이 작품은 독일 연방 교육 연구부 (BMBF), (시스템 생물학에 헬름홀츠 얼라이언스) 암의 시그널링의 시스템 생물학 및 독일 암 연구 센터 (DKFZ)에 의해 지원되었다.

모든 동물 실험은 DKFZ 기관의 지침에 따라 수행 하였다. 주의 : 샘플의 RNAse가 오염을 방지의 RNase 오염 방지를위한 기본적인 예방 조치 및 DEPC 처리 된 물을 모든 버퍼를 준비하기 위해. 자당 그라디언트의 1. 준비 <ol><li> (표 1 참조) 17.5, 25.6, 33.8, 41.9 및 50 % 자당 솔루션을 준비합니다. 천천히 polyallomer의 초 원심 분리기 튜브의 바닥에 50 % 자당 용액 2 ㎖를 첨가하여 그래디언트를 준비를 시작. -80 ° C에서 20 분 동안 튜브를 배치하여 레이어를 동결 </li><li> 17.5 %의 자당에 끝나는 사이에 냉동 단계 자당 비율을 감소에서 다음 레이어를 추가합니다. 기본 층의 해동을 방지하기 위해 자당 솔루션을 추가하는 동안 얼음에 구배를 유지합니다. </li><li> 갓 일일 사용하기 전에 자당 기울기를 준비하고 4 ℃에서 보관 AlternativelY는 실험 전날 밤 4 ° C에서 -80 ° C와 해동에서 사전에 상점을 그라디언트를 준비합니다. </li></ol> 2. 조직 준비 (척수 및 / 또는 뇌) <ol><li> 염화나트륨의 자일 라진과 Ketamin의 과다 복용으로 마우스를 마취하고 transcardially 관련된 성적 증명서에 변이를 고정화 200 ㎍ / ㎖의의 CHX를 포함하는 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 20 ㎖로 perfuse. 발가락 핀치에 비 대응하여 적절한 마취를 확인합니다. </li><li> 빠른 속도로 조직을 추출합니다. 두개골 등쪽을 열고 뇌를 추출합니다. 전체 흉추 및 요추 척추의 후궁 절제술을 수행하고 척수의 압축을 풉니 다. 각각 뇌 전체 (~ 400 mg)을 척수 (~ 90 밀리그램)의 4cm 조각을 사용합니다. </li><li> 차가운 얼음 균질화 버퍼에 조직을 전송합니다 (표 1 참조) (: 1 ㎖, 뇌 : 척수 4 ㎖)과 사이클로 헥시 미드의 섭취 증가를 허용하는 깨끗한 메스 작은 조각으로 주사위. PerfoRM 얼음에 모든 추가 단계. </li><li> 15 분 동안 배양한다 기계적 다운스 균질화기를 사용하여 조직을 균질화한다. 조심스럽게 제어 균질화는 핵이 그대로 유지되도록 할 필요가있다. 모든 샘플에게 비교를 보장하는 것과 같은 방식으로 처리합니다. 참고 : 뇌 조직을 위해 : 꽉 조이는와 유 봉, 5 스트로크에 의해 조직을 방해. 척수 조직의 경우 : 꽉 조이는 유 봉 5 더 선 다음에 느슨하게 피팅와 유 봉, 5 스트로크에 의해 방해. </li><li> 분취 (뇌와 척수 200 μL 400 μL), 총 RNA 격리를위한 -80 ° C에서 플래시 동결 및 저장을. </li><li> 4 ℃에서 10 분 동안 500 XG에서 원심 분리하여 핵 및 파쇄되지 않은 세포와 조직의 조각을 제거 저속 원심 분리 리보솜의 손실을 방지 할 수 있습니다. </li><li> NP-40을 첨가하고 나트륨 데 옥시 콜레이트 세제 (1 %의 최종 농도로 각각)로 30 분 동안 핵 상등액 소재를 Lyse 막 단편. </li></ol><ol><li> 이 단계는 달리 polyribosome 프로필에 신호를 마스크합니다 샘플에서 지방 성분을 제거합니다. 첫째, 사전 오한 초 원심 분리기의 버킷 4 ° C에서 회 전자와 2 M, 1.1 M을 준비하고 0.9 M 자당 솔루션 (표 1 참조). </li><li> 2 M의 자당 용액의 1.22 볼륨과 해물을 섞어 폴리에틸렌 초원 심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 1.1 M 자당 용액 10 ㎖의 동일한 볼륨으로 모든 튜브를 채워, 그 후 0.9 M 자당 용액을 조심스럽게 오버레이. </li><li> 미리 냉장 초 원심 분리기의 버킷으로 초원 심 분리기 튜브를 놓습니다. 4 ℃에서 10 만 XG에 3 시간 동안 원심 분리기 지방산 성분이 플로트와 상청액에 남아있는 반면,이 과정에서 펠릿으로 증착 될 리보솜. </li></ol> 4. 