Bu çalışma Eğitim ve Araştırma Federal Bakanlığı (BMBF), (Sistem Biyolojisi Helmholtz Alliance) Kanser sinyal ve sistemler Biyoloji ve Alman Kanser Araştırma Merkezi (DKFZ) tarafından desteklenmiştir.

Bütün hayvan deneyleri DKFZ kurumsal kurallarına uygun olarak yapıldı. Dikkat: numune RNAse kirlenmesini önlemek RNAse kirlenmesini önlemek için temel önlemleri almak ve DEPC ile muamele edilmiş su ile tüm tamponlar hazırlamak için. Sakkaroz Gradyanların 1. Hazırlanması <ol><li> (Bkz. Tablo 1) 17.5, 25.6, 33.8, 41.9 ve% 50 sakaroz çözümler hazırlayın. Yavaş yavaş polyallomer ultrasantrifüj tüpün dibine% 50 sukroz çözeltisi 2 ml eklenerek gradyanları hazırlanması başlayın. -80 ° C&#39;de 20 dakika boyunca tüpler yerleştirerek tabaka Freeze </li><li> 17.5% sakaroz kadar biten, aralarında donma adımlarla sakaroz yüzdeleri azalan de sonraki katmanlar ekleyebilirsiniz. Temel tabakaların çözülme önlemek amacıyla sukroz solüsyonunun ilave edilmesi sırasında buz üzerinde gradyanlar tutun. </li><li> Taze bir gün kullanımdan önce sakaroz yoğunluğu hazırlayın ve 4 ° C&#39;de tutmak Alternatively, deneyden önce gece 4 ° C&#39;de -80 ° C ve çözülme, önceden mağaza gradyanlar hazırlar. </li></ol> 2.. Doku Hazırlama (Omurilik ve / veya Beyin) <ol><li> NaCl xylazin ve ketamin bir doz aşımı fare anestezisi ve transcardially ilişkili transkript üzerinde ribozomlar durağanlaştırır 200 ug / ml cHx içeren Hank dengeli tuz solüsyonu (HBSS) 20 ml ile serpmek. Ayak tutam yanıt alınamayan tarafından uygun anesthetization onaylayın. </li><li> Hızlı doku ekstrakte edin. Kafatası Dorsalinden açın ve beyin ayıklayın. Tüm Torakal ve lomber vertebral kolonun laminektomi gerçekleştirin ve omurilik ayıklayın. Sırasıyla, bütün beyin (~ 400 mg) ya da spinal kord (~ 90 mg) ihtiva eden bir 4 cm bir parçası, kullanın. </li><li> Soğuk homojenizasyon tampon A içine doku aktarın (bkz. Tablo 1) (1 mi; beyin: omurilik 4 mi) ve sikloheksimid artan nüfuz etmesine imkan verir için temiz bir neşter ile, küçük parçalar halinde zar. Perform buz üzerinde tüm ileri adımlar. </li><li> 15 dakika boyunca inkübe edin ve mekanik bir Dounce homojenleştirici kullanılarak doku homojen hale getirilir. Dikkatle kontrol homojenizasyon çekirdekler bozulmadan kalmasını sağlamak için gereklidir. Tüm numuneler karşılaştırılabilirliği sağlamak için tam olarak aynı şekilde davranın. Not: beyin dokusu için: sıkı bir şekilde uyan havan tokmağı ile 5 vuruş dokuyu bozacak. Omurilik dokusu için: sıkı bir şekilde uyan havan tokmağı ile 5 daha fazla vuruş ardından gevşek montaj havan tokmağı ile 5 vuruş ile bozabilir. </li><li> Alikotları (beyin ve omurilik için 200 ul için 400 ul), total RNA izolasyonu için -80 ° C de hızlı dondurulması ve depolanması al. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 500 x g&#39;de santrifüj ile hücreler ve undisrupted hücre ve doku parçaları kaldırma Düşük hız santrifüj ribozomların kaybını önler. </li><li> NP-40 eklenmesi ve deterjanlar sodyum deoksikolat (% 1 &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar her biri) ile 30 dakika boyunca çekirdekler serbest süpernatan içinde Lyse membran fragmanları. </li></ol><ol><li> Bu adım, aksi polyribosome profilindeki sinyal maskeler numuneden yağ bileşenleri kaldırır. İlk olarak, önceden soğuk ultrasantrifüj kova ve 4 ° C&#39;de rotor ve 2 M, 1.1 M ve 0.9 M hazırlamak sakaroz çözeltileri (Tablo 1 e bakınız). </li><li> 2 M sukroz çözeltisi bir 1.22 hacmi ile karıştırın ve lisat, bir polietilen bir ultra santrifüj tüpüne aktarılır. 1.1 M sukroz çözeltisi ile 10 ml eşit hacimde tüm tüpler doldur, daha sonra 0.9 M sukroz çözeltisi ile dikkatli bir şekilde kaplar. </li><li> Önceden soğutulmuş ultrasantrifüjdeki kova içine ultrasantrifüjdeki tüpleri yerleştirin. 