وأيد هذا العمل من قبل الوزارة الاتحادية الألمانية للتعليم والبحوث (BMBF)، وعلم الأحياء نظم في اشارة الى السرطان (هيلمهولتز التحالف على بيولوجيا الأنظمة) ومركز أبحاث السرطان الألماني (DKFZ).

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية للDKFZ. الحذر: من أجل منع التلوث ريبونوكلياز العينات، واتخاذ الاحتياطات الأساسية لتجنب التلوث ريبونوكلياز وإعداد جميع مخازن بالماء المعالجة DEPC. 1. إعداد السكروز التدرجات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 17.5، 25.6، 33.8، 41.9 و 50٪ الحلول السكروز (أنظر الجدول 1). البدء في إعداد التدرجات بإضافة ببطء 2 مل من محلول السكروز 50٪ إلى أسفل أنبوب polyallomer نابذة فائقة السرعة. تجميد طبقة عن طريق وضع أنابيب لمدة 20 دقيقة في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة طبقات اللاحقة في خفض نسب السكروز مع تجميد الخطوات في بين، تنتهي إلى 17.5٪ سكروز. إبقاء التدرجات على الجليد خلال إضافة حلول السكروز من أجل منع ذوبان طبقات الأساسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التدرجات السكروز الطازجة قبل استخدامها يوم واحد وتبقي على 4 درجات مئوية. Alternativelذ، وإعداد التدرجات مقدما، مخزن في -80 درجة مئوية، وذوبان الجليد في 4 درجات مئوية ليلا قبل التجربة. </li></ol> 2. تحضير الأنسجة (الحبل الشوكي و / أو المخ) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الماوس عن طريق جرعة زائدة من Xylazin وKetamin في كلوريد الصوديوم ويروي transcardially مع 20 مل من أملاح الحل هانك المتوازن (HBSS) التي تحتوي على 200 ميكروغرام / مل فروج الذي يشل ريبوسوم على النصوص المرتبطة بها. تأكيد التخدير المناسبة من خلال عدم الاستجابة لالقرصات أخمص قدميه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخراج الأنسجة بسرعة. فتح الجمجمة ظهريا واستخراج الدماغ. أداء الثقب من الصدر والعمود الفقري بأكمله القطنية واستخراج النخاع الشوكي. استخدام الدماغ كله (~ 400 ملغ) أو 4 سم قطعة من الحبل الشوكي (~ 90 ملغ)، على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الأنسجة في الجليد الباردة التجانس العازلة A (انظر الجدول 1) (الحبل الشوكي: 1 مل؛ الدماغ: 4 مل) والنرد الى قطع صغيرة مع مشرط نظيفة للسماح زيادة امتصاص سيكلوهيكسيميد. Perfo<html> RM جميع مزيد من الخطوات على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 15 دقيقة والتجانس الأنسجة ميكانيكيا باستخدام الخالط Dounce. التجانس تسيطر عليها بعناية أمر ضروري لضمان أن نوى لا تزال سليمة. علاج جميع العينات بنفس الطريقة تماما لضمان إمكانية المقارنة. ملاحظة: لأنسجة المخ: تعطيل الأنسجة بنسبة 5 السكتات الدماغية مع مدقة المناسب بإحكام. للأنسجة الحبل الشوكي: تعطيل السكتات الدماغية بنسبة 5 مع مدقة فضفاضة المناسب، تليها 5 ضربات أخرى مع مدقة المناسب بإحكام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتخاذ مأخوذة (400 ميكرولتر للدماغ و 200 ميكرولتر عن الحبل الشوكي)، وتجميد فلاش وتخزينها في -80 درجة مئوية لعزل الحمض النووي الريبي مجموع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة النوى والخلايا undisrupted وشظايا الأنسجة بواسطة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. انخفاض سرعة الطرد المركزي يمنع فقدان ريبوسوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز شظايا غشاء في طاف نوى الحرة لمدة 30 دقيقة عن طريق إضافة NP-40 والمنظفات deoxycholate الصوديوم (كل لتركيز النهائي من 1٪). </li></ol>&quot;jove_title&quot;&gt; 3. المايلين التعويم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هذه الخطوة يزيل المكونات الدهنية من العينة التي سوف تحجب إلا إشارة في الملف الشخصى polyribosome. أولا، قبل البرد دلاء نابذة فائقة السرعة والدوار عند 4 درجة مئوية، وإعداد 2 M، M 1.1 و 0.9 M حلول السكروز (أنظر الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج المحللة مع 1.22 حجم 2 M حل السكروز ونقل في أنبوب البولي اثيلين نابذة فائقة السرعة. تملأ جميع الأنابيب في المساواة في حجم 10 مل مع 1.1 M الحل السكروز، تراكب أنه بعد ذلك بعناية مع 0.9 M الحل السكروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنابيب نابذة فائقة السرعة في دلاء نابذة فائقة السرعة قبل المبردة. أجهزة الطرد المركزي لمدة 3 ساعة على 100،000 XG في 4 درجات مئوية. أثناء هذه العملية ريبوسوم تصبح المودعة في حين بيليه المكونات الدهنية تعويم صعودا والبقاء في طاف. </li></ol> 4. السكروز التدرج تجزئة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طاف وحل بيليه في المخزن التجانس B (انظر الجدول 1 </stرونغ&gt;). قياس