자당 기울기 분별 <ol><li> 상층 액을 제거하고 균질화 버퍼 B에 펠렛을 용해 (표 1 참조 </st룽&gt;). Nanodrop 또는 동등한 장치를 이용하여 각 시료에 대한 260 nm에서 흡광도를 측정 해 흡광도 값에 따라로드 양을 정상화. </li><li> 사전 냉장 초 원심 분리기의 버킷으로 (준비는 이전 절에서 설명) 자당의 그라디언트를 놓습니다. 그라데이션의 상단에 신중 층 샘플. 기술 제어와 같은 하나의 빈 자당 기울기를 추가합니다. </li><li> 균질화 버퍼 각 버킷의 무게를 조정합니다. 4 ° C에서 285,000 XG에 1.5 시간 동안 원심 분리기 샘플 </li><li> 원심의 끝 전에 이스 코 분별 30 분 준비를 시작. 분별 기의 또 다른 모델이 사용되는 경우에, 제조자의 프로토콜을 따른다. <ol><li> UV 램프에 대한 적절한 감도를 (뇌 또는 척수 0.05 AUFS 0.2 AUFS) 설정하고 워​​밍업을 위해 전원을 켭니다. 이 튜브의 침을 통해 60 % 자당 용액에 회전 펌프를 통해 연결, 튜브 침을 조립합니다. </li><li> 자당 (흐름 쥐를 펌핑하여 설치를 테스트E : 1 ㎖ / 분), 특히 그라데이션으로 거품을 소개합니다 호스에 누수가 없는지 확인합니다. </li><li> 수동 UV 검출기로 구배 완충액 펌핑 및 기준선 보정 바이 빈 배경 흡수. </li></ol></li><li> 조심스럽게 회에서 침전 샘플 자당 그라디언트를 포함하는 초 원심 분리기의 버킷을 제거하고 얼음에 배치합니다. 해상도의 손실을 방지하기 위해 그라디언트의 범핑을 피하십시오. </li><li> 분별에 실행 그라디언트. 첫 번째 배경 흡수를 평가하고 적절한 기술 설정을 확인하려면 빈 그라데이션을 실행합니다. <ol><li> UV 검출기에 그라데이션을 연결하고 튜브 침과 튜브의 바닥을 관통. 위쪽으로 UV 검출기를 통해 드롭 디스펜서에 침전 샘플 그라데이션을 보이게 할 것인지 60 % 자당의 펌핑을 시작합니다. </li><li> 260 nm에서 흡광도를 sedimenta을 나타내는 피크와, 샘플의 흡수 프로파일을 생성하는 문서화리보솜 소단위, monosomes 및 리보솜의 후속 증가와 연관의 mRNA의 기. </li></ol></li><li> (2 ㎖ 튜브에 600 ㎕의 각) 드롭 디스펜서를 통해 20 분수에 샘플을 수집합니다. </li></ol> 개별 분수에서 5. RNA 격리 <ol><li> 각각의 분획에 1 %의 최종 농도로 10 % SDS를 추가하고 단백질을 전개하고 리보솜을 해리하기 위해 잘 섞는다. 이 시점에서 시료는 -80 ℃에서 냉동 할 수 있습니다 해결되어야 할 질문에 따라 분획 흡광도 프로파일에 따라 풀링 될 수있다. </li><li> 또한 DNA의 오염 성분을 제거 산성 페놀 / 클로로포름 추출과 RNA를 분리합니다. <ol><li> 각각의 샘플 (RT에 데워진) 산성 페놀 / 클로로포름 중 하나 볼륨을 추가, 10 ~ 65 ° C에서 분, 그 후 흄 후드에서 방출 압력 열. </li><li> RT에서 17,000 XG에 20 분 동안 원심 분리기 샘플. 조심스럽게 새로운 1.5 ml로 수상을 전송관. 수성 단계는 원심 분리 한 후 바닥에있을 수 있습니다 밀도 자당 분수, 위상 반전에주의. </li><li> RNA를 침전시키기 위해 한 이소프로판올의 양, 1 / 9 양의 아세트산 나트륨 (pH를 5.2)와 각 샘플 1 μL의 GlycoBlue 추가. -80 ° C에서 샘플을 1 시간 이상 유지 </li><li> 17,000 XG, 4 ℃에서 30 분 동안 원심 분리 GlycoBlue는 펠릿의 시각화를 제공합니다. 뜨는을 제거, 얼음 차가운 80 % 에탄올과 공기 건조 펠릿 한 번 펠렛을 씻으십시오. RNAse가없는 물에 펠렛을 용해. </li></ol></li><li> Nanodrop에 의해 RNA의 양을 정량화하고 Bioanalyzer 칩에 의해 RNA 무결성을 분석 할 수 있습니다. 제시된 프로토콜에 의해 얻어진 RNA는 마이크로 어레이와 깊은 시퀀싱을 포함하여 예술 높은 처리량 분석의 모든 상태에 적합합니다. </li></ol>

