עבודה זו נתמכה על ידי המשרד הפדרלי הגרמני לחינוך ולמחקר (BMBF), הביולוגיה מערכות איתות בסרטן (הלמהולץ ברית במערכות ביולוגיה) והמרכז לחקר הסרטן הגרמני (DKFZ).

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות מוסדיות של DKFZ. זהירות: כדי למנוע זיהום RNase של דגימות, לנקוט באמצעי זהירות בסיסית למניעת הזיהום RNase ולהכין את כל המאגרים במי DEPC שטופל. 1. הכנת עירובי סוכרוז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 17.5, 25.6, 33.8, 41.9 ופתרונות סוכרוז 50% (ראה טבלה 1). התחל בהכנה על ידי הוספה הדרגתיים לאט 2 מיליליטר של 50% תמיסת סוכרוז לחלק התחתון של צינור ultracentrifuge polyallomer. להקפיא את השכבה על ידי הנחת צינורות עבור 20 דקות ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את השכבות הבאות בהפחתת אחוזי סוכרוז בצעדי הקפאה שביניהם, שהסתיימה עד סוכרוז 17.5%. שמור הדרגתיים על קרח במהלך תוספת של פתרונות סוכרוז כדי למנוע הפשרה של שכבות שמתחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן הדרגתיים סוכרוז טרי יום אחד לפני השימוש ולשמור על 4 ° C. Alternatively, להכין הדרגתיים מראש, חנות ב -80 מעלות צלזיוס והפשרה על 4 מעלות צלזיוס בלילה שלפני הניסוי. </li></ol> 2. הכנת רקמה (כבל ו / או מוח השדרה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי עכבר על ידי מנת יתר של Xylazin וKetamin בNaCl וtranscardially תנקב עם 20 מיליליטר של התמיסה של האנק מאוזן מלחים (HBSS) המכילה 200 CHX מיקרוגרם / מיליליטר שמשתק את הריבוזומים בתמלילים קשורים. לאשר הרדמה נכונה על ידי אי - היענות לצובט הבוהן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ רקמות במהירות. פתח את dorsally הגולגולת ולחלץ את המוח. בצע laminectomy של כל בית החזה ועמוד השדרה המותני ולחלץ את חוט השדרה. השתמש במוח כולו (~ מ&quot;ג 400) או חתיכת חוט השדרה (~ מ&quot;ג 90) 4 סנטימטר, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הרקמה לתוך מאגר המגון קר כקרח (ראה טבלה 1) (בחוט השדרה: 1 מיליליטר; מוח: 4 מיליליטר) וקוביות לחתיכות קטנות עם אזמל נקי כדי לאפשר ספיגה מוגברת של cycloheximide. Perfo<html> rm כל צעדים נוספים על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 15 דקות וhomogenize רקמה באופן מכאני באמצעות homogenizer Dounce. המגון מבוקר בקפידה יש ​​צורך להבטיח שגרעינים יישארו ללא שינוי. לטפל בכל הדגימות בדיוק באותו אופן, כדי להבטיח השוואתיים. הערה: לרקמת מוח: לשבש את רקמה על ידי 5 משיכות עם העלי בחוזקה הולם. לרקמה בחוט השדרה: לשבש ידי 5 משיכות עם העלי רפוי, ואחרי 5 משיכות נוספות עם העלי בחוזקה הולם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח aliquots (400 μl למוח ו200 μl לחוט השדרה), הקפאת הבזק ולאחסן ב -80 ° C לסך בידוד RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הגרעינים ותא בלא הפרעה ושברי רקמה על ידי צנטריפוגה ב XG 500 10 דקות ב 4 ° C. צנטריפוגה במהירות נמוכה מונעת אובדן של הריבוזומים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברי Lyse קרום בsupernatant בחינם הגרעינים ל30 דקות על ידי הוספת NP-40 וחומרי ניקוי deoxycholate נתרן (כל אחד לריכוז סופי של 1%). </li></ol>&quot;Jove_title&quot;&gt; 3. הנפקה המיאלין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צעד זה מסיר רכיבי שומן מן המדגם שאחרת יהיה להסוות את האות בפרופיל polyribosome. ראשית, דליים מראש צינת ultracentrifuge והרוטור על 4 מעלות צלזיוס ולהכין 2 M, 1.1 M ופתרונות סוכרוז 0.9 M (ראו טבלה 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים lysate עם 1.22 כרכים של 2 תמיסת סוכרוז M ולהעביר לתוך צינור ultracentrifuge פוליאתילן. למלא את כל הצינורות לנפח שווה של 10 מיליליטר עם 1.1 M תמיסת סוכרוז, לאחר מכן כיסויו בזהירות עם 0.9 M תמיסת סוכרוז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינורות ultracentrifuge לסלים ultracentrifuge טרום צוננים. צנטריפוגה במשך 3 שעות ב 100,000 XG ב 4 ° C. במהלך תהליך זה הריבוזומים להיות מופקד בגלולה ואילו רכיבי שומן יצופו למעלה ויישארו בsupernatant. </li></ol> 4. סוכרוז Gradient היפוך