الامتصاصية في 260 نانومتر لكل عينة باستخدام معمل NanoDrop أو جهاز ما يعادل وتطبيع مبالغ لتحميل وفقا لقيمة الامتصاصية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع التدرجات السكروز (يوصف إعداد في المقطع السابق) في دلاء نابذة فائقة السرعة قبل المبردة. عينات طبقة بعناية على أعلى من التدرج. إضافة واحد التدرج السكروز فارغة الرقابة الفنية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط وزن كل دلو مع العازلة التجانس. عينات الطرد المركزي لمدة 1.5 ساعة على 285،000 XG في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البدء في التحضير لاسكو المجزئ 30 دقيقة قبل نهاية الطرد المركزي. إذا تم استخدام نموذج آخر من المجزئ، اتبع بروتوكول الشركة المصنعة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين حساسية المناسبة (0.2 AUFS عن الدماغ أو 0.05 AUFS عن الحبل الشوكي) لمصباح الأشعة فوق البنفسجية وتشغيله لالاحماء. تجميع أنبوب ثاقبة، توصيله عن طريق مضخة المتداول إلى 60٪ محلول السكروز من خلال أنبوب ثاقبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار الإعداد عن طريق ضخ الفئران السكروز (تدفقه: 1 مل / دقيقة)، ولا سيما التأكد من عدم وجود تسرب في الأنابيب التي سوف أعرض فقاعات في التدرج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> امتصاص الخلفية فارغة عن طريق ضخ يدويا عازلة التدرج في الكشف عن الأشعة فوق البنفسجية وتصحيح خط الأساس. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية دلاء نابذة فائقة السرعة تحتوي على التدرجات السكروز مع عينات الرسوبية من الدوار ووضعها على الجليد. تجنب أي ارتطام من التدرجات لمنع فقدان القرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التدرجات تعمل على المجزئ. تشغيل التدرجات فارغة الأولى لتقييم امتصاص الخلفية وضمان الإعداد الفني السليم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق التدرج إلى كاشف الأشعة فوق البنفسجية ويخترق الجزء السفلي من أنبوب مع أنبوب ثاقبة. بدء ضخ 60٪ سكروز، والتي سوف تحل محل التدرج مع عينات الرسوبية صعودا من خلال كاشف الأشعة فوق البنفسجية والى انخفاض موزع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تم توثيقه الامتصاصية في 260 نانومتر إلى توليد الشخصى لامتصاص العينة، مع وجود قمم تشير إلى sedimentaنشوئها من mRNAs والمرتبطة مفارز الريباسي، monosomes، وعدد متزايد من ريبوسوم في وقت لاحق. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع العينات في 20 الكسور عن طريق موزع قطرة (600 ميكرولتر لكل منهما، في 2 مل أنابيب). </li></ol> 5. عزل الحمض النووي الريبي من الفردية الكسور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10٪ SDS إلى تركيز النهائي من 1٪ إلى كسور الفردية وتخلط جيدا لكي تتكشف البروتينات وفصل ريبوسوم. في هذه المرحلة يمكن تجميد العينات في -80 درجة مئوية. اعتمادا على السؤال الذي يتعين معالجتها، والكسور يمكن المجمعة وفقا لملف الامتصاصية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الحمض النووي الريبي مع الحمضية استخراج الفينول / كلوروفورم، الذي يزيل أيضا آثار تلوث من الحمض النووي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مجلد واحد من حمضية الفينول / الكلوروفورم (prewarmed لRT) لكل عينة، والحرارة لمدة 10 دقيقة عند 65 درجة مئوية وضغط الإفراج تحت غطاء الدخان بعد ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينات الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 17،000 XG في RT. نقل بعناية المرحلة المائية إلى 1.5 مل جديدةالأنبوب. يكون على بينة من مرحلة انقلاب في الكسور السكروز أكثر كثافة، حيث قد تكون المرحلة المائية في أسفل بعد الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مجلد واحد من الأيزوبروبانول، 1/9 حجم خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2) و 1 ميكرولتر GlycoBlue لكل عينة من أجل ترسيب الحمض النووي الريبي. الاحتفاظ بعينات لا يقل عن 1 ساعة عند -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 30 دقيقة في 17،000 XG و4 درجات مئوية. يوفر GlycoBlue التصور من بيليه. إزالة طاف، ويغسل مرة واحدة مع بيليه الجليد الباردة الايثانول 80٪ والهواء الجاف بيليه. حل بيليه في ريبونوكلياز المياه مجانا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس كمية الحمض النووي الريبي التي كتبها معمل NanoDrop وتحليل سلامة الحمض النووي الريبي من قبل رقاقة Bioanalyzer. الحمض النووي الريبي التي يتم الحصول عليها بواسطة بروتوكول المعروضة هي مناسبة لجميع الدولة من الفن المقايسات إنتاجية عالية بما في ذلك ميكروأري وتسلسل عميق. </li></ol>