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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type-specific+isolation+of+ribosome-associated+mRNA+from+complex+tissues.">Cell-type-specific isolation of ribosome-associated mRNA from complex tissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (33), 13939-13944 (2009).</li><li>Ingolia, N. T., Brar, G. a., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ribosome+profiling+strategy+for+monitoring+translation+in+vivo+by+deep+sequencing+of+ribosome-protected+mRNA+fragments.">The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments.</a> Nature Protocols. 7 (8), 1534-1550 (2012).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

polyribosome 분별이 새로운 기술은 아니지만, 그것은 특히 도전 하나가 남아있다. 입력 재료에 기초하는, 상당한 최적화가 필요할 수있다. 특히 재료의 양이 종종 조직 성분 변환의 mRNA의 분리를 방해 한정 및 지방산이며 생체 CNS 샘플에 대한 경우이다. 대부분의 출판 분별 프로토콜은 효모 또는 포유류 세포 라인을 처리하고, 뇌 12,13,14에 대한 설립 프로토콜이 있습니다. 대조적으로, 척수 분획을 설명하는 모든 출판물 간신히있어, 기존 프로토콜 (15)을 풀링하는 동물의 다수의 척수를 필요로한다. 이러한 이유로, 여러 가지 변형이 필수적인 하나의 마우스 척수 포함한 CNS 조직에 대해 분별 프로토콜을 적응되었다. 사이클로 헥시 미드와 리보솜 고정화는 운영 시간에만 리보솜의 분리를 방지하기 위해 동물 관류하는 동안 수행조직 추출 g의 긴 과정. 그 후, polysom​​al RNA를가 polyribosome 수율을 최대화하기 위해 특정 방식으로 추출된다. 첫째, d​​ouncing하여 조직의 균질화를 제어 그대로 핵을 유지하고 DNA 오염을 방지 할 수 있습니다. 핵은 다음 원심 분리하여 확실하게 제거된다. 세제 NP-40 및 나트륨 데 옥시 콜레이트의 조합은 소포체 막과 연관된 리보솜 동의서의 용해를 보장한다. 또한, 지질이 풍부한 미엘린 내의 UV-흡수 성분은 polyribosome 프로파일을 불명료. 이러한 폴리 리보솜과 같은 조밀 한 화합물 펠렛 등 수초 플로트와 같은 가벼운 화합물 (16)을 제거하는 곳 수초 부상은 필요가있다. 폴리 리보솜은 다음 17.5 % ~ 50 %의 자당 기울기에 침전된다. 대신 수동 각 자당 층 레이어링 및 동결 그라디언트는 그라데이션 혼합기를 사용하여 제조 될 수있다. 산성 페놀 / 클로로포름을 사용하여 분수에서 RNA의 추출 할 수 있습니다 DNA는 최소한의 RNA의 손실을 제거 할 수 있습니다. 그러나, 위상 반전 (일부 16 위) 밀도 자당 분수에서 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 번역의 수준을 해결 기존의 다른 방법에 비해 장점을 제공한다. 예를 들어, 인산화 S6 (눈에 띄는 번역 마커)의 측정뿐만 아니라 방사성 동위 원소와 초기 체인의 라벨 모두 글로벌 번역 수준에 대한 정보를 제공하지만, 구체적으로 번역 된 내용에 조금 알 수있다. Polyribosome 분획 화는 반면에, 평가 해외 번역뿐만 아니라, 변환의 mRNA와 관련된 규제 단백질의 정체성 허용한다. 정량 실시간 PCR은 선택의 mRNA 중 빠른 읽기 격리 된 RNA를 수행 할 수 있으며, 마이크로 어레이 및 차세대 RNA 염기 서열은 게놈 넓은 연구를 수행 할 수 있습니다. 여기에 제시된 최적화 따라서 점감 기술은 CNS 조직의 최소량으로 사용될 수 있도록필요한 동물의 수를 보내고 조직 처리 시간을 감소시킴으로써 전체적인 실험적인 품질을 개선시킨다. 한편,이 기술은 번역하는 것과 실속 리보솜을 구별 할 수 없다. 실속 리보솜을 들고 성적 증명서는 무거운 분수에 침전하고, 데이터를 해석 할 때이 염두에 보관해야합니다. 리보솜은 세포 유형 특정 방식으로 각각 에피토프 태그 또는 기자로 표지 및 면역 (17, 18)에 의해 고립 된 mRNA가 연관되어있는 최근의보고 된 기술, 즉 RiboTaq 함정이있다. 이 기술은 특정 세포 집단에 대한 판독은 고해상도를 제공하는 분획을 polyribosome에 연결될 수있다. 리보솜 발 인쇄가 리보솜에 의해 보호됩니다의 mRNA의 또 다른 소설 작은 조각을 생성하는 핵산 분해 효소의 소화 관련 기술, 또는 &quot;발자국&quot;입니다. 라이브러리는 다음이 발자국의 생성 순서가됩니다. 이 방법의 prov에환산 코돈 고유 전체 게놈 분석 IDES과 실속 리보솜을 식별 할 수있는, 비 8월 코돈과 polyribosome 분획 (19)에 의해 달성 될 수없는 작은 상류 오픈 리딩 프레임을 시작한다. 그러나 polyribosome 분별 따라서 높은 샘플 순도이 종종 요구되는 라이브러리의 제조에 필요한 분자 종 풍요롭게 단일 리보솜을 포함하는 소화 단편의 분리를 위해 리보솜 프로파일에 연결될 수있다. 종합적 polyribosome 분획은 지속 유의성있는 유연한 방법 및 차세대 게놈 시퀀싱 같은 다양한 분석법 등 여러가지 어플리케이션 하류에 연결될 수있다.