חלוק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את supernatant ו לפזר גלולה במאגר הומוגניזציה ב &#39;(ראה טבלת מס&#39; 1 </strong&gt;). מדוד את הספיגה ב 260 ננומטר עבור כל דגימה באמצעות Nanodrop או מכשירים שווי ערך ולנרמל את הכמויות כדי לטעון לפי הערך ספיגת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח הדרגתיים סוכרוז (הכנה מתוארת בסעיף קודם) לתוך דליי ultracentrifuge טרום צוננים. דגימות שכבה בזהירות על גבי השיפוע. הוספת שיפוע סוכרוז ריק אחד כמו שליטה טכנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את המשקל של כל אחד מהסלים עם חיץ הומוגניזציה. צנטריפוגה דגימות ל1.5 שעות ב285,000 XG ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל בהכנות דקות ISCO fractionator 30 לפני סוף צנטריפוגה. אם דגם אחר של fractionator משמש, בצע את הפרוטוקול של היצרן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הרגישות המתאימה (0.2 AUFS למוח או 0.05 AUFS לחוט השדרה) למנורת UV ולעבור אותו לחימום. להרכיב את מדקר הצינור, לחבר אותו באמצעות המשאבה מתגלגלת 60% תמיסת סוכרוז דרך מדקר הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ההתקנה על ידי שאיבת סוכרוז (זרימת עכברושדואר: 1 מיליליטר / דקה), ובמיוחד לוודא שאין דליפות בtubings אשר להכניס בועות לתוך השיפוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קליטת רקע ריקה על ידי שאיבה ידנית חיץ שיפוע לתוך גלאי UV ותיקון קו הבסיס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציא בזהירות את דליי ultracentrifuge המכילים סוכרוז הדרגתיים עם דגימות משקעים מהרוטור ומניח אותם על קרח. הימנע מכל הקפצת של הדרגתיים על מנת למנוע אובדן של רזולוציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדרגות לרוץ על fractionator. הפעל הדרגות ריקות ראשון להעריך ספיגת רקע ולהבטיח התקנה טכנית מתאימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף שיפוע לגלאי UV ולנקב את החלק התחתון של הצינור עם מדקר הצינור. התחל את השאיבה של סוכרוז 60%, שתחליף את השיפוע עם דגימות משקעים כלפי מעלה דרך גלאי UV ולתוך מתקן הטיפה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הספיגה ב 260 ננומטר מתועד על מנת ליצור את פרופיל הקליטה לדוגמה, עם פסגות מציינות sedimentation של mRNAs הקשורים ליחידות משנת ריבוזומלי, monosomes, ולאחר מכן מספר גדל והולך של הריבוזומים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף דגימות ל20 שברים באמצעות מתקן הטיפה (600 μl כל אחד, ב2 צינורות מיליליטר). </li></ol> 5. בידוד RNA מן הברים בודדים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת SDS 10% לריכוז סופי של 1% לשברים פרט ומערבבים היטב על מנת להתפתח חלבונים ולנתק הריבוזומים. בשלב זה ניתן להקפיא דגימות ב -80 ° C. בהתאם לשאלה יש לטפל, ניתן ונקווה שברים בהתאם לפרופיל הספיגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד RNA עם מיצוי פנול / כלורופורם חומצי, אשר גם מסיר עקבות זיהום של ה-DNA. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח אחד של פנול / כלורופורם חומצי (prewarmed לRT) לכל דגימה, חום 10 דקות ב 65 מעלות צלזיוס ולחץ שחרורו מתחת למכסת מנוע קטר לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות עבור 20 דקות ב 17,000 XG ב RT. בזהירות העברת שלב מימית ל1.5 מיליליטר חדשצינור. להיות מודע להיפוך שלב בשברי סוכרוז צפופים, שבו השלב המימית עשוי להיות בתחתית לאחר צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נפח אחד של isopropanol, 1/9 אצטט נפח נתרן (pH 5.2) וGlycoblue μl 1 לכל דגימה על מנת לזרז RNA. שמור דגימות שעה לפחות 1 ב -80 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 30 דקות ב 17,000 XG ו4 ° C. Glycoblue מספק הדמיה של גלולה. הסר supernatant, לשטוף גלולה פעם אחת עם קרח קר אתנול 80% וגלולים אוויר יבש. ממיסים גלולה במי RNase ללא. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכמת כמות הרנ&quot;א על ​​ידי Nanodrop ולנתח שלמות RNA על ידי שבב Bioanalyzer. RNA אשר מתקבל על ידי הפרוטוקול שהוצג מתאים לכל המצב של מבחני תפוקה גבוהה אמנות כולל microarray ורצף עמוק. </li></ol>