<ol>
	<li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Grolleau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+specific+translational+control+by+rapamycin+in+T+cells+uncovered+by+microarrays+and+proteomics.">Global and specific translational control by rapamycin in T cells uncovered by microarrays and proteomics.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22175-22184 (1074).</li><li>Rajasekhar, V. K., Viale, A., Socci, N. D., Wiedmann, M., Hu, X., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Ras+and+Akt+signaling+contribute+to+glioblastoma+formation+by+differential+recruitment+of+existing+mRNAs+to+polysomes.">Oncogenic Ras and Akt signaling contribute to glioblastoma formation by differential recruitment of existing mRNAs to polysomes.</a> Molecular Cell. 12 (4), 889-901 (2003).</li><li>Zivraj, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+profiling+reveals+distinct+and+developmentally+regulated+repertoire+of+growth+cone+mRNAs.">Subcellular profiling reveals distinct and developmentally regulated repertoire of growth cone mRNAs.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (46), 15464-15478 (2010).</li><li>Brittis, P. a., Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target.">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110 (2), 223-235 (2002).</li><li>Tcherkezian, J., Brittis, P. a., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation.">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141 (4), 632-644 (2010).</li><li>Colak, D., Ji, S. -. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay.">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153 (6), 1252-1265 (2013).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., M&#252;llner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments.">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+polyribosome+profile+analysis.">Eukaryotic polyribosome profile analysis.</a> J. Vis. Exp. (40), (2010).</li><li>Sampath, P., Lee, Q. Y., Tanavde, V., Schlaeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+translationally+regulated+genes+during+stem+cell+differentiation.">Identifying translationally regulated genes during stem cell differentiation.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 1, (2011).</li><li>Chiu, F. C., Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+rat+spinal+cord+polysomes:+postnatal+development+and+experimental+demyelination.">Studies on rat spinal cord polysomes: postnatal development and experimental demyelination.</a> Journal of Neurochemistry. 31 (4), 835-844 (1978).</li><li>Larocca, J. N., Norton, W. T., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+myelin.">Isolation of myelin.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 3, (2007).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135 (4), 738-748 (2008).</li><li>Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues.">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. a., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

أعلن أي تضارب في المصالح.

