemical reduction step, gold particles (10-20 nm in diameter) precipitate from the reaction mixture and can be applied to glass coverslips, which are then ready for use in cellular migration analyses9,26,27.
In general, the phagokinetic track motility assay is a quick, quantitative and easy measure of cellular motility. In addition, it can be utilized as a simple high-throughput assay, for use with cell types that are not amenable to time-lapsed imaging, as well as other uses depending on the needs of the researcher. Together, the ability to quantitatively measure cellular motility of multiple cell types without the need for expensive microscopes and software, along with the use of common laboratory equipment and chemicals, make the phagokinetic track motility assay a solid choice for scientists with an interest in understanding cellular motility.

The phagokinetic motility track assay is a method used to assess the movement of cells. Specifically, the assay measures chemokinesis (random cell motility) over time in a quantitative manner. The assay takes advantage of the ability of cells to create a measurable track of their movement on colloidal gold-coated coverslips.

Eine quantitative Auswertung der Zellmigration durch die Phagokinetic Spur Motilität Assay

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

In vitro Coculture Assay zur Bewertung pathogeninduzierter Neutrophiler Transepithelmigration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst leukocytes and in their non-activated state are constitutively committed to apoptosis. When recruited to inflammatory sites to resolve inflammation, they produce an array of cytotoxic molecules with potent antimicrobial killing. Yet, when these powerful cytotoxic molecules are released in an uncontrolled manner they can damage surrounding tissues. In recent years however, neutrophil versatility is increasingly evidenced, by demonstrating plasticity and immunoregulatory functions. We have recently identified a new neutrophil-derived subpopulation, which develops spontaneously in standard culture conditions without the addition of cytokines/growth factors such as granulocyte colony-stimulating factor (GM-CSF)/interleukin (IL)-4. Their phagocytic abilities of neutrophil remnants largely contribute to increase their size immensely; therefore they were termed giant phagocytes (G&#981;). Unlike neutrophils, G&#981; are long lived in culture. They express the cluster of differentiation (CD) neutrophil markers CD66b/CD63/CD15/CD11b/myeloperoxidase (MPO)/neutrophil elastase (NE), and are devoid of the monocytic lineage markers CD14/CD16/CD163 and the dendritic CD1c/CD141 markers. They also take-up latex and zymosan, and respond by oxidative burst to stimulation with opsonized-zymosan and PMA. G&#981; also express the scavenger receptors CD68/CD36, and unlike neutrophils, internalize oxidized-low density lipoprotein (oxLDL). Moreover, unlike fresh neutrophils, or cultured monocytes, they respond to oxLDL uptake by increased reactive oxygen species (ROS) production. Additionally, these phagocytes contain microtubule-associated protein-1 light chain 3B (LC3B) coated vacuoles, indicating the activation of autophagy. Using specific inhibitors it is evident that both phagocytosis and autophagy are prerequisites for their development and likely NADPH oxidase dependent ROS. We describe here a method for the preparation of this new subpopulation of long-lived, neutrophil-derived phagocytic cells in culture, their identification and their currently known characteristics. This protocol is essential for obtaining and characterizing G&#981; in order to further investigate their significance and functions.

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

We describe here a method for obtaining and identifying a newly characterized subpopulation of neutrophil-derived giant phagocytes. These cells develop in culture from fresh human blood neutrophils, and are characterized by phagocytosis, autophagy, immensely large size, and extended lifespan. This method is essential to further investigate this unique neutrophil-derived subpopulation.

Entwicklung und Identifizierung eines neuen Subpopulation von humanen neutrophilen abgeleiteten Riesen Phagozyten<em&gt; In Vitro</em

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with histones and antimicrobial proteins. Excessive NET formation (NETosis) and citH3 release during sepsis is associated with multiple organ dysfunction and mortality in mice and humans but its implications in dogs are unknown. Herein, we describe a technique to isolate canine neutrophils from whole blood for observation and quantification of NETosis. Leukocyte-rich plasma, generated by dextran sedimentation, is separated by commercially available density gradient separation media and granulocytes collected for cell count and viability testing. To observe real-time NETosis in live neutrophils, cell permeant and cell impermeant fluorescent nucleic acid stains are added to neutrophils activated either by lipopolysaccharide (LPS) or phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). Changes in nuclear morphology and NET formation are observed over time by fluorescence microscopy. In vitro NETosis is further characterized by co-colocalization of cell-free DNA (cfDNA), myeloperoxidase (MPO) and citrullinated histone H3 (citH3) using a modified double-immunolabelling protocol. To objectively quantify NET formation and citH3 expression using fluorescence microscopy, NETs and citH3-positive cells are quantified in a blinded manner using available software. This technique is a specific assay to evaluate the in vitro capacity of canine neutrophils to undergo NETosis.