4 ° C&#39;de 100,000 x g&#39;de, 3 saat boyunca santrifüj Katı yağ bileşenleri yüzer ve yüzer kalır ise, bu işlem sırasında topak içinde toplanmasına ribozom. </li></ol> 4.. Sükroz Gradyan Bölünmesi <ol><li> Süpernatantı ve homojenizasyon tamponu B pelet çözülür (bkz. Tablo 1 </stRong&gt;). NanoDrop veya eşdeğer cihazı kullanılarak her numune için 260 nm&#39;de absorbansı ölçülür ve absorbans değerine göre normalize yük miktarları. </li><li> Önceden soğutulmuş ultrasantrifüj kova (preparasyon, bir önceki bölümde tarif edilmiştir) sakaroz gradyanları yerleştirin. , Gradyanın üzerine tabaka dikkatle örnekleri. Teknik kontrol olarak boş bir sukroz gradient ekleyin. </li><li> Homojenizasyon tampon maddesi ile her bir bölüm ağırlığını ayarlayın. 4 ° C&#39;de 285,000 x g&#39;de santrifüjleyin 1.5 saat için örnekler </li><li> Santrifüj bitmeden Isco parçalama 30 dk hazırlanıyor başlayabilirsiniz. Fraksiyonatör başka bir model kullanılırsa, üreticinin protokolünü uygulayın. <ol><li> UV lamba için uygun ışık hassasiyeti (beyin veya omurilik için 0.05 AUFS için 0.2 AUFS) ayarlayın ve ısınma için açın. Bu tüp aracılığıyla delici% 60 sukroz çözeltisine haddeleme pompa yoluyla bağlamak, tüp delici birleştirin. </li><li> Sakaroz (akış sıçan pompalayarak kurulumu testE: 1 ml / dak), özellikle degrade içine kabarcıklar tanıtacak borulama hiçbir sızıntı olmadığından emin olun. </li><li> Elle UV dedektör içine degrade tampon pompalama ve temel düzelterek Blank arka emilim. </li></ol></li><li> Dikkatli bir rotordan tortulaşmış örnekleri ile sükroz gradyanları içeren ultrasantrifüj kova çıkarın ve buz üzerine yerleştirin. Çözünürlük kaybını önlemek için geçişlerini herhangi darbeleme kaçının. </li><li> Kincinin çalıştırın geçişlerini. İlk plan emilimini değerlendirmek ve uygun teknik kurulum sağlamak için boş geçişlerini çalıştırın. <ol><li> UV dedektörüne gradyanı takın ve boru delici ile tüpün alt kısmını delmek. Yukarı UV dedektörüne ve açılan dağıtıcı içine çöktürülmüştür örnekleri ile gradyan ettirilir% 60 sükroz pompalama başlatın. </li><li> 260 nm&#39;de absorbans sedimenta gösteren zirveleri ile, numune için emme profili oluşturmak belgelenmiştirribozomal alt birimlere, monosomes ve ribozomların daha sonra artan sayı ile ilişkili mRNA tion. </li></ol></li><li> (2 ml tüpler içinde 600 ul, her biri) damla dağıtıcı yoluyla 20 fraksiyonlar halinde numune toplayın. </li></ol> Bireysel Kesirler 5. RNA İzolasyon <ol><li> Bireysel fraksiyonlar için% 1 &#39;lik bir nihai konsantrasyona kadar% 10 SDS ilave edin ve proteinler açılmak ve ribozomların ayırmak için iyice karıştırın. Bu noktada numune -80 ° C de dondurulabilir Ele alınması için bir soru ile ilgili olarak, parçacıklar absorbans profiline uygun olarak toplanmış olabilir. </li><li> Ayrıca, DNA kirletici izlerini ortadan kaldırır asidik fenol / kloroform ekstraksiyonu ile RNA izole edilir. <ol><li> Her bir örnek için (oda sıcaklığına kadar önceden ısıtılmış) asidik fenol / kloroform, bir hacim ekleme, 10 ° C&#39;de 65 dakika ve daha sonra davlumbaz altında serbest bırakma basıncı, ısı. </li><li> Oda sıcaklığında 17,000 x g&#39;de 20 dakika boyunca santrifüj örnekleri. Dikkatli bir şekilde yeni bir 1.5 ml sulu faz transferitüp. Sulu faz santrifüj sonra altta olabilir yoğun sakaroz kesirler, faz inversiyon farkında olun. </li><li> RNA&#39;yı çöktürmek için bir izopropanol hacmi, 1/9 hacim sodyum asetat (pH 5.2), ve her bir örnek için 1 ul Glycoblue ekleyin. -80 ° C &#39;de numuneler, en az 1 saat devam </li><li> 17,000 x g ve 4 ° C&#39;de 30 dakika boyunca santrifüj Glycoblue pelet görüntülenmesini sağlar. Süpernatantı, buz% 80 etanol ve hava kuru pelet ile bir kez pelet yıkayın. RNAse içermeyen su içinde pelet çözülür. </li></ol></li><li> Nanodrop tarafından RNA miktarını ölçmek ve bir Bioanalyzer çip RNA bütünlüğünü analiz. Sunulan protokol ile elde edilir RNA mikrodizi ve derin sekanslama dahil olmak üzere sanat yüksek verimli tahlillerin her durum için uygundur. </li></ol>