على الرغم من polyribosome تجزئة ليست تقنية جديدة، إلا أنها تبقى واحدة تحديا من نوع خاص. استنادا إلى المواد المدخلات، ويمكن تحسين كبير يكون ضروريا. هذا هو الحال في الجسم الحي CNS العينات، حيث كمية المواد وغالبا ما يكون القيد ومكونات الأنسجة الدهنية تعوق عزلة mRNAs وترجمة خاصة. البروتوكولات نشرت معظم تجزئة التعامل مع الخميرة أو خطوط خلايا الثدييات، وهناك بروتوكولات المعمول بها للدماغ 12،13،14. في المقابل، هناك بالكاد أي منشورات تصف التجزئة من النخاع الشوكي، والبروتوكولات السابقة تتطلب الحبل الشوكي من عدد كبير من الحيوانات لتكون مجمعة 15. لهذه الأسباب، قدمت عدة تعديلات ضرورية للتكيف مع بروتوكول تجزيء لأنسجة الجهاز العصبي المركزي، بما في ذلك واحدة الماوس الحبل الشوكي. يتم تنفيذ تجميد الريبوسوم مع سيكلوهيكسيميد خلال نضح الحيوانية لتجنب تفكك ريبوسوم الزيتوز عملية طويلة من استخراج الأنسجة. في وقت لاحق، يتم استخراج الرنا polysomal بطريقة محددة لتعظيم العائد polyribosome. الأولى، التي تسيطر عليها تجانس الأنسجة التي كتبها douncing، تحافظ على النواة سليمة ويمنع التلوث الحمض النووي. ثم تتم إزالة نواة موثوق بواسطة الطرد المركزي. مزيج من المنظفات NP-40 و deoxycholate الصوديوم يضمن تحلل من الشبكة الإندوبلازمية والإفراج عن غشاء المرتبطة ريبوسوم لها. بالإضافة إلى ذلك، المكونات التي تمتص الأشعة فوق البنفسجية داخل المايلين الدهنية الغنية طمس ملامح polyribosome. لذا المايلين تعويم أمر ضروري، حيث يتم مكعبات المركبات الكثيفة مثل polyribosomes ومركبات أخف وزنا مثل المايلين تعويم وتتم إزالة 16. ثم يتم الرسوبية Polyribosomes أكثر من 17.5٪ إلى 50٪ سكروز التدرج. بدلا من طبقات يدويا وتجميد كل طبقة السكروز، التدرجات يمكن أيضا أن تكون مستعدة باستخدام خلاط التدرج. استخراج الحمض النووي الريبي من الكسور باستخدام حمضية الفينول / الكلوروفورم يسمح DNA المراد إزالتها مع فقدان الحد الأدنى من الحمض النووي الريبي. ومع ذلك، قد تحدث مرحلة انقلاب في الكسور السكروز كثيفة (فوق جزء 16). يوفر هذا البروتوكول من المزايا أكثر من غيرها من الأساليب التقليدية التي تعالج مستوى الترجمة. على سبيل المثال، فإن كلا من قياس فسفرته S6 (علامة بارزة الترجمة)، وكذلك وضع العلامات سلاسل الوليدة مع النظائر المشعة إعطاء معلومات عن مستويات الترجمة العالمية ولكن تكشف قليلا على ما يجري على وجه التحديد ترجمتها. Polyribosome تجزئة، من ناحية أخرى، لا يسمح تقييم الترجمة العالمية، ولكن أيضا من هوية ترجمة mRNAs والبروتينات والتنظيمية ذات الصلة. في الوقت الحقيقي PCR الكمي لا يمكن أن يؤديها على الرنا المعزولة عن قراءة سريعة للخروج من mRNAs والمختارة، وميكروأرس والجيل القادم التسلسل الحمض النووي الريبي لا يمكن أن يؤديها للدراسات واسعة الجينوم. تحسينات المقدمة هنا تسمح هذه التقنية ليتم استخدامها مع كميات ضئيلة من أنسجة الجهاز العصبي المركزي، وبالتالي يقللجي عدد الحيوانات اللازمة وتحسين نوعية التجريبية الشاملة من خلال تقليل الوقت اللازم لتجهيز الأنسجة. من ناحية أخرى، وهذا الأسلوب لا يمكن التمييز ريبوسوم المتعثرة من ترجمة تلك. والنصوص تحمل ريبوسوم المتعثرة الرواسب في الكسور الثقيلة، وهذا ينبغي أن يوضع في الاعتبار عند تفسير البيانات. هناك تقنيات حديثة عنها، وهي RiboTaq وفخ، والتي وصفت ريبوسوم مع العلامات حاتمة أو صحفيين على التوالي بطريقة محددة نوع من الخلايا وmRNAs ومعزولة بسبب مناعي 17،18 المرتبطة بها. يمكن أن يقترن هذا الأسلوب لpolyribosome تجزئة لتقديم دقة عالية تلا للسكان خلية معينة. الريبوسوم القدم الطباعة هو أسلوب آخر الرواية التي ينطوي نوكلياز الهضم لتوليد شظايا صغيرة، أو &quot;أقدام&quot;، من mRNAs والتي تحميها ريبوسوم. ثم يتم إنشاء مكتبات من هذه البصمات ومتسلسلا. طريقة هذا الأقليمايديس تحليل الجينوم كله كودون محددة على الترجمة وغير قادرة على تحديد ريبوسوم المتعثرة، غير AUG-بدء الكودونات والمنبع إطارات القراءة المفتوحة الصغيرة، والتي لا يمكن أن يتحقق عن طريق تجزئة polyribosome 19. ومع ذلك، يمكن أن يقترن polyribosome تجزئة إلى التنميط الريبوسوم لعزل شظايا تحتوي على ريبوسوم هضمها واحدة، مما يثري للأنواع الجزيئية اللازمة لإعداد المكتبة التي كثيرا ما هو مطلوب عينة عالية النقاء. أخذت معا، polyribosome تجزئة هي طريقة مرنة مع أهمية دائمة ويمكن أن يقترن لمختلف التطبيقات المصب بما في ذلك فحوصات واسعة الجينوم مثل الجيل التالي من التسلسل.