<ol>
	<li>Schwanh&#228;usser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control.">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Piqu&#233;, M., L&#243;pez, J. M., Foissac, S., Guig&#243;, R., M&#233;ndez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+combinatorial+code+for+CPE-mediated+translational+control.">A combinatorial code for CPE-mediated translational control.</a> Cell. 132 (3), 434-448 (2008).</li><li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R. S., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling.">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), 218-223 (2009).</li><li>Grolleau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+specific+translational+control+by+rapamycin+in+T+cells+uncovered+by+microarrays+and+proteomics.">Global and specific translational control by rapamycin in T cells uncovered by microarrays and proteomics.</a> The Journal of Biological Chemistry. 277 (25), 22175-22184 (1074).</li><li>Rajasekhar, V. K., Viale, A., Socci, N. D., Wiedmann, M., Hu, X., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+Ras+and+Akt+signaling+contribute+to+glioblastoma+formation+by+differential+recruitment+of+existing+mRNAs+to+polysomes.">Oncogenic Ras and Akt signaling contribute to glioblastoma formation by differential recruitment of existing mRNAs to polysomes.</a> Molecular Cell. 12 (4), 889-901 (2003).</li><li>Zivraj, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcellular+profiling+reveals+distinct+and+developmentally+regulated+repertoire+of+growth+cone+mRNAs.">Subcellular profiling reveals distinct and developmentally regulated repertoire of growth cone mRNAs.</a> The Journal of Neuroscience. 30 (46), 15464-15478 (2010).</li><li>Brittis, P. a., Lu, Q., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+protein+synthesis+provides+a+mechanism+for+localized+regulation+at+an+intermediate+target.">Axonal protein synthesis provides a mechanism for localized regulation at an intermediate target.</a> Cell. 110 (2), 223-235 (2002).</li><li>Tcherkezian, J., Brittis, P. a., Thomas, F., Roux, P. P., Flanagan, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmembrane+receptor+DCC+associates+with+protein+synthesis+machinery+and+regulates+translation.">Transmembrane receptor DCC associates with protein synthesis machinery and regulates translation.</a> Cell. 141 (4), 632-644 (2010).</li><li>Colak, D., Ji, S. -. J., Porse, B. T., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+axon+guidance+by+compartmentalized+nonsense-mediated+mRNA+decay.">Regulation of axon guidance by compartmentalized nonsense-mediated mRNA decay.</a> Cell. 153 (6), 1252-1265 (2013).</li><li>Lau, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+3'UTRs+differentially+regulate+activity-dependent+translation+of+brain-derived+neurotrophic+factor+(BDNF).">Distinct 3'UTRs differentially regulate activity-dependent translation of brain-derived neurotrophic factor (BDNF).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15945-15950 (2010).</li><li>Del Prete, M. J., Vernal, R., Dolznig, H., M&#252;llner, E. W., Garcia-Sanz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+polysome-bound+mRNA+from+solid+tissues+amenable+for+RT-PCR+and+profiling+experiments.">Isolation of polysome-bound mRNA from solid tissues amenable for RT-PCR and profiling experiments.</a> RNA. 13 (3), 414-421 (2007).</li><li>Esposito, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+polyribosome+profile+analysis.">Eukaryotic polyribosome profile analysis.</a> J. Vis. Exp. (40), (2010).</li><li>Sampath, P., Lee, Q. Y., Tanavde, V., Schlaeger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+translationally+regulated+genes+during+stem+cell+differentiation.">Identifying translationally regulated genes during stem cell differentiation.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 1, (2011).</li><li>Chiu, F. C., Smith, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+rat+spinal+cord+polysomes:+postnatal+development+and+experimental+demyelination.">Studies on rat spinal cord polysomes: postnatal development and experimental demyelination.</a> Journal of Neurochemistry. 31 (4), 835-844 (1978).</li><li>Larocca, J. N., Norton, W. T., Bonifacino, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+myelin.">Isolation of myelin.</a> Current Protocols in Cell Biology. Chapter 3, (2007).</li><li>Heiman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+translational+profiling+approach+for+the+molecular+characterization+of+CNS+cell+types.">A translational profiling approach for the molecular characterization of CNS cell types.</a> Cell. 135 (4), 738-748 (2008).</li><li>Sanz, E., Yang, L., Su, T., Morris, D. R., McKnight, G. S., Amieux, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues.">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. a., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