In Vitro Canine Neutrophil Extracellular Trap Formation: Dynamic and Quantitative Analysis by Fluorescence Microscopy

We describe methods to isolate canine neutrophils from whole blood and visualize NET formation in live neutrophils using fluorescence microscopy. Also described are protocols to quantify NET formation and citrullinated histone H3 (citH3) expression using immunofluorescence microscopy.

In-vitro- Eckzahn Neutrophilenzahl extrazelluläre Trap Bildung: Dynamische und Quantitative Analyse von Fluoreszenz-Mikroskopie

In response to invading pathogens, neutrophils release neutrophil extracellular traps (NETs), which are extracellular networks of DNA decorated with ...

Assessment of Lymphocyte Migration in an Ex Vivo Transmigration System

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex vivo transmigration system. Group 2 innate lymphoid cells (ILC2) and CD4+ T helper cells were isolated from spleens and lungs of chicken egg ovalbumin (OVA)-challenged BALB/c mice. We confirmed the expression of CCR4 on both CD4+ T cells and ILC2, comparatively. CCL17 and CCL22 are the known ligands for CCR4; therefore, using this ex vivo transmigration method we examined CCL17- and CCL22-induced movement of CCR4+ lymphocytes. To establish chemokine gradients, CCL17 and CCL22 were placed in the bottom chamber of the transmigration system. Isolated lymphocytes were then added to top chambers and over a 48 h period the lymphocytes actively migrated through 3 &#181;m pores towards the chemokine in the bottom chamber. This is an effective system for determining the chemokinetics of lymphocytes, but, understandably, does not mimic the complexities found in the in vivo organ microenvironments. This is one limitation of the method that can be overcome by the addition of in situ imaging of the organ and lymphocytes under study. In contrast, the advantage of this method is that is can be performed by an entry-level technician at a much more cost-effective rate than live imaging. As therapeutic compounds become available to enhance migration, as in the case of tumor infiltrating cytotoxic immune cells, or to inhibit migration, perhaps in the case of autoimmune diseases where immunopathology is of concern, this method can be used as a screening tool. In general, the method is effective if the chemokine of interest is consistently generating chemokinetics at a statistically higher level than the media control. In such cases, the degree of inhibition/enhancement by a given compound can be determined as well.

In this protocol, lymphocytes are placed in the top chamber of a transmigration system, separated from the bottom chamber by a porous membrane. Chemokine is added to the bottom chamber, which induces active migration along a chemokine gradient. After 48 h, lymphocytes are counted in both chambers to quantitate transmigration.

Bewertung der Lymphozytenmigration in einem Ex-Vivo-Transmigrationssystem

Herein, we present an efficient method that can be executed with basic laboratory skills and materials to assess lymphocyte chemokinetic movement in an ex ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water while preventing passage of luminal bacteria and exogenous substances. A breach of this layer results in increased permeability to luminal contents and recruitment of immune cells, both of which are hallmarks of pathologic states in the gut including inflammatory bowel disease (IBD). 
Mechanisms regulating epithelial barrier function and transepithelial migration (TEpM) of polymorphonuclear neutrophils (PMN) are incompletely understood due to the lack of experimental in vivo methods allowing quantitative analyses. Here, we describe a robust murine experimental model that employs an exteriorized intestinal segment of either ileum or proximal colon. The exteriorized intestinal loop (iLoop) is fully vascularized and offers physiological advantages over ex vivo chamber-based approaches commonly used to study permeability and PMN migration across epithelial cell monolayers.
We demonstrate two applications of this model in detail: (1) quantitative measurement of intestinal permeability through detection of fluorescence-labeled dextrans in serum after intraluminal injection, (2) quantitative assessment of migrated PMN across the intestinal epithelium into the gut lumen after intraluminal introduction of chemoattractants. We demonstrate feasibility of this model and provide results utilizing the iLoop in mice lacking the epithelial tight junction-associated protein JAM-A compared to controls. JAM-A has been shown to regulate epithelial barrier function as well as PMN TEpM during inflammatory responses. Our results using the iLoop confirm previous studies and highlight the importance of JAM-A in regulation of intestinal permeability and PMN TEpM in vivo during homeostasis and disease. 
The iLoop model provides a highly standardized method for reproducible in vivo studies of intestinal homeostasis and inflammation and will significantly enhance understanding of intestinal barrier function and mucosal inflammation in diseases such as IBD.

Dysregulated intestinal epithelial barrier function and immune responses are hallmarks of inflammatory bowel disease that remain poorly investigated due to a lack of physiological models. Here, we describe a mouse intestinal loop model that employs a well-vascularized and exteriorized bowel segment to study mucosal permeability and leukocyte recruitment in vivo.

Funktionelle Beurteilung der Intestinalpermeabilität und der neutrophilen transepithelialen Migration bei Mäusen mit einem standardisierten Darmschleifenmodell

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...