<ol>
	<li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Grolleau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+specific+translational+control+by+rapamycin+in+T+cells+uncovered+by+microarrays+and+proteomics.">Global and specific translational control by rapamycin in T cells uncovered by microarrays and proteomics.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22175-22184 (1074).</li><li>Rajasekhar, V. K., Viale, A., Socci, N. D., Wiedmann, M., Hu, X., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Ras+and+Akt+signaling+contribute+to+glioblastoma+formation+by+differential+recruitment+of+existing+mRNAs+to+polysomes.">Oncogenic Ras and Akt signaling contribute to glioblastoma formation by differential recruitment of existing mRNAs to polysomes.</a> Molecular Cell. 12 (4), 889-901 (2003).</li><li>Zivraj, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+profiling+reveals+distinct+and+developmentally+regulated+repertoire+of+growth+cone+mRNAs.">Subcellular profiling reveals distinct and developmentally regulated repertoire of growth cone mRNAs.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (46), 15464-15478 (2010).</li><li>Brittis, P. a., Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target.">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110 (2), 223-235 (2002).</li><li>Tcherkezian, J., Brittis, P. a., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation.">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141 (4), 632-644 (2010).</li><li>Colak, D., Ji, S. -. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay.">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153 (6), 1252-1265 (2013).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., M&#252;llner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments.">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+polyribosome+profile+analysis.">Eukaryotic polyribosome profile analysis.</a> J. Vis. Exp. (40), (2010).</li><li>Sampath, P., Lee, Q. Y., Tanavde, V., Schlaeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+translationally+regulated+genes+during+stem+cell+differentiation.">Identifying translationally regulated genes during stem cell differentiation.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 1, (2011).</li><li>Chiu, F. C., Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+rat+spinal+cord+polysomes:+postnatal+development+and+experimental+demyelination.">Studies on rat spinal cord polysomes: postnatal development and experimental demyelination.</a> Journal of Neurochemistry. 31 (4), 835-844 (1978).</li><li>Larocca, J. N., Norton, W. T., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+myelin.">Isolation of myelin.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 3, (2007).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135 (4), 738-748 (2008).</li><li>Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues.">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. a., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

Hiçbir çıkar çatışması ilan etti.