אין ניגוד האינטרסים הכריז.

למרות polyribosome חלוקה היא לא טכניקה חדשנית, הוא נשאר אחד מאתגר במיוחד. בהתבסס על חומר ההזנה, אופטימיזציה משמעותית יכולה להיות נחוצה. הדבר נכון במיוחד במקרה של in vivo דגימות של מערכת העצבים המרכזית, שבו כמות החומר היא לעתים קרובות הגבלה ושומן מרכיבי רקמה לעכב בידוד של mRNAs תרגום. פרוטוקולים שפורסמו חלוקה ביותר להתמודד עם שמרים או שורות תאי יונקים, ויש פרוטוקולים שהוקמו למוח 12,13,14. לעומת זאת, בקושי יש פרסומים המתארים חלוקה של מיתרי השדרה, ופרוטוקולים קודמים דורשים חוט השדרה ממספר רב של בעלי חיים שאספו 15. מסיבות אלה, כמה שינויים מהותיים שנעשו על מנת להתאים את פרוטוקול חלוקה לרקמות מערכת העצבים המרכזית, כוללים חוט השדרה עכבר אחת. חוסר תנועת הריבוזום עם cycloheximide מבוצעת במהלך זלוף בעלי החיים, כדי למנוע ניתוק של הריבוזומים דוריןg התהליך הארוך של מיצוי רקמה. בהמשך לכך, RNAs polysomal המחולצים באופן ספציפי על מנת למקסם את תשואת polyribosome. ראשית, בשליטת המגון של הרקמה על ידי douncing, שומר על הגרעין שלם ומונע זיהום ה-DNA. הגרעין לאחר מכן הוסר באופן מהימן על ידי צנטריפוגה. השילוב של חומרי הניקוי NP-40 וdeoxycholate נתרן מבטיח תמוגה של reticulum ושחרורו של הריבוזומים הקרום הקשורים אליו endoplasmic. בנוסף, רכיבים סופג UV בתוך המיאלין העשיר השומנים לטשטש את פרופילי polyribosome. הנפקת המיאלין לכן יש צורך, שבו תרכובות צפופות כגון polyribosomes הם pelleted ותרכובות קלות כמו לצוף המיאלין ויוסרו 16. אז Polyribosomes הם משקעים על שיפוע סוכרוז 17.5% 50%. במקום ידני שכבות והקפאה כל שכבת סוכרוז, יכול גם להיות מוכן הדרגתיים בעזרת מערבל שיפוע. מיצוי של RNA משברים באמצעות פנול / כלורופורם חומציים מאפשר DNA שיש להסירו עם אובדן RNA מינימאלי. עם זאת, היפוך שלב עלול להתרחש בברים צפופים סוכרוז (מעל שבריר 16). פרוטוקול זה מספק יתרונות על פני שיטות קונבנציונליות אחרות המטפלים ברמת התרגום. לדוגמא, שתי המדידה של S6 פוספורילציה (סמן תרגום בולט), כמו גם התיוג של רשתות המתהוות עם רדיואיזוטופים לתת מידע על רמות התרגום העולמיים אבל מגלה מעט על מה שדווקא הוא להיות מתורגם. Polyribosome חלוקה, ומצד שני, מאפשרת לא רק הערכה של תרגום העולמי, אלא גם בזהות של mRNAs תרגום והחלבונים רגולטוריים בנושא. יכול להתבצע בזמן אמת PCR כמו בRNAs המבודד לקריאה מהירה מmRNAs שנבחר, וmicroarrays ורצף RNA דור הבא ניתן לבצע ללימודים רחבים הגנום. אופטימיזציות שהוצגו כאן מאפשרות את הטכניקה לשימוש עם כמויות מינימליות של רקמות במערכת העצבים המרכזית, ולכן תקטנהing את מספר בעלי החיים הדרושים ושיפור איכות ניסיונית הכוללת על ידי הקטנת זמן עיבוד רקמה. מצד השני, טכניקה זו לא יכולה להבדיל בין הריבוזומים נתקע מאלו תרגום. תעתיקי ביצוע הריבוזומים נתקע יהיו משקעים שבברים הכבדים, ואת זה צריך לזכור כאשר לפרש את הנתונים. קיימות טכניקות האחרונות שדווחו, כלומר RiboTaq ומלכודת, שבו הריבוזומים מסומנים עם תגי epitope או כתבי בהתאמה באופן ספציפי לסוג תא וקשור mRNAs מבודד על ידי immunoprecipitation 17,18. טכניקה זו יכולה להיות יחד כדי polyribosome חלוקה להציע ברזולוציה גבוהה הקריאו לאוכלוסיות תאים ספציפיות. רגל הדפסת ריבוזום היא טכניקה נוספת שרומן כרוך עיכול nuclease ליצור שברים קטנים, או &quot;עקבות&quot;, של mRNAs שמוגנים על ידי הריבוזומים. לאחר מכן ספריות נוצרות מהעקבות הללו ורצף. prov שיטה זואידו ניתוח הגנום כולו קודון הספציפי על תרגום, והוא מסוגל לזהות הריבוזומים נתקע, לא באוגוסט להתחיל קודונים ומסגרות קטנות במעלה הזרם פתוחות קריאה, שלא יכולים להיות מושגת על ידי חלוקה polyribosome 19. עם זאת, polyribosome חלוקה יכולה להיות מצמידים את פרופיל הריבוזום לבידוד של שברים מתעכלים המכילים ריבוזומים בודדים, ובכך מעשירה למינים המולקולריים הנחוצים להכנת ספרייה שבה הוא נדרש לעתים קרובות טוהר גבוה מדגם. יחדיו, חלוקה polyribosome היא שיטה גמישה עם משמעות ארוכת טווח ויכולה להיות מצמידים את יישומים במורד הזרם שונים, כולל מבחני רחבים הגנום כמו הדור הבא של רצף.