يتم تحديد الجين التعبير من خلال العمل المشترك من النسخ والترجمة واستقرار مرنا والبروتينات، مع ترجمة تحمل التأثير الأكثر الغالبة 1. ومن الواضح الآن أن كل خطوة من هذه الخطوات هو درجة عالية من التنظيم. الدقيقة الرنا، وتشكيل حبيبات الحمض النووي الريبي، وتذييل بعديد الأدينيلات بديل هيولي هي بعض الأمثلة من التنظيم بعد النسخي التعبير الجيني 2،3. كل من هذه الآليات uncouples النسخ من ترجمة ويؤثر على بروتيوم في النظام البيولوجي في المصالح. وبالتالي، لا يثير الدهشة، ومستويات مرنا وحدها هي قراءات الكمال من مستويات البروتين 4. يوفر البروتينات الكمي التقييم الأكثر مباشرة في التعبير الجيني، ولكن على الرغم من التطورات الأخيرة، لا تزال هناك قيود كبيرة على حساسية ودقة تسلسل البروتين. ولمعالجة translatome، وذخيرة من mRNAs وترجمة، ويقدم حلا وسطا ممتازا بين دراسةTranscriptome على وبروتيوم. وهو أكثر دقة من transcriptomics في تقييم التعبير الجيني النهائي، ويوفر كل من أعلى التغطية والقرار تسلسل من البروتينات. في نظم الثدييات، فإن غالبية الأحداث تبدأ الترجمة عبر تعتمد على غطاء البدء. مجموعة من العوامل بدء حقيقية النواة مع 40S الوحيدات الريباسي صغيرة التجمع في سقف 5 &#39;من مرنا. المجمع ثم يمسح مرنا وعند الوصول إلى بداية أغسطس كودون، تجند 60S الوحيدات الريباسي كبيرة لتشكيل 80S كاملة الريبوسوم. عائدات مرحلة الاستطالة مع الريبوسوم تتحرك على طول مرنا، مع عوامل استطالة مساعدة إدماج الأحماض الأمينية من tRNAs تحميل لسلسلة ببتيد الوليدة. يمكن ريبوسوم متعددة المضي قدما على طول مرنا واحد في وقت واحد، ولقد ثبت في عدد من الريبوسومات المرتبطة بها لربط مع معدل تخليق البروتين 5،6. وهذا يجعل التحميل الريباسي مؤشرا يمكن الاعتماد عليها لترانslation ويسمح الفصل بين ترجمة بنشاط mRNAs وعلى أساس معدل الترسيب. بالإضافة إلى التحديد الكمي للترجمة mRNAs و، ويمكن الحصول على المعلومات لتحديد تسلسل الزخارف المشاركة في التنظيم الترجمة. الحمض النووي الريبي أيضا البروتينات ملزمة والعوامل الترجمة الأخرى يمكن أن تكون معزولة من كسور مختلفة، وتسهيل دراسة واكتشاف البروتينات التنظيمية ذات الصلة. في الجهاز العصبي، وقد تم ربط السيطرة متعدية إلى العمليات مثل تخزين مرنا والنقل وتخليق البروتين المحلية. وقد ثبت مخاريط النمو لإيواء بركة محددة المترجمة من mRNAs ومتميزة عن بقية محوار 7. بالإضافة إلى ذلك، محاور امتلاك القدرة على تجميع البروتينات 8،9 محليا. ونتيجة لذلك، السيطرة المحلية على ترجمة أصبح موضوعا حاسما من الدراسة في علم الأعصاب. وقد بينت إمكانية polyribosome من تجزئة للتصدي لهذا في العديد من الدراسات، والتي كانت تستخدم هذه التقنية لالتحقيق في التوجيه محوار في التنمية النخاع الشوكي، وبرهنت على الترجمة التي تعتمد على النشاط من عامل التغذية العصبية في الدماغ 10،11.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Hank&#8217;s balanced salts solution</td>
			<td style="width:147px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14170-138</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethylpyrocarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93482</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNasin Plus RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonidet P-40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11332473001</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9722</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlycoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357538/357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x&#160;g</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Density Gradient Fractionator</td>
			<td>Teledyne Isco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo interrogation of central nervous system translatome by polyribosome fractionation