유전자 발현은 번역이 가장 주된 효과 1 베어링과, 전사, 번역 및 mRNA와 단백질의 안정성의 결합 작용에 의해 결정된다. 이들 각 단계는 규제가 심한 것이 이제 분명하다. 마이크로 RNA를, RNA 과립, 대체 세포질 폴리아 데 닐화의 형성은 유전자 발현 2,3의 전사 후 조절의 몇 가지 예입니다. 이러한 메커니즘은 각각의 번역에서 전사를 분리됩니다 관심의 생물학적 시스템의 프로테옴에 영향을 미친다. 따라서, 당연히, 홀로 mRNA 수준은 단백질 수준 4의 불완전한 판독한다. 정량 프로테오믹스 그러나 최근의 진보에도 불구하고, 감도 및 단백질 서열 해결에 상당한 제한이 여전히있다, 유전자 발현의 가장 직접적인 평가를 제공합니다. 따라서 translatome 주소, 번역의 mRNA의 레퍼토리는, 공부를 잘 절충을 제공하는사체와 단백체. 그것은 최종 유전자 발현을 평가 transcriptomics보다 더 정확하고, 더 높은 범위와 프로테오믹스보다 시퀀스 해상도를 모두 제공합니다. 포유 동물 시스템에서, 번역 사건의 대다수는 캡 - 의존적 개시를 통해 시작된다. 함께 40S 작은 리보솜 소단위와 진핵 개시 인자의 그룹의 mRNA의 5 &#39;캡에 조립합니다. 단지는 다음의 mRNA를 스캔하고 8월 코돈 시작에 도달하면, 완전한 80S 리보솜 형성하기 위해 60 년대 큰 리보솜 소단위를 모집합니다. 연신 단계는 리보솜 연신율 요인 초기 펩티드 쇄에로드 된 tRNA에서 아미노산의 혼입을 지원하여, mRNA를 따라 이동으로 진행한다. 다중 리보솜 동시에 하나의 mRNA를 따라 진행하고 연관된 리보솜 수가 단백질 합성 5,6의 속도와 상관 관계를 보였다. 이 리보솜 로딩 트란에 대한 신뢰할 수있는 표시를한다slation 적극적으로 침강 속도에 따라 mRNA가 번역을 분리 할 수​​ 있습니다. mRNA를 번역의 정량화 이외에, 시퀀스 정보는 번역 조절에 관여 모티프를 식별하기 위해 얻어 질 수있다. 또한 결합 단백질 및 기타 번역 요인이 관련 규제 단백질의 연구와 발견을 촉진, 다른 분수에서 고립 될 수 RNA. 신경계에서 번역 컨트롤은 mRNA의 저장, 운송 및 지방 단백질 합성 등의 프로세스에 연결되어 있습니다. 성장 콘 축삭 7의 나머지 별개의 mRNA의 특정 지역화 풀 항구 보여왔다. 또, 축삭 단백질 로컬보기 8,9을 합성하는 기능을 갖는다. 그 결과, 번역의 지역 제어는 신경 생물학의 연구의 중요한 화제가되고있다. 이 문제를 해결하기 위해 polyribosome 분획의 전위는 기법을 사용 하였다, 몇몇 연구에 도시 한 내용척수 개발 축삭지도를 조사하고, 뇌의 10, 11에서 BDNF의 활동에 의존 번역을 보여 주었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Hank&#8217;s balanced salts solution</td>
			<td style="width:147px;">Gibco&#160;</td>
			<td style="width:119px;">14170-138</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tube, Thinwall, Polyallomer, 14 mL, 14 x 95mm</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331374</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diethylpyrocarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5758</td>
			<td>caution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7698</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>43815</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93482</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNasin Plus RNase Inhibitor</td>
			<td>Promega</td>
			<td>N2611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nonidet P-40</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11332473001</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D6750</td>
			<td>warning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9722</td>
			<td>danger</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlycoBlue</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Equipment</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dounce Tissue Grinder, 1mL/7ml</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>357538/357542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW 40 Ti Rotor, Swinging Bucket, Titanium, 6 x 14 mL, 40,000 rpm, 285,000 x&#160;g</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>331302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Density Gradient Fractionator</td>
			<td>Teledyne Isco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:147px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo interrogation of central nervous system translatome by polyribosome fractionation