ביטוי גנים נקבע על ידי הפעולה המשולבת של שעתוק, תרגום ויציבות של mRNA וחלבונים, עם תרגום הנושא את ההשפעה הדומיננטית ביותר 1. עכשיו זה ברור שכל אחד מהשלבים הבאים הוא פיקוח הדוק. מיקרו-RNAs, היווצרות של גרגרי RNA, אלטרנטיבי וpolyadenylation cytoplasmic כמה דוגמאות לרגולציה שלאחר תעתיק של ביטוי גני 2,3. כל אחד ממנגנונים אלה uncouples תעתיק מתרגום ומשפיע proteome במערכת הביולוגית של עניין. לכן, באופן לא מפתיע, רמות ה-mRNA לבד readout מושלם של רמות חלבון 4. פרוטאומיקה כמותיים מספקת הערכה הישירה ביותר של ביטוי גנים, עם זאת, למרות ההתקדמות, עדיין יש מגבלות רבות על רגישות ורזולוציה רצף חלבון. לכן פונה translatome, הרפרטואר של mRNAs תרגום, מציע פשרה מצוינת בין לומדtranscriptome וproteome. זה יותר מדויק מאשר transcriptomics בהערכת ביטוי גנים סופי, ומספק גם כיסוי גבוה יותר ורזולוציה רצף מ פרוטאומיקה. במערכות של יונקים, הרוב המכריע של אירועי תרגום יתחיל באמצעות ייזום כובע תלוי. קבוצה של גורמי חניכה אוקריוטים יחד עם מקטע ריבוזומלי הקטן 40S להרכיב בכובע &#39;5 של ה-mRNA. המורכב ואז סורק את ה-mRNA ועם הגיע לתחילת קודון לאוגוסט, מגייס למקטע ריבוזומלי 60S הגדול כדי ליצור 80S מלא הריבוזום. תמורת שלב התארכות עם הריבוזום נע לאורך ה-mRNA, עם גורמי התארכות סיוע לשילוב של חומצות אמינו מtRNAs הטעון לשרשרת פפטיד המתהווה. הריבוזומים מרובים יכולים להמשיך לאורך mRNA אחד בו זמנית ובמספר הריבוזומים הקשורים הוכח לתאם עם השיעור של סינתזת חלבון 5,6. זה עושה את טעינת ריבוזומלי אינדיקציה אמינה לטראןslation ומאפשר הפרדה פעילה תרגום mRNAs המבוסס על קצב שקיעה. בנוסף לכימות של תרגום mRNAs, ניתן לקבל מידע רצף לזהות מוטיבים מעורבים בויסות תרגום. גם RNA מחייבים חלבונים ויכולים להיות מבודדים משברים שונים גורמי תרגום אחרים, להקל על המחקר וגילוי של חלבונים רגולטוריים בנושא. במערכת העצבים, בקרת translational נקשרה לתהליכים כגון אחסון ה-mRNA, תחבורה וסינתזת חלבון מקומית. קונוסים צמיחה הוכחו נמל בריכה מקומית ספציפית של mRNAs שונה משאר האקסון 7. בנוסף, האקסונים להחזיק את היכולת לסנתז באופן מקומי חלבוני 8,9. כתוצאה מכך, שליטה מקומית של תרגום הפכה לנושא חיוני של מחקר בנוירוביולוגיה. הפוטנציאל של חלוקה polyribosome כדי לטפל בזה כבר הודגם במספר מחקרים, שבו הטכניקה שימשהלחקור האקסון הדרכה בפיתוח חוט השדרה, והפגין את תרגום הפעילות תלויה של BDNF ב10,11 המוח.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Hank&#8217;s balanced salts solution</td>