وتشارك عدة عمليات في التعبير الجيني بما في ذلك النسخ والترجمة واستقرار mRNAs والبروتينات و. وينظم كل من هذه الخطوات بإحكام، مما يؤثر على ديناميكية النهائية من وفرة البروتين. وجود آليات تنظيمية مختلفة في الخطوة الترجمة، تقديم مستويات مرنا وحدها مؤشرا يمكن الاعتماد عليها في التعبير الجيني. بالإضافة إلى ذلك، التنظيم المحلية الترجمة مرنا تورطت ولا سيما في وظائف الخلايا العصبية، وتحويل &quot;translatomics &#39;إلى محور الاهتمام في علم الأعصاب. طريقة عرض يمكن استخدامها لtranscriptomics الجسر والبروتينات. نحن هنا وصف التعديلات الضرورية لأسلوب polyribosome تجزئة، والتي يستجوب وtranslatome على أساس رابطة mRNAs وتترجم بنشاط لريبوسوم متعددة والترسيب التفاضلية في التدرجات السكروز. تقليديا، والعمل مع عينات في الجسم الحي، وخاصة من سنترال الجهاز العصبي (CNS)، وقد ثبت تحديا نظرا لكميات محدودة من المواد ووجود مكونات الأنسجة الدهنية. من أجل معالجة ذلك، هو الأمثل لبروتوكول صفها خصيصا للاستخدام مع كمية ضئيلة من المواد CNS، كما يتضح من استخدام الماوس واحد الحبل الشوكي والدماغ. لفترة وجيزة، يتم استخراج أنسجة الجهاز العصبي المركزي ويجمد ريبوسوم ترجمة على mRNAs ومع سيكلوهيكسيميد. ثم يتم تنفيذ المايلين التعويم لإزالة الدهون المكونات الغنية. يتم تنفيذ تجزئة على التدرج السكروز حيث يتم فصل mRNAs وفقا لالريباسي التحميل الخاصة بهم. الكسور معزولة هي مناسبة لمجموعة من المقايسات المصب، بما في ذلك تكنولوجيات فحص الجينوم واسعة جديدة.