여러 프로세스의 mRNA와 단백질의 전사, 번역 및 안정성 등의 유전자 발현에 참여하고 있습니다. 각 단계가 밀접하게 단백질 풍요의 최종 역학에 영향을 미치는 규제하고 있습니다. 각종 규제 메커니즘 단독 유전자 발현의 불안정한 표시기 mRNA 수준 렌더링, 변환 단계에서 존재한다. 또한, mRNA의 번역의 지역 규제는 특히 신경 생물학에 관심의 초점을 &#39;translatomics&#39;을 이동, 신경 세포의 기능에 연루되어있다. 제시된 방법은 다리의 transcriptomics 및 프로테오믹스에 사용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 여러 리보솜에 적극적으로 번역의 mRNA 협회 및 자당 기울기에서의 차등 침강에 따라 translatome를 심문 polyribosome 분별의 기술에 필수적인 수정을 설명합니다. 전통적으로, 특히 센트라의 생체 샘플 작업L 신경계 (CNS)에 의한 재료의 제한된 양의 지방 조직과 성분의 존재에 도전 입증되었다. 하나의 마우스 척수 및 뇌의 사용에 의해 설명되는 것과 같이이 문제를 해결하기 위해, 설명 된 프로토콜은 특별히 CNS 재료의 최소한의 사용하기 위해 최적화된다. 간단히, CNS 조직 추출하고 변환하는 리보솜은 사이클로 헥시 미드와의 mRNA에 고정되어있다. 수초 부상은 다음 지질이 풍부한 구성 요소를 제거하기 위해 수행된다. 분별은의 mRNA가 자신의 리보솜의 상태에 따라 분리 된 자당 기울기에서 수행됩니다. 고립 된 분수는 새로운 게놈 넓은 분석 기술을 포함하여 다운 스트림 분석의 범위에 적합하다.