			<td style="width:147px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14170-138</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethylpyrocarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93482</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNasin Plus RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonidet P-40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11332473001</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9722</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlycoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357538/357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x&#160;g</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Density Gradient Fractionator</td>
			<td>Teledyne Isco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo interrogation of central nervous system translatome by polyribosome fractionation

תהליכים רבים מעורבים בביטוי גנים, כולל שעתוק, תרגום ויציבות של mRNAs וחלבונים. כל אחד מהצעדים הללו בחוזקה מוסדרת, המשפיע על הדינמיקה הסופית של שפע חלבון. מנגנוני פיקוח שונים קיימים בשלב התרגום, עיבוד רמות ה-mRNA לבד אינדיקטור אמין של ביטוי גנים. בנוסף, רגולציה מקומית של תרגום mRNA הייתה מעורבת בעיקר בפונקציות עצביות, הסטה &#39;translatomics&#39; למוקד תשומת הלב בנוירוביולוגיה. השיטה שהוצגה יכולה לשמש כדי transcriptomics הגשר ופרוטאומיקה. כאן אנו מתארים שינויים חיוניים לטכניקה של חלוקה polyribosome, שחוקרת את translatome המבוסס על הקשר של mRNAs תורגם באופן פעיל לריבוזומים רבים וההשקעה שלהם בהפרש הדרגתיים סוכרוז. באופן מסורתי, עבודה עם in vivo דוגמאות, במיוחד של CENTRAמערכת העצבים l (CNS), הוכיחה מאתגרת בשל הכמויות מוגבלות של חומר ואת נוכחותם של מרכיבי רקמת שומן. על מנת לטפל בזה, הפרוטוקול המתואר הוא מותאם במיוחד לשימוש עם כמות מינימאלית של חומר במערכת העצבים המרכזית, כפי שהודגמו על ידי השימוש בכבל יחיד עכבר השדרה ובמוח. בקצרה, רקמות מערכת העצבים המרכזית המחולצים והריבוזומים תרגום הם משותקים על mRNAs עם cycloheximide. הנפקת המיאלין מתבצעת לאחר מכן להסיר רכיבים עשירים שומנים בדם. חלוקה מתבצעת על שיפוע סוכרוז בי mRNAs מופרדים על פי טעינת ריבוזומלי שלהם. שברים מבודדים מתאימים למגוון רחב של מבחני במורד הזרם, כוללים טכנולוגיות assay הגנום רחב חדשות.