Polyribosome fraksiyonasyon yeni bir teknik değildir, ancak, bu, özellikle zor bir kalır. Giriş maddesinin göre, önemli optimizasyonu gerekli olabilir. Bu, özellikle maddenin miktarı genellikle doku bileşenlerinin çeviri mRNA&#39;ların izole engelleyen bir sınırlama ve yağlı olan in vivo CNS örnekleri, için de geçerlidir. En yayınlanan fraksiyon protokolleri maya veya memeli hücre hatları ile anlaşma ve beyin 12,13,14 için kurulan protokolleri vardır. Bunun aksine, omurilik fraksiyonasyon açıklayan yayınlar herhangi bir zorlukla vardır ve önceki protokol 15, toplanmış edilecek hayvan çok sayıda omurilik gerektirir. Bu nedenlerden dolayı, birkaç temel modifikasyonlar tek bir fare omurilik dahil CNS dokular için fraksinasyon protokol uyum için yapılmıştır. Siklohekzimidsiz ile Ribozom immobilizasyon Durin ribozomların ayrılmasını önlemek için hayvan perfüzyon sırasında yapılırdoku çıkarma g uzun bir süreç. Daha sonra, RNA polysomal polyribosome verimini en üst düzeye çıkarmak için özel bir şekilde ekstre edilmiştir. İlk olarak, douncing ile doku homojenizasyon kontrol sağlam çekirdeği tutar ve DNA kirlenmesini önler. Çekirdeği, daha sonra santrifüjleme ile güvenilir bir şekilde uzaklaştırılır. NP-40 deterjan ve sodyum deoksikolat kombinasyonu, endoplazmik retikulum ve membran bağlantılı ribozom salım lizizine sağlar. Buna ek olarak, lipid açısından zengin olan miyelin UV emici bileşenler polyribosome profilleri gizleyebilir. Böyle poliribozomların gibi yoğun bileşikler topaklandı ve miyelin şamandıra gibi hafif bileşikler ve 16 kaldırılır nerede miyelin yüzdürme, bu nedenle gereklidir. Poliribozomların daha sonra 17.5% to 50% sukroz gradyanı üzerine çöktürülür. Yerine elle her sakaroz katman katman ve dondurma, geçişlerini de bir degrade mikser kullanarak hazırlanabilir. Asidik fenol / kloroform kullanılarak fraksiyonlardan RNA ekstraksiyonu sağlar: DNA az RNA kaybı ile kaldırılacak. Bununla birlikte, faz ters çevirme (fraksiyon 16 yukarıda) yoğun sükroz kısımların oluşabilir. Bu protokol, çeviri düzeyini ele diğer geleneksel yöntemler üzerinde avantaj sağlamaktadır. Örneğin, fosforile S6 (önemli bir çeviri işaretleyici) ölçümü yanı sıra radyoizotop ile doğmakta zincirleri etiketleme hem küresel çeviri düzeyleri hakkında bilgi verir ama özellikle tercüme ediliyor ne az ortaya koymaktadır. Polyribosome fraksiyonasyon, diğer taraftan, değerlendirme küresel çeviri değil, aynı zamanda çeviri mRNA ve ilgili düzenleyici proteinlerin kimlik sağlar. Kantitatif gerçek zamanlı PCR seçilen mRNA&#39;lanmn dışarı hızlı okuma için izole RNA&#39;lar yapılabilir ve mikroarray&#39;ler ve sonraki nesil dizileme RNA genom çalışmaları için yapılabilir. Burada sunulan, bu nedenle en iyi duruma azaltılması, bu teknik CNS dokuların minimal miktarda kullanılmasına izingerekli hayvan sayısını ing ve doku işlem süresini azaltarak genel deneysel kalitesinin artırılması. Öte yandan, bu teknik, çeviri olanlardan takılmış iken ribozomlar ayırt edemez. Durdu ribozomlar taşıyan transkript ağır kesirler çöktürmek edecek ve verileri yorumlayarak bu akılda tutulmalıdır. Ribozom, bir hücre tipi özel bir şekilde, sırasıyla epitop etiketleri veya muhabir ile etiketlenmiş ve immüno-çökeltme ile izole edilmiş mRNA 17,18 ilişkili olan, son bildirilen teknikler, yani RiboTaq ve TRAP vardır. Bu teknik, özel hücre popülasyonları için okuma yüksek çözünürlük sunan fraksiyonasyon polyribosome akuple edilebilir. Ribozom ayak baskı ribozomlar tarafından korunmaktadır mRNA&#39;lar başka bir yeni küçük fragmanları üretmek için nükleaz sindirimini içerir tekniği ya da &quot;ayak izi&quot; dir. Kütüphane daha sonra bu ayak oluşturulur ve dizilenmektedir. Bu yöntem, ataçeviri üzerine bir kodon-özel tüm genom analizi IDE ve durdu ribozomlar tespit etmek mümkün değildir, olmayan-Ağustos kodonları ve polyribosome fraksiyonasyonu 19 tarafından elde edilemeyen küçük memba açık okuma çerçeveleri, başlatın. Ancak, fraksiyonasyon polyribosome, böylece yüksek saflıkta örnek genellikle gerekli olduğu bir kütüphane hazırlanması için gerekli olan moleküler türler için zenginleştirici, bir ribozom içeren sindirilmiş fragmanlarının izole edilmesi için bir ribozom profil akuple edilebilir. Birlikte ele alındığında, polyribosome ayırma kalıcı öneme sahip esnek bir metot olup, yeni nesil genom sekanslama gibi deneyler dahil olmak üzere çeşitli alt uygulamalara akuple edilebilir.