그림 2는 분류 후 대표 polyribosome 프로필을 보여줍니다. 세포 라인에 대해 전술 한 바와 같이 뇌와 척수의 프로파일 특성 흡수 곡선을 보여줍니다. 작은 리보솜 아 단위 (40S) 가벼운 분수에서 침전물과 바인딩의 mRNA는 큰 리보솜 아 단위 (60S)와 monosome (80S) 바인딩의 mRNA 다음 프로필의 피크로 먼저 나타납니다. 여러 리보솜에 바인딩의 mRNA는 나중에 피크가 결합 된 리보솜의 증가를 표시와 함께, 무거운 분수에 침전. 글로벌 번역은 프로필에서 평가 될 수있다. 예를 들어, 뇌 조직은보다 적극적인 번역을 표시, 척수 조직보다 비율을 monosome하는 높은 polyribosome 있습니다. 개별 분수에서 추출한 RNA는 18S와 28S rRNA의 분포를 보여주는 Bioanalyzer에 의해 평가되었다. 18S rRNA의 작은 리보솜 소단위 라이터 sucr에 침전에 따라, 프로필 이전에 나타납니다<html> OSE의 분수. 총 RNA의 일반적인 수익률은 뇌와 척수 2-4 μg 10-20 μg이다. 개별 분수에서 RNA 수익률은 비율에 따라 각각 4 μg과 뇌와 척수 0.8 μg까지입니다. 빈 자당 기울기는 이미 인해 DTT의 존재로, 260 nm에서 몇 가지 배경의 흡수를 보여줍니다. 이 배경 샘플 값을 정규화하기 위해 데이터 분석에서 차감 될 수있다. EDTA 치료는 침 프로필 번역에 의한 것입니다 보여 polyribosome 피크를 축소. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1. 워크 플로 및 생체 polyribosome 분별의 잠재적 인 응용 프로그램.&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51255/51255fig2.jpg" /> 빈 그라데이션과 뇌의 바깥쪽으로 그림 2. (A) 뇌와 Bioanalyzer에 의해 추출 된 RNA의 평가와 척수의 일반적인 polyribosome 프로필. (B) QRT-PCR에 의한 분수에 GAPDH mRNA의 분포. (C) Polyribosome 프로필 EDTA 처리. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51255/51255fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> 1.1 </td><td> 배 그라데이션 버퍼 </td><td> 30 mM 트리스-HCl을 pH 7.4로, 30 mM의 MgCl2를 2, 600 mM의 NaCl을, 200 ㎍ / ㎖의 사이클로 헥시 미드 (CHX), 2mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT) </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> 자당 솔루션 17.5 % </td><td> 8.67 g 자당, 그라데이션 버퍼 배 25 ㎖, 최대 50 ML DEPC의 H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> 자당 솔루션 25.6 % </td><td> 12.8 g 자당, 그라데이션 버퍼 배 25 ㎖, 최대 50 ML DEPC의 H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> 자당 솔루션 33.8 % </td><td> 16.9 g 자당, 그라데이션 버퍼 배 25 ㎖, 최대 50 ML DEPC의 H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> 자당 솔루션 41.9 % </td><td> 20.95 g 자당, 그라데이션 버퍼 배 25 ㎖, 최대 50 ML DEPC의 H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 1.1 </td><td> 