איור 2 מראה פרופילי polyribosome נציג לאחר חלוקה. הפרופילים של מוח וחוט השדרה להראות עקומות קליטה אופייניות כפי שתוארו קודמים לשורות תאים. mRNAs חייב יחידות משנה קטנות ריבוזומלי משקעים בשברים קלים יותר (40S) ומופיע לראשונה כשיא על הפרופיל, ואחריו למקטע הגדול ריבוזומלי (60S) וmonosome (80S) mRNAs כבולות. mRNAs חייב הריבוזומים מרובים משקעים שבברים כבדים יותר, עם הפסגות בהמשך מצביעים על מספר גדל והולך של הריבוזומים מאוגדים. תרגום עולמי ניתן להעריך מהפרופיל. כדוגמא, יש רקמת מוח polyribosome גבוהה יותר לmonosome יחס מאשר רקמה בחוט השדרה, מה שמעיד תרגום פעיל יותר. RNA חילוץ משברים בודדים נבדקו על ידי Bioanalyzer, מראה הפצה של 18S ו28S rRNA. 18S rRNA מופיע מוקדם יותר בפרופיל, בהתאם ליחידות המשנה הקטנה ריבוזומלי סדימנטציה בsucr הקל<html> שברים OSE. תשואות אופייניות של רנ&quot;א הכל הן 10-20 מיקרוגרם למוח ו2-4 מיקרוגרם לחוט השדרה. תשואות RNA משברים בודדים הן עד 4 מיקרוגרם ו0.8 מיקרוגרם למוח וחוט השדרה, בהתאמה, בהתאם לחלק הקטן. שיפוע סוכרוז ריק כבר מראה כמה קליטת רקע ב 260 ננומטר, בשל נוכחותם של DTT. על רקע זה יכול להיות מופחת במהלך ניתוח הנתונים על מנת לנרמל את ערכי מדגם. טיפול EDTA קרס פסגות polyribosome, הוכחת פרופיל שקיעה נובע מתרגום. <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. זרימת עבודה ויישומים אפשריים של in vivo חלוקה polyribosome.&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> פרופילי איור 2. () פרופילים אופייניים polyribosome של מוח וחוט השדרה, עם הערכה של RNA שחולץ על ידי Bioanalyzer. הפצה של GAPDH mRNA על שברים ידי qRT-PCR (ב &#39;). (C) Polyribosome של שיפוע ריק ומוח עם ובלי טיפול EDTA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> חיץ שיפוע 2x </td><td> 30 מ&quot;מ טריס-HCl pH7.4, 30 מ&quot;מ MgCl 2, 600 mM NaCl, 200 מיקרוגרם / מיליליטר cycloheximide (CHX), 2 המ&quot;מ dithiothreitol (DTT) </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> תמיסת סוכרוז 17.5% </td><td> 8.67 סוכרוז גרם, 25 מיליליטר 2x חיץ שיפוע, עד 50 מיליליטר H DEPC 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> תמיסת סוכרוז 25.6% </td><td> 12.8 סוכרוז גרם, 25 מיליליטר 2x חיץ שיפוע, עד 50 מיליליטר H DEPC 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> תמיסת סוכרוז 33.8% </td><td> 16.9 סוכרוז גרם, 25 מיליליטר 2x חיץ שיפוע, עד 50 מיליליטר H DEPC 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> תמיסת סוכרוז 41.9% </td><td> 20.95 סוכרוז גרם, 25 מיליליטר 2x חיץ שיפוע, עד 50 מיליליטר H DEPC 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> תמיסת סוכרוז 50% </td><td> 25 סוכרוז גרם, 25 מיליליטר 2x חיץ שיפוע, עד 50 מיליליטר H DEPC 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> המגוןחיץ </td><td> 0.25 M סוכרוז, 50 מ&quot;מ טריס / HCl, pH7.4), 5 מ&quot;מ MgCl 2, 25 מ&quot;מ KCl </td><td> 200 CHX מיקרוגרם / מיליליטר, מעכב 1x רוש שלם פרוטאז, 1 מ&quot;מ DTT, phenylmethanesulfonylfluoride 1 מ&quot;מ (PMSF), 100 U / ml RNasin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> תמיסת סוכרוז 2M </td><td> סוכרוז 68.4%, 50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH7.4, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 25 מ&quot;מ KCl </td><td> 100 CHX מיקרוגרם / מיליליטר, מעכב 1x רוש שלם פרוטאז, 1 מ&quot;מ DTT, PMSF 1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> תמיסת סוכרוז 1.1M </td><td> סוכרוז 38.5%, 50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH7.4, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 25 מ&quot;מ KCl </td><td> 100 CHX מיקרוגרם / מיליליטר, מעכב 1x רוש שלם פרוטאז, 1 מ&quot;מ DTT, PMSF 1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> תמיסת סוכרוז 0.9M </td><td> סוכרוז 30.8%, 50 מ&quot;מ טריס-HCl, pH7.4, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 25 מ&quot;מ KCl </td><td> 100 CHX מיקרוגרם / מיליליטר, מעכב 1x רוש שלם פרוטאז, 1 מ&quot;מ DTT, PMSF 1 מ&quot;מ </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> שעותomogenization חיץ B </td><td> 0.25 M סוכרוז, 50 מ&quot;מ טריס / HCl, pH7.4, 5 מ&quot;מ MgCl 2, 25mm KCl, 1% NP-40, deoxycholate נתרן 1% </td><td> 200 CHX מיקרוגרם / מיליליטר, מעכב 1x רוש שלם פרוטאז, 1mm DTT, 1 מ&quot;מ PMSF, 100 U / ml RNasin </td></tr></tbody></table> טבלת 1. רשימה של מאגרים ופתרונות.

