Siamo grati al Dr. Xiaolian Gao, Università di Houston, per fornire consulenza alla piattaforma microarray LC Scienze miRNA, il dottor Karin Edvardsson, Karolinska Institute, in Svezia, e il dottor Eylem Aydogdu, Università di Houston, per condividere la loro esperienza miRNA . Ricerca riportata in questa pubblicazione è stato sostenuto dal National Cancer Institute dei National Institutes of Health nel quadro Premio Numero R01CA172437. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Questo lavoro è stato supportato anche da sovvenzioni dal Texas Emerging Technology Fund, ai sensi dell&#39;accordo di no. 300-9-1958.

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Determinazione del meccanismo di regolazione ormonale del miRNA in cellule di cancro al seno in grado di fornire una piattaforma per la comprensione di questa malattia e può fornire un potenziale trattamento per il cancro al seno. Coltura di tali cellule per fornire la condizione ottimale per l&#39;azione ormonale è molto importante. Qui, un protocollo che garantisce che l&#39;ormone di interesse (estrogeni) è stata esclusa prima del trattamento e che la dose ottimale di E2 è stato utilizzato per un tempo adeguato durante il trattamento è stato descritto. Altri effetti dei fattori ormonali e di crescita sono stati mantenuti al minimo riducendo gradualmente i livelli sierici e utilizzando DCC-FBS, che è FBS che sono stati privati ​​della maggior parte del suo ormone, citochine e fattori di crescita. Fenolo mezzi privi di rosso è stato ulteriormente utilizzato per ridurre altri effetti non ormonali, dato che il fenolo rosso è stato segnalato per avere attività estrogenica e influenzare alcune funzioni in linee cellulari 20,21. Il tempo di esposizione delle cellule alla ormone è di grande importanza. Per la regolazione degli estrogeni associati dei geni, è stato precedentemente dimostrato che 24-hrexposure produrre risposta significativa di geni bersaglio diretti in cellule di carcinoma mammario 1,18. Poiché miRNA sono trascritti dalla RNA polimerasi II, come mRNA, è ipotizzabile che questo è un punto di tempo idoneo a rilevare regolamentazione diretta anche dei miRNA. E &#39;ancora da definire se e come questi miRNA influenzano l&#39;espressione di questi obiettivi ER noti in cellule di carcinoma mammario. miRNA profili di espressione può essere difficile a causa della piccola dimensione relativa del miRNA, il fatto che la sequenza matura miRNA possono essere trovate anche nella pri-miRNA e pre-miRNA, ea causa della eterogeneità nel loro contenuto GC 22. Diverse tecniche di profilazione e chimiche sono state impiegate per superare questa difficoltà. Tra questi sono diversi approcci di microarray e analisi qPCR (Figura 2). Anche se microarray è ampiamente accettato per intero anale genomalisi, può fornire falsi negativi e sono presenti differenze tra le piattaforme disponibili, che vanno dalla chimica alla tecnologia di stampa 23. Anche il processo di normalizzazione rappresenta una sfida quando si analizzano i relativamente pochi geni miRNA, che si contano in migliaia, rispetto alle decine di migliaia di trascritti di mRNA. qPCR, d&#39;altra parte, è più sensibile, ed è meglio applicato quando meno geni sono da considerare. Tuttavia, quando eseguito in piastre da 384 pozzetti grandi, con solo un replicato tecnica per piastra, piastre multiple devono essere analizzati per ciascun campione che rende l&#39;analisi costosa. Inoltre, nelle nostre mani, molti più risultati falsi negativi sono stati ottenuti usando l&#39;analisi DLP-LDA rispetto al microarray. Dato che la sequenza matura miRNA è presente nel pri-miRNA e le sequenze pre-miRNA, è di interesse per distinguere tra queste trascrizioni utilizzando tecniche di PCR 24. Sonde DLP sono anche disponibili per il pre-miRNA, e spprimer ecific possono anche essere progettati per escludere diverso maturi o precursore varianti usando Cyanine colorante tecnologia qPCR. qPCR è uno standard d&#39;oro per la convalida di espressione differenziale di profilazione risultati. L&#39;efficacia del qPCR, tuttavia, dipende da vari parametri tra cui l&#39;estrazione di RNA, integrità dell&#39;RNA (qualità), sintesi di cDNA, progettazione di primer, metodo di rilevamento (chimica), e il gene di riferimento per la normalizzazione dei dati 1,22,25. Le opzioni per la progettazione di primer per l&#39;analisi dei miRNA è molto limitata, dal momento che a breve miRNA lunghezza della sequenza non dà spazio a molto il design fondo alternativo, e solo un innesco possono essere nutrito in questa breve sequenza. Di qui, la necessità di manipolazioni alternativi come illustrato nella Figura 2. Replicati tecnici sono importanti per convalidare robustezza del metodo di amplificazione e il procedimento usato. Repliche biologiche sono necessari per una rappresentazione