자당 솔루션 50 % </td><td> 25g의 자당, 그라데이션 버퍼 배 25 ㎖, 최대 50 ML DEPC의 H 2 0 </td><td></td></tr><tr><td> 2.3 </td><td> 균질화버퍼 </td><td> 0.25 M 크로스, 50 mM 트리스 / 염산, pH 7.4로), 5 mM의 MgCl2를, 25 mM의 KCl을 </td><td> 200 ㎍ / ㎖의의 CHX, 1X 로슈 완전한 단백질 분해 효소 억제제, 1 mM의 DTT, 1mM의 phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF), 100 U / ㎖ RNAsin </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 2M 자당 용액 </td><td> 68.4 % 수 크로스, 50 mM 트리스 - 염산, pH 7.4로, 5 mM의 MgCl2를, 25 mM의 KCl을 </td><td> 100 ㎍ / ㎖의의 CHX, 1X 로슈 완전한 단백질 분해 효소 억제제, 1 mM의 DTT, 1 ㎜의 PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 1.1M 자당 솔루션 </td><td> 38.5 % 수 크로스, 50 mM 트리스 - 염산, pH 7.4로, 5 mM의 MgCl2를, 25 mM의 KCl을 </td><td> 100 ㎍ / ㎖의의 CHX, 1X 로슈 완전한 단백질 분해 효소 억제제, 1 mM의 DTT, 1 ㎜의 PMSF </td></tr><tr><td> 3.1 </td><td> 0.9M 자당 솔루션 </td><td> 30.8 % 수 크로스, 50 mM 트리스 - 염산, pH 7.4로, 5 mM의 MgCl2를, 25 mM의 KCl을 </td><td> 100 ㎍ / ㎖의의 CHX, 1X 로슈 완전한 단백질 분해 효소 억제제, 1 mM의 DTT, 1 ㎜의 PMSF </td></tr><tr><td> 4.1 </td><td> 시간omogenization B 버퍼 </td><td> 0.25 M 슈 크로스, 50 mM 트리스 / 염산, pH 7.4로, 5 mM의 MgCl2를, 25MM의 KCl, 1 % NP-40, 1 % 나트륨 데 옥시 콜레이트 </td><td> 200 ㎍ / ㎖의의 CHX, 1X 로슈 완전한 단백질 분해 효소 억제제를 1mM DTT, 1mM의 PMSF, 100 U / ㎖ RNAsin </td></tr></tbody></table> 버퍼 및 솔루션의 표 1. 목록.

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In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

이 프로토콜은 생체 CNS 샘플의 translatome을 연구하기 위해 polyribosome 분별의 필수 수정 사항을 보여줍니다. 그것은 분리와 결합 RNA의 분수를 리보솜에 총 RNA의 비교를 통해 번역 및 전사 조절의 종합 평가를 할 수 있습니다.

Polyribosome 분별에 의한 중추 신경계 Translatome의 생체 심문

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

in-vivo-interrogation-central-nervous-system-translatome-polyribosome

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

12.2K 조회수.  German Cancer Research Center (DKFZ).  이 프로토콜은 생체 CNS 샘플의 translatome을 연구하기 위해 polyribosome 분별의 필수 수정 사항을 보여줍니다. 그것은 분리와 결합 RNA의 분수를 리보솜에 총 RNA의 비교를 통해 번역 및 전사 조절의 종합 평가를 할 수 있습니다. 