Watch this Scientific Journal Video about In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation at JoVE.com

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

פרוטוקול זה ממחיש שינויים מהותיים בחלוקת polyribosome כדי ללמוד translatome של in vivo דגימות במערכת העצבים המרכזית. זה מאפשר הערכה הגלובלית של רגולציה תרגום ותעתיק דרך הבידוד והשוואה של רנ&quot;א הכל לריבוזום שברי RNA מאוגד.

בחקירתו vivo של Translatome מערכת עצבים המרכזי על ידי Polyribosome היפוך חלוק

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

in-vivo-interrogation-central-nervous-system-translatome-polyribosome

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

12.2K Views.  German Cancer Research Center (DKFZ).  פרוטוקול זה ממחיש שינויים מהותיים בחלוקת polyribosome כדי ללמוד translatome של in vivo דגימות במערכת העצבים המרכזית. זה מאפשר הערכה הגלובלית של רגולציה תרגום ותעתיק דרך הבידוד והשוואה של רנ"א הכל לריבוזום שברי RNA מאוגד. 

Video: In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

עצב הראייה חיתוך רוחב: מודל של אפופטוזיס Neuron למבוגרים במערכת העצבים המרכזית

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

הפקה של וקטורים lentiviral עבור תאים Transducing ממערכת העצבים המרכזית

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

פרדיגמה פגיעה לחקור תיקון של מערכת עצבים מרכזי ב<em&gt; דרוזופילה</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

משלוח תוך חדרי ישיר של תרופות למערכת העצבים המרכזית מכרסם

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

הערכה תפקודית של ביולוגי עצבי בתרבויות ברשת של תאי גזע שמקורם בנוירונים במערכת עצבים מרכזי

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

הקלטה אלקטרופיזיולוגיות של פעילות מערכת העצבים המרכזית השלישית-לחלל דרוזופילה Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...