Gen ekspresyonu için, en büyük bir etki 1 açısı ile, transkripsiyon, çeviri ve mRNA ve proteinlerin stabilitesi birleşik etkisi ile belirlenir. Bu adımların her biri son derece düzenlenmiş olduğunu şimdi açıktır. Mikro-RNA&#39;lar, RNA granül, alternatif ve sitoplazmik poliadenilasyonun oluşumu gen ifadesinin 2,3 post-transkripsiyonel düzenlenmesinde bazı örnekleridir. Bu mekanizmaların her biri çevirisinden transkripsiyon birbirinden ayrılacak ve ilgi duyulan biyolojik sistemde proteomesini etkilemektedir. Böylece, şaşırtıcı olmayan bir şekilde, yalnız mRNA düzeyleri protein düzeylerinin 4 kusurlu bir okuma vardır. Kantitatif proteomiks Ancak son gelişmelere rağmen, hassasiyet ve protein dizi çözünürlükte önemli sınırlamalar hala var, gen ifadesinin en doğrudan değerlendirmesini sağlar. Bu nedenle translatome adresleme, çeviri mRNAların repertuarı, eğitim arasında mükemmel bir denge sunuyortranscriptome ve proteomdaki. Bu nihai gen ifadesini değerlendirirken transkriptomik daha doğru ve daha yüksek kapsama alanı ve daha proteomikte dizisi çözünürlük hem de sağlar. Memeli sistemlerde, çeviri olayların çoğu kapak bağımlı başlaması ile başlar. Birlikte 40S ribozomal küçük alt-birimi ile ökaryotik başlatma faktörleri bir grup bir mRNA&#39;nın 5 &#39;başlık ile birleşir. Kompleks, daha sonra mRNA tarar ve Ağustos başlangıç ​​kodonu ulaştıktan sonra, tam bir 80S ribozom oluşturulması için 60S ribozomal alt birimini büyük işe. Uzama aşama ribozom uzama faktörleri, olgunlaşmamış peptid zincirine tRNA&#39;ların yüklü amino asitlerin dahil edilmesi yardımcı ile, mRNA&#39;nın boyunca hareket ile devam eder. Çoklu eş zamanlı olarak tek bir ribozomlar mRNA boyunca devam edebilir ve ilişkili ribozom sayısının protein sentezi 5,6 oranı ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Bu ribozomal yükleme tran için güvenilir bir gösterge yaparslation ve aktif sedimantasyon dayalı mRNA&#39;ları çeviri ayrılmasını sağlar. MRNA çeviri miktarının ilave olarak, sekans bilgileri için düzenlenmesinde rol oynayan motifleri tanımlamak için elde edilebilir. Ayrıca, bağlayıcı proteinler ve diğer faktörler için ilgili düzenleyici proteinlerin çalışma ve keşif kolaylaştıran farklı fraksiyonlarından izole edilebilir RNA. Sinir sisteminde, translasyon kontrol mRNA depolama, taşıma ve yerel protein sentezi gibi işlemler ile bağlantılı olmuştur. Büyüme konileri akson 7 geri kalanından farklı mRNA belirli bir lokalize havuz liman gösterilmiştir. Buna ek olarak, lokal akson proteinlerin 8,9 sentezleme yeteneğine sahiptirler. Sonuç olarak, çeviri lokal kontrol nörobiyoloji çalışmanın önemli bir konu haline gelmiştir. Bu adrese polyribosome fraksiyonasyon potansiyel tekniği için kullanılan edildiği, çeşitli çalışmalarda gösterilmişomurilik gelişiminde akson rehberlik araştırmak ve beyin 10,11 BDNF aktivite bağımlı çeviri gösterdi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Hank&#8217;s balanced salts solution</td>
			<td style="width:147px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14170-138</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethylpyrocarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93482</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNasin Plus RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonidet P-40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11332473001</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9722</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlycoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357538/357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x&#160;g</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Density Gradient Fractionator</td>
			<td>Teledyne Isco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo interrogation of central nervous system translatome by polyribosome fractionation

Çoklu işlemleri mRNA ve proteinlerin transkripsiyon, çeviri ve stabilitesi de dahil olmak üzere gen ekspresyonu katılmaktadırlar. Bu adımların her biri sıkıca protein bolluğu nihai dinamiklerini etkileyen düzenlenir. Çeşitli düzenleyici mekanizmalar, tek başına gen ifadesinin güvenilir bir göstergesi mRNA seviyeleri veren, translasyon adımında bulunmaktadır. Buna ek olarak, mRNA çevirisinin düzenlenmesi yerel özellikle nörobiyolojisinde ilgi odağı &#39;translatomics&#39; kayması, nöronal işlevleri implike edilmiştir. Sunulan bir yöntem köprü transkriptomik ve proteomics kullanılabilir. Burada birden çok ribozomlara aktif tercüme mRNA&#39;ların birlikte ve sukroz meyilleri içerisinde ayırıcı sedimantasyon göre translatome sorgular polyribosome paylarına ayırma tekniği için gerekli değişiklikleri açıklar. Geleneksel olarak, özellikle merkezindeki in vivo örnekleri, çalışmal sinir sistemi (CNS) nedeniyle malzemenin sınırlı miktarda ve yağ dokusu bileşenlerinin varlığı zor olduğu kanıtlanmıştır. Tek bir fare omurilik ve beyin kullanımı ile gösterildiği gibi, bu sorunu çözmek amacıyla, tarif edilen protokol, özellikle merkezi sinir sistemi materyalin minimum miktarda ile kullanım için optimize edilmiştir. Kısaca, CNS doku özü çıkarıldı ve çeviri ribozom sikloheksimid ile mRNA üzerinde immobilize edilir. Miyelin yüzdürme sonra lipid zengin bileşenleri kaldırmak için yapılır. Fraksiyonlama mRNA ribozomal kendi yüküne göre ayrılmış bir sükroz gradyanı üzerinde gerçekleştirilir. İzole edilmiş parçalar, yeni genom genişliğinde deney teknolojiler de dahil olmak üzere alt deneylerde, bir dizi için uygundur.