della variatio biologico generalen, compresa la risposta variabile al ligando del trattamento, e per dimostrare che gli effetti osservati in una cella sono riproducibili. Sulla base della nostra esperienza, possono verificarsi variazioni di espressione di miRNA tra colture cellulari. Solitamente queste differenze sono meno di 1,3 volte, e la media dei valori e corrispondenti SD identifica la variazione naturale e tecnologico. Questa variazione potrebbe derivare da vari fattori tra cui, densità cellulare e il fatto che le funzioni cellulari possono cambiare da passaggio per passaggio. Per identificare statisticamente significative espressioni derivanti dal trattamento ligando, un significato largamente accettata è quando il p-value è inferiore a 0.05. Qui, sono state utilizzate t-test di uno studente sulle replicati biologici e tecnici che utilizzano il due campioni parametri di varianza disuguale distribuzione a due code e. Esistono altri parametri t-test, e la scelta dipende dal setup sperimentale 26. Un protocollo dettagliato per valutare regolamenti ormonali maturo miRNA in cellule di cancro al seno è stato fornito. Importanti tecnologie e la chimica di profiling e la convalida di questi miRNA espressioni sono stati chiaramente spiegati. La tecnologia scelta per gli studi di miRNA in cellule di cancro al seno dipende in ultima analisi su ciò che esattamente è indagato.

L&#39;estrogeno è un ormone che è importante durante lo sviluppo della ghiandola mammaria. Gli estrogeni svolge anche un ruolo importante per lo sviluppo, la manutenzione, il rischio, e il trattamento del cancro al seno 1. Estrogeni esercita la sua funzione legandosi a ER, che sono fattori di trascrizione e regolano specifici geni bersaglio. Dei due varianti del recettore, ERa è essenziale per la proliferazione estrogeno-dipendente delle cellule di cancro al seno. La maggior parte dei tumori al seno sono ERa-positivi e dipende estrogeni per la crescita. Ciò ha reso segnalazione estrogeni e ERa un obiettivo per il trattamento di ormone-recettore cancro al seno positivo. Comprendere il meccanismo alla base della ERa è importante per migliorare i risultati del trattamento, superare la resistenza al trattamento, e capire come si sviluppa il cancro al seno. microRNA svolgono un ruolo critico in funzioni cellulari a causa del loro forte impatto nella regolazione genica post-trascrizionale. miRNA sono 19-24 nucleotidi a breve, a singolo filamento, RNA non codificanti che vengono prima trascritti dalla RNA polimerasi II in primarie trascrizioni miRNA (pri-miRNA). Essi sono trattati nel nucleo da Drosha in precursori-miRNA breve tornante (pre-miRNA) e poi elaborati dal Dicer e separati in singoli filamenti per formare miRNA maturi nel citoplasma. I miRNA maturi singolo filamento vengono trasferiti alle proteine ​​Argonaute per formare complessi RISC. Poi, i miRNA possono ibridare alle regioni 3 &#39;non tradotte (3&#39;-UTR) di un mRNA bersaglio, portando a regolazione post-trascrizionale bloccando traduzione o degradare l&#39;mRNA bersaglio 2. A causa del ruolo importante che sia gli estrogeni e miRNA svolgono nella progressione del tumore, individuando miRNA associati alla segnalazione normale o interrotto estrogeni è importante al fine di migliorare la nostra comprensione dello sviluppo e migliorare il trattamento del cancro al seno. Mentre vi è una buona comprensione di come ERa regola geni codificanti proteine, l&#39;estensionee dettagli di RNA non codificanti normativa deve ancora essere approfonditi. Gli studi iniziali volti a chiarire regolamentazione ERa di miRNA in linee cellulari di cancro al seno hanno dato risultati contrastanti, anche quando la stessa linea cellulare è stata analizzata 3-6. Questo può essere il risultato di trattamenti diversi, variazioni biologiche, l&#39;uso di tecniche diverse, e il fatto che le piccole dimensioni dei miRNA li rendono difficili da analizzare. Qui, un protocollo che controlla le variazioni e manufatti metodo è descritto. Per identificare quale miRNA sono regolati dagli estrogeni, profilatura di un modello di cancro al seno ben definito di attività ERa è un primo passo. Diverse linee cellulari sono stati generati da cancro al seno tumori umani ERa-positivo, che dipendono dagli estrogeni simile alla maggior parte dei tumori al seno clinici. Le proprietà molecolari di due di queste linee cellulari, T47D e MCF7, compresa la formulazione di ERa e il suo obiettivo finale,il recettore dell&#39;ormone progesterone (PR), una mancanza di espressione di recettori di membrana HER2, insieme con l&#39;espressione di geni di differenziazione estrogeno-sensibili e luminali-epiteliale, li rendono adatti come modelli per il sottotipo luminale dei tumori al seno 7-10. 