ويبين الشكل 2 لمحات polyribosome ممثل بعد تجزئة. لمحات من الدماغ والحبل الشوكي تظهر منحنيات الامتصاص مميزة كما هو موضح من قبل لخطوط الخلايا. mRNAs وبد أن مفارز الريباسي صغيرة (40S) الرواسب في أجزاء أخف وزنا وتظهر أولا باعتبارها ذروة على الوضع، تليها الوحيدات الريباسي كبيرة (60S) وصبغي جنسي أحادي (80S) mRNAs وملزمة. mRNAs وملزمة لريبوسوم متعددة الرواسب في الكسور أثقل، مع قمم في وقت لاحق مشيرا إلى عدد متزايد من ريبوسوم منضمة. يمكن تقييم الترجمة العالمي من التشكيل الجانبي. كمثال على ذلك، أنسجة المخ لديه polyribosome أعلى لصبغي جنسي أحادي نسبة من أنسجة الحبل الشوكي، مما يدل على مزيد من الترجمة النشطة. تم تقييم الحمض النووي الريبي المستخرج من كسور الفردية Bioanalyzer، والتي تبين توزيع 18S 28S الرنا الريباسي و. 18S الرنا الريباسي يبدو في وقت سابق من الوضع، وفقا للمفارز الريباسي الصغيرة المترسبة في أخف sucr<html> الكسور بيئة نظام التشغيل. عائدات نموذجية من الحمض النووي الريبي مجموع هي 10-20 ميكروغرام للدماغ و2-4 ميكروغرام عن الحبل الشوكي. غلة الحمض النووي الريبي من كسور الفردية ما يصل إلى 4 ميكروغرام و 0.8 ميكروغرام للدماغ والحبل الشوكي على التوالي، وهذا يتوقف على الكسر. A التدرج السكروز فارغة يظهر بالفعل بعض امتصاص خلفية في 260 نانومتر، وذلك بسبب وجود التلفزيون الرقمي الأرضي. يمكن طرح هذه الخلفية خلال تحليل البيانات من أجل تطبيع القيم العينة. انهارت العلاج EDTA القمم polyribosome، مما يدل هو ملف الترسيب بسبب الترجمة. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1. سير العمل والتطبيقات المحتملة في الجسم الحي من polyribosome تجزئة.&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> ملامح الشكل 2. (A) لمحات polyribosome نموذجية من الدماغ والحبل الشوكي، مع تقييم الحمض النووي الريبي المستخرج بواسطة Bioanalyzer. (B) توزيع GAPDH مرنا أكثر الكسور التي كتبها QRT-PCR. (C) Polyribosome من التدرج فارغة والدماغ مع وبدون العلاج EDTA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> 2X العازلة التدرج </td><td> 30 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك pH7.4، 30 ملي MgCl 2، 600 ملي مول كلوريد الصوديوم، 200 ميكروغرام / مل سيكلوهيكسيميد (فروج)، 2mm و dithiothreitol (DTT) </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> حل السكروز 17.5٪ </td><td> 8.67 ز السكروز، 25 مل 2X العازلة التدرج، وتصل إلى 50 مل DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> حل السكروز 25.6٪ </td><td> 12.8 ز السكروز، 25 مل 2X العازلة التدرج، وتصل إلى 50 مل DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> حل السكروز 33.8٪ </td><td> 16.9 ز السكروز، 25 مل 2X العازلة التدرج، وتصل إلى 50 مل DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> حل السكروز 41.9٪ </td><td> 20.95 ز السكروز، 25 مل 2X العازلة التدرج، وتصل إلى 50 مل DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> حل السكروز 50٪ </td><td> 25 ز السكروز، 25 مل 2X العازلة التدرج، وتصل إلى 50 مل DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> التجانسالعازلة A </td><td> 0.25 M السكروز، و 50 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، pH7.4)، 5 ملي MgCl 2، 25 ملي بوكل </td><td> 200 ميكروغرام / مل فروج، 1x أداة كاملة روش مثبط البروتياز، 1 ملم DTT، 1MM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)، و 100 U / مل RNAsin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 2M حل السكروز </td><td> 68.4٪ سكروز، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، pH7.4، 5 ملي MgCl 2، 25 ملي بوكل </td><td> 100 ميكروغرام / مل فروج، 1x أداة كاملة روش مثبط البروتياز، 1 ملم DTT، 1 ملم PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 1.1M حل السكروز </td><td> 38.5٪ سكروز، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، pH7.4، 5 ملي MgCl 2، 25 ملي بوكل </td><td> 100 ميكروغرام / مل فروج، 1x أداة كاملة روش مثبط البروتياز، 1 ملم DTT، 1 ملم PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 0.9M حل السكروز </td><td> 30.8٪ سكروز، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، pH7.4، 5 ملي MgCl 2، 25 ملي بوكل </td><td> 100 ميكروغرام / مل فروج، 1x أداة كاملة روش مثبط البروتياز، 1 ملم DTT، 1 ملم PMSF </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> حomogenization العازلة B </td><td> 0.25 M السكروز، و 50 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، pH7.4، 5 ملي MgCl 2، 25MM بوكل، 1٪ NP-40، 1٪ deoxycholate الصوديوم </td><td> 200 ميكروغرام / مل فروج، 1x أداة كاملة روش مثبط البروتياز، 1MM DTT، 1 ملم PMSF، 100 U / مل RNAsin </td></tr></tbody></table> الجدول 1. قائمة مخازن والحلول.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation at JoVE.com

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

يوضح هذا البروتوكول التعديلات الضرورية من polyribosome تجزئة من أجل دراسة translatome في الجسم الحي من عينات الجهاز العصبي المركزي. لأنها تتيح تقييم عالمي للترجمة والنسخ التنظيم من خلال العزلة ومقارنة الحمض النووي الريبي مجموع الكسور إلى الريبوسوم الحمض النووي الريبي ملزمة.

في الجسم الحي الاستجواب من النظام العصبي المركزي Translatome بواسطة Polyribosome تجزئة

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

in-vivo-interrogation-central-nervous-system-translatome-polyribosome

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

12.2K Views.  German Cancer Research Center (DKFZ).  يوضح هذا البروتوكول التعديلات الضرورية من polyribosome تجزئة من أجل دراسة translatome في الجسم الحي من عينات الجهاز العصبي المركزي. لأنها تتيح تقييم عالمي للترجمة والنسخ التنظيم من خلال العزلة ومقارنة الحمض النووي الريبي مجموع الكسور إلى الريبوسوم ?...

Video: In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

العصب البصري Transection : نموذج من موت الخلايا المبرمج الخلية العصبية الكبار في الجهاز العصبي المركزي

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

التصوير المتعدد الوسائط من زرع الخلايا الجذعية في الجهاز العصبي المركزي من الفئران

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

انتاج ناقلات Lentiviral للخلايا Transducing من الجهاز العصبي المركزي

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

وضع العلامات واحدة من الخلايا في الجهاز العصبي المركزي<em&gt; ذبابة الفاكهة الدروسوفيلا</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

والنموذج الإصابات المعنية بالتحقيق في وسط الجهاز العصبي في إصلاح<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

مباشرة داخل البطين تسليم المخدرات الى القوارض الجهاز العصبي المركزي

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

في الجسم الحي Optogenetic تحفيز الجهاز العصبي المركزي القوارض

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

تقييم الوظيفي للأعصاب البيولوجية في الثقافات الشبكية من الخلايا الجذعية المستمدة من الجهاز العصبي المركزي الخلايا العصبية

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

المقاصة البصري للنظام العصبي المركزي الماوس عن طريق وضوح السلبي

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

تسجيل الكهربية لنشاط الجهاز العصبي المركزي للطور الثالث Melanogaster المورفولوجية

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...