Şekil 2, kısımlara ayırma sonrası Örnek polyribosome profillerini göstermektedir. Hücre çizgileri için daha önce tarif edildiği gibi, beyin ve omurilik profilleri karakteristik emme eğrilerini gösterir. küçük ribozomal alt birimlere (40S) hafif fraksiyonlar sediman ve bağlı mRNAları büyük ribozomal alt birimi (60S) ve monosome (80S) bağlı mRNAları ardından profilinde bir zirve, ilk olarak görünür. Birden ribozomlara bağlanır mRNAları sonra zirveleri bağlı ribozomlar artan sayıda belirtilerek, ağır fraksiyonlar çöktürmek. Küresel çeviri profilinden değerlendirilebilir. Bir örnek olarak, beyin dokusu daha aktif Çeviri gösteren, omurilik dokusu daha oranını monosome için daha yüksek bir polyribosome sahiptir. Bireysel fraksiyonlardan ekstre 18S RNA ve 28S rRNA dağılımını gösteren, Bioanalyzer ile değerlendirildi. 18S rRNA küçük ribozomal alt birimi hafif sucr in çöktürülmesi, uygun olarak, profil daha önce görünür<html> ose kesirler. Toplam RNA&#39;nın tipik verimler, beyin ve omurilik için 2-4 mikrogram için 10-20 ug bulunmaktadır. Bireysel kısımlarındaki RNA verimleri fraksiyonu bağlı olarak, sırasıyla 4 ug ve beyin ve omurilik için 0.8 ug kadar vardır. Boş bir sukroz gradyanı nedeniyle zaten DTT varlığına bağlı olarak, 260 nm &#39;de bir arka plan emme gösterir. Bu arka plan örnek değerlerini normalleştirmek için veri analizi sırasında çıkartılabilir. EDTA tedavi sedimantasyon profil çeviri nedeniyle göstererek, polyribosome doruklarına çöktü. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1. Akışı ve in vivo polyribosome fraksiyonasyon potansiyel uygulamaları.&gt; Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> Boş degrade ve beyin olmadan Şekil 2.. (A) beyin ve Bioanalyzer tarafından çıkarılan RNA değerlendirilmesi ile omurilik, tipik polyribosome profilleri. (B) Mah-PCR ile kesirler üzerinde gapdh mRNA Dağılımı. (C) Polyribosome profilleri EDTA tedavisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> 2x degrade tampon </td><td> 30 mM Tris-HCl pH 7.4, 30 mM MgCl2, 600 mM NaCl, 200 ug / ml siklohegzimid (CHX), 2mM ditiyotreitol (DTT) </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sakaroz çözeltisini% 17,5 </td><td> 8.67 g sukroz, gradyan tamponu 2x 25 mi, 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sakaroz çözeltisini% 25.6 </td><td> 12.8 g sukroz, gradyan tamponu 2x 25 mi, 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sakaroz çözeltisini% 33.8 </td><td> 16.9 g sukroz, gradyan tamponu 2x 25 mi, 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sakaroz çözeltisini% 41,9 </td><td> 20.95 g sukroz, gradyan tamponu 2x 25 mi, 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> sakaroz çözeltisi% 50 </td><td> 25 g sukroz, gradyan tamponu 2x 25 mi, 50 ml DEPC H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> homojenizasyontampon A </td><td> 0.25 M sukroz, 50 mM Tris / HCl, pH 7.4), 5 mM MgCI2, 25 mM KCI </td><td> 200 ug / ml CHX, 1x Roche adet tam proteaz inhibitör, 1 mM DTT, 1 mM phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), 100 U / ml RNAsin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 2M sakaroz çözüm </td><td> % 68.4 sakaroz, 50 mM Tris-HCI, pH 7.4, 5 mM MgCI2, 25 mM KCI </td><td> 100 ug / ml CHX, 1x Roche adet tam proteaz inhibitör, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 1.1M sukroz solüsyonunun </td><td> % 38.5 sakaroz, 50 mM Tris-HCI, pH 7.4, 5 mM MgCI2, 25 mM KCI </td><td> 100 ug / ml CHX, 1x Roche adet tam proteaz inhibitör, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 0.9M sukroz solüsyonunun </td><td> % 30.8 sakaroz, 50 mM Tris-HCI, pH 7.4, 5 mM MgCI2, 25 mM KCI </td><td> 100 ug / ml CHX, 1x Roche adet tam proteaz inhibitör, 1 mM DTT, 1 mM PMSF </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> homogenization tampon B </td><td> 0.25 M sukroz, 50 mM Tris / HCl, pH 7.4, 5 mM MgCI2, 25 mM KCI,% 1 NP-40,% 1 sodyum deoksikolat </td><td> 200 ug / ml CHX, 1x Roche adet tam proteaz inhibitör, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 100 U / ml RNAsin </td></tr></tbody></table> Tamponlar ve çözümleri Tablo 1.. Listesi.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation at JoVE.com

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Bu protokol, in vivo CNS numunelerin translatome incelemek amacıyla polyribosome fraksiyonasyon bölgesinin temel bir değişiklik göstermektedir. Bu, izolasyon ve bağlı RNA ribozom fraksiyonlarının toplam RNA ile karşılaştırılması, translasyon ve transkripsiyon düzenleme küresel değerlendirmesini sağlar.

Polyribosome Fraksiyonu tarafından Santral Sinir Sistemi Translatome in vivo sorguluyor

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

in-vivo-interrogation-central-nervous-system-translatome-polyribosome

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

12.2K Görüntüleme.  German Cancer Research Center (DKFZ).  Bu protokol, in vivo CNS numunelerin translatome incelemek amacıyla polyribosome fraksiyonasyon bölgesinin temel bir değişiklik göstermektedir. Bu, izolasyon ve bağlı RNA ribozom fraksiyonlarının toplam RNA ile karşılaştırılması, translasyon ve transkripsiyon düzenleme küresel değerlendirmesini sağlar. 