17β-estradiolo (E2) è la forma dominante di estrogeni, e le concentrazioni e tempo-punti per l&#39;attivazione trascrizionale ottimale di ERa sono stati caratterizzati in studi multipli. In questo protocollo di trattamento 10 nM E2 per 24 ore viene utilizzato e T47D e MCF7 come modelli per l&#39;attività ERa in cellule di cancro al seno 1. Inoltre, regolamenti miRNA dipendenti dal tempo possono essere specificamente analizzati in un intervallo di tempo di esempio 1-72 ore. In secondo luogo, analizzando miRNA ha sfide separati, in parte a causa delle loro dimensioni brevi. miRNA non sono ben conservati nella preparazione di RNA totale quando vengono eseguite regolarmente Guanidinium thiocyanate-phenol/chloroform/isopropanol precipitazioni RNA, o quando stsono utilizzati purificazioni colonna Andard. Speciali precauzioni devono essere prese per mantenere o arricchire la frazione più piccola di RNA. Aumentando il volume di isopropanolo, abbassando la temperatura prima centrifugazione (-80 ° C), e omettendo il lavaggio in etanolo al 70%, il mantenimento di miRNA può essere migliorata durante la precipitazione. Oppure, possono essere usate colonne e tamponi specifici per una elevata qualità e robusta preparazione di RNA totale-miRNA contenente. Anche l&#39;analisi stessa, loro brevi dimensioni creano sfide. Per lo screening miRNA genome-wide, ci sono tre miRNA comuni tecniche da scegliere profilazione: microarrays, qPCR, e sequenziamento di prossima generazione. Ogni tecnica può essere eseguita utilizzando più piattaforme diverse, e sono necessarie diverse preparazioni del campione, ognuno con differenti rischi di introdurre artefatti. In miRNA microarray, una diapositiva è macchiato o sintetizzato con migliaia di oligonucleotidi. Questi oligonucleotidi sono utilizzati come sonde, e ciascuno della sondas è progettato per ibridare ad una particolare sequenza miRNA. La preparazione del campione per microarray, interpretato in questo studio, primo arricchisce di miRNA e poi introduce l&#39;etichettatura Cy5 e Cy3 sui miRNA. Microarray dà la possibilità di osservare i livelli di espressione relativi di un gran numero di geni contemporaneamente, è veloce e adatto per lo screening di un gran numero di campioni, ma può analizzare solo le sequenze presenti sul microarray e verrà non es rilevare variazioni di sconosciuto o mutato miRNA. Analisi Microarray interpretato in questo protocollo richiede anche relativamente grandi quantità, circa 5 mcg, di RNA totale per campione per l&#39;analisi. Bassa densità qPCR miRNA profiling richiede meno materiale (700 ng / campione e replicare), e consente l&#39;individuazione e la quantificazione dei miRNA. Livelli di trascrizione possono essere determinati, e la quantità può essere un valore assoluto o relativo importo. analisi qPCR richiede prima conversione di miRNA in cDNA, qui usando un loopPrimer per ogni specifico miRNA assicurando che l&#39;analisi di un solo maturare miRNA. Questo genera un modello più che può essere amplificato utilizzando un primer forward specifici miRNA e un primer reverse universale complementare alla sequenza di loop, e può porto l&#39;inclusione di una sonda a doppio etichetta per specificità. qPCR può essere utilizzato in un formato a bassa densità dove centinaia di miRNA possono essere rilevati in parallelo utilizzando uno o più piastre a 384 pozzetti con singole coppie di primer in ciascun pozzetto 11. Sequenziamento di prossima generazione, d&#39;altra parte, è l&#39;unica di queste tecniche che consente la rivelazione di romanzo, miRNA mutati o modificati, come tutti gli RNA in un campione possono essere sequenziati 11. Questa tecnica, tuttavia, richiede più passaggi per arricchire piccoli RNA e produrre una piccola libreria di RNA utilizzando diversi passaggi di legature linker e purificazioni con conseguenti rischi migliorate di modulare i livelli di espressione relativi tra i campioni. Si richiede inoltre bioinformati significativianalisi cs. Date le varie tecniche di profiling miRNA, la tecnica più appropriata dipende dalle applicazioni. Microarray sono più adatte quando il materiale è relativamente abbondante e l&#39;interesse è quello di definire espressione differenziale dei miRNA già noti. Bassa densità qPCR array sono più adatto per una quantità limitata di campione è disponibile è richiesta una elevata sensibilità di miRNA low-espressi. Sequencing è più adatto quando è richiesta l&#39;analisi dei miRNA sconosciuti, mutati o diverse isoforme di miRNA. Nello studio dei miRNA regolati dagli estrogeni nel tumore della mammella, vengono utilizzate due linee cellulari modello, T47D e MCF7, dove sono facilmente disponibili grandi quantità di RNA. Ogni linea cellulare è stata analizzata in colture cellulari replicate utilizzando diversi passaggi, ognuno in replicati tecniche di trattamento. Questo permette robusto individuazione di riproducibile, miRNA ERa regolamentate. Relativi livelli di espressione di miRNA sono stati confrontati utilizzando sia miRNA microarray eSonde doppie etichettato - array a bassa densità (DLP-LDA) e convalidati i risultati con specifiche qPCR utilizzando sia colorante Cyanine e chimiche DLP. regolamenti miRNA sono stati poi analizzati ulteriormente nella serie temporali per definire la loro regolazione esatta nel tempo, che può aiutare a differenziare le variazioni casuali o circadiani da regolamenti estrogeno-indotta, e indicano effetti primari di effetti secondari. Confronti Bioinformatical con studi cromatina vincolante di ERa possono ulteriori aiuti nella differenziazione di primaria rispetto agli effetti secondari. Il test ha comportato una valutazione affidabile della normativa miRNA dove potrebbe essere stabilito che dopo 24 ore di trattamento E2 trascritti codificanti proteine ​​sono state prontamente regolati ma miRNA maturi non sono stati influenzati 1. Tuttavia, è possibile che miRNAs sono regolate a successivi punti temporali, come dimostrato nell&#39;analisi di serie temporali di miRNA selezionati 1. I dettagli devono essere ulteriormente esplorato e il protocollo presentato qui offre un robust modo per studiare regolazione ormonale dei miRNA maturi in linee cellulari di cancro al seno.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1277">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">DMEM</td>
			<td style="width:364px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:399px;">11885092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11765054</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0926-500ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">phenol red-free DMEM&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11054020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultrapure Water</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Specific equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DCC-FBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F6765-500ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100X L-glutamine</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25030081</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS tablet</td>
			<td>Medicago, Accurate chemicals</td>
			<td>Accurate (BF092051-100), Medicago (09-9400-100)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">17&#946;-estradiol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E2758</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ICI 182,780&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I4409</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E7023-600ML</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T47D or MCF7 cells lines</td>
			<td>American Type Culture Collection (ATCC)</td>
			<td>T47D (ATCC HTB-133) and MCF7 (ATCC HTB-22)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 flask&#160;</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>BD353136 (vented cap)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300062</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Serological pipet</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>53300. For 5mL (53300-421)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Cell Counting chamber</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10228</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Countess Automated Cell Counter</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C10227</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100 mm plates&#160;</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>25382-166</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidinium thiocyanate-Phenol solution (TRizol)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15596026</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rubber cell scraper&#160;</td>
			<td>VWR International LLC</td>
			<td>82050-470</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanidinium thiocyanate-Phenol-Chloroform method (miRNeasy Mini Kit/Trizol)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>217004</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rnase-Free DNase I&#160; kit (DNA degradation)</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNase-free water (Nuclease-free water)</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>SH30538.02</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nanodrop 1000 Spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermoscientific</td>
			<td>ND-1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent RNA 6000 Nano Assay kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1512</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2938C and for software (G2946)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">All primers (except TaqMan primers)</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>Specific per order for each gene/miRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">First strand buffer, DTT, dNTPs, superscript III (Superscript III cDNA synthesis kit)&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>18080085</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroAmp Fast 96-Well reaction plate&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4346906</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fast Optical Adhesive Covers</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4311971</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2X SYBR green PCR master mix (Cyanine dye)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4385612</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7500 Fast Real-Time PCR System and software</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4351106</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#956;Paraflo Microfluidic Biochip Technology&#160;</td>
			<td>LCSciences</td>
			<td>MRA-1001 and AS-2001(for result analysis)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DLP-LDA (TLDA) Megaplex Pools Assay (Rt primers/Human pool set)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4400928</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual Labeled Probes (TaqMan) miRNA RT kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4366596</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GeneAmp PCR System 9700 thermocycler</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4310899</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dual Labeled Probes (TaqMan) 2X Universal PCR Master Mix-No AmpErase UNG</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4324018</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4329001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SDS and RQ manager softwares</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4444202</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NCode miRNA First-Strand cDNA Synthesis and qRT-PCR Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MIRC-50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10X DPL (TaqMan) RT primers</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Specific for each miRNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">20X DPL (TaqMan) real-time assay primer&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Specific for each miRNA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

profiling of estrogen-regulated micrornas in breast cancer cells

Gli estrogeni svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo della ghiandola mammaria e la progressione del cancro al seno. Esso media la sua funzione legandosi e attivando i recettori degli estrogeni (ER), ERa e ERp. ERa è frequentemente iperespresso nel cancro al seno e spinge la proliferazione delle cellule del cancro al seno. I requisiti essenziali funzionano come fattori di trascrizione e di regolare l&#39;espressione genica. Considerando che la regolamentazione di ERa di geni codificanti proteine ​​è ben definito, la sua regolamentazione di non codificanti microRNA (miRNA) è meno esplorati. microRNA svolgono un ruolo importante nella regolazione post-trascrizionale di geni, inibendo la loro traduzione o degradante loro mRNA. miRNA possono funzionare come oncogeni o soppressori tumorali e sono anche promettenti biomarcatori. Tra i saggi miRNA disponibili, microarray e real-time PCR quantitativa (qPCR) sono stati ampiamente utilizzati per rilevare e quantificare i livelli di miRNA. Per identificare miRNA regolati dalla segnalazione estrogeni nel cancro al seno, thEIR espressione in linee cellulari di cancro al seno ERa-positivi sono stati confrontati prima e dopo gli estrogeni attivazione utilizzando sia i microarrays μParaflo-microfluidica e doppia etichetta Sonde-bassa densità array. I risultati sono stati convalidati usando specifici saggi qPCR, applicando sia Cyanine dye-based e doppia etichetta chimica a base di sonde. Inoltre, un saggio time-point è stato usato per identificare le normative nel tempo. I vantaggi dell&#39;approccio test miRNA utilizzato in questo studio è che permette uno screening veloce di regolamenti maturo miRNA in numerosi campioni, anche con quantità di campione limitato. Il layout, comprese le condizioni specifiche per coltura cellulare e trattamento con estrogeni, repliche biologiche e tecniche, e lo screening su larga scala seguita da conferme di approfondimento utilizzando tecniche distinte, assicura un rilevamento affidabile di regolamenti miRNA, ed elimina i falsi positivi e altri manufatti. Tuttavia, miRNA mutati o sconosciute, o regolamenti a leve trascritto primario e precursorel, non sarà rilevato. Il metodo qui presentato costituisce un esame approfondito della regolamentazione miRNA estrogeno-mediata.

Una panoramica dell&#39;approccio è presentata nella Figura 1 e un confronto tra i vari campioni preparati e modifiche di acido nucleico richieste per ogni tecnica viene visualizzato in Figura 2. La condizione e l&#39;ambiente delle cellule prima del trattamento con un ormone è importante per determinare gli effetti reali dell&#39;ormone 16. Alcuni medio e siero contengono fattori di crescita che possono influenzare i risultati, così cellule sono affamate di siero per garantire che tutti gli effetti ormonali sono stati ridotti al minimo. Pertanto, quando il trattamento con E2, c&#39;è più certezza che gli effetti osservati sono E2-associati. Un fattore importante è la confluenza di cellule, che influenza contatto e comportamenti come segnale e la proliferazione cellula-cellula cellula-cellula. Le cellule sono stati autorizzati a essere 80% confluenti (Figura 3A) e ben collegata a consentire la crescita ed evitare la perdita di cellule durante il successivo lavaggio e supporti change. Le condizioni durante l&#39;estrazione dell&#39;RNA e stoccaggio sono importanti per la qualità del RNA e successiva analisi. È anche noto che il numero di cellule, il metodo di estrazione, e il contenuto di GC del miRNA possono influenzare la resa e la qualità di mRNA e miRNA 17. Pertanto, è necessario effettuare l&#39;estrazione di RNA in condizioni RNase-free e controlla la qualità dell&#39;RNA prima di procedere con esperimenti. Dopo l&#39;estrazione, la quantificazione del RNA fornisce informazioni sulla concentrazione dell&#39;RNA totale (contenente sia mRNA e miRNA), che permette l&#39;osservazione dei rendimenti. Esso fornisce anche una rappresentazione grafica dei risultati come mostrato nella figura 3B, e questo permette l&#39;osservazione della purezza del campione (tipicamente indicato con un picco, pannello superiore). Scarso rendimento di RNA produrrebbe alcun assorbimento specifico a 260 nm (figura 3B, pannello inferiore). Per determinare se l&#39;RNA è di alta qualità, RNAintegrità è stata misurata. Un numero integrità dell&#39;RNA (RIN) compresa tra 9-10 assicura che l&#39;RNA non è degradato ed è di ottima qualità. Inoltre, la rappresentazione grafica del RNA deve essere osservato, e il 18S e 28S rRNA dovrebbe avere picchi come mostrato nella Figura 4 (pannello centrale). Il confronto con la scala (figura 4, pannello superiore) identifica la dimensione dei picchi. Un RNA degradato avrebbe picchi meno chiare e una quantità relativamente ridotta del 18S e 28S rRNA (figura 4, pannello inferiore). La frazione di piccoli RNA può essere ulteriormente garantita utilizzando il Kit Agilent Small RNA. Si raccomanda di convalidare risposta estrogeni dopo il trattamento, nelle condizioni sperimentali specificate, prima di procedere allo screening miRNA. Un qPCR può essere eseguita su un noto ER gene bersaglio come PS2 o SPINK4 18, utilizzando cDNA. Tali geni sono di solito sovraregolati entro 1-24 ore dopo il trattamento E2. Una volta che la qualità dell&#39;RNA e la risposta estrogeniè stato valutato, ulteriore esperimento può essere condotto. Microarray è ancora una tecnica largamente usata per lo screening su larga scala per miRNA nelle cellule. Ad esempio, il microarray miRNA, una volta utilizzato conteneva 894 miRNA maturi e 50 controlli sonde uniche in quartine 1. Ibridazioni sono state eseguite in duplicato con procedura di scambio colorante. I risultati microarray miRNA sono generalmente rappresentati graficamente con mappe di calore. Figura 5A mostra una mappa di calore, che rappresenta i dati da un confronto microarray miRNA tra il veicolo e E2 campioni trattati. Il rosso indica che il miRNA è upregulated nel campione E2-trattato (espressione superiore), mentre il verde indicato downregulation del miRNA (espressione inferiore). La selezione miRNA di solito dipende dalla loro importanza nella espressione, e di solito un p-value inferiore a 0.05 è considerato significativo. I miRNA che sono indicate per essere espresso in modo differenziale dovrebbero essere ulteriormente validati wesimo qPCR, per distinguerli dai falsi positivi. La matrice DLP-LDA, invece, utilizza un metodo basato qPCR per schermare per miRNA regolamentati in un formato 384 pozzetti. Di solito due piastre da 384 pozzetti (carte) sono forniti, piscine A e B. Girone A di solito contiene meglio caratterizzati e più altamente espresso miRNA rispetto alla piscina B. Il livello relativo di ciascun miRNA sono determinati da qPCR, dove si miRNA viene analizzato per pozzo (Figura 5B). Una maggiore Ct-valore indica l&#39;espressione dei miRNA minore. Molto simile al microarray miRNA, i risultati raggiunti dal DLP-LDA devono essere ulteriormente convalidato per garantire l&#39;accuratezza. Convalide possono essere eseguite utilizzando qPCR. Qui, due metodi di rilevazione qPCR sono descritti per prevenire metodo pregiudizi e per consentire la conferma completa e indagine dei regolamenti miRNA. La chimica di rilevamento Cyanine dye fabbrica diversa da DLP che il profiling DLP-LDA si basa su, ed è adatto per confermafini di cooperazione. Può essere meno specifici come rileva tutto il DNA a doppio filamento amplificato, ma l&#39;omogeneità del campione può essere valutata mediante un&#39;analisi fusione curva. Figura 6A (pannello di sinistra) mostra l&#39;analisi di fusione curva di un miRNA, e picco uniforme chiaramente definito può essere visto. Picchi multipli sarebbero stati rispettati se il primer è importi non specifici o significative di primer-dimero si forma (figura 6A, pannello di destra). Saggi DLP miRNA invece, è più specifico come solo l&#39;amplificazione del bersaglio viene rilevato miRNA. Trame di amplificazione di ogni target di miRNA possono essere osservate, come esemplificato nella figura 6B. La possibilità di controllare il verificarsi di molteplici prodotti di amplificazione usando l&#39;analisi della curva di fusione è, tuttavia, non disponibile con questa chimica e Cyanine colorante qPCR è meno costoso. Cyanine tintura e DLP qPCR saggi possono a volte generare risultati leggermente diversi. Per entrambi i saggi qPCR, rispetto ad un refegene renza è necessaria per determinare l&#39;espressione di geni tra due campioni. Il gene di riferimento, indicato anche come gene housekeeping, dovrebbe essere un gene la cui espressione non è cambiata e che è espressa a livelli simili a quelli del gene di interesse. Un esempio di un gene di riferimento adatto in queste linee cellulari di cancro al seno è ARHGDIA, un PIL Rho-Dissociazione Inhibitor che funziona reazioni di scambio GDP / GTP delle proteine ​​Rho. Come osservato nella Figura 6C (alto), il livello di mRNA ARHGDIA non viene modificato tra il veicolo ed i campioni trattati con ligando. Il 18S rRNA può anche essere utilizzato, anche se la sua alta espressione richiede una diluizione 1:500 separata del cDNA magazzino ed è pertanto meno opportuno. Per l&#39;analisi miRNA, c&#39;è ancora una discussione su un gene di riferimento ben definita. Finora, l&#39;U6 snRNA è un gene di riferimento che è ampiamente accettato per l&#39;analisi miRNA. U6 snRNA è il ~ lungo 110 nucleotidi, codificante piccolo RNA nucleare che funzionano in nucleare pre-mRNA splglassa 19. Come osservato nella Figura 6C (in basso), i livelli di espressione U6 sono circa gli stessi in tutti i campioni indicati, permettendo così di calcolo dei livelli variabili di miRNA. Una rappresentazione grafica di un risultato miRNA qPCR per un confronto tra il veicolo e le cellule trattate con E2 che sono stati normalizzati alla U6 riferimento può essere osservato nella Figura 6D. Questo illustra un miRNA che sono stati rilevato come sregolata dopo il trattamento 24 ore E2, ma che porti ER-cromatina siti di legame vicino alla sua posizione genomica e analisi delle serie temporali identificato regolamentazione significativo 72 ore dopo il trattamento. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig1.jpg" /> Figura 1. Una panoramica del metodo impiegato per il rilevamento della regolazione ormonale del miRNA in cellule di cancro al seno. </strong&gt; processo inizia con la cultura e il trattamento delle cellule, seguita da larga scala miRNA profiling per identificare miRNA possibilmente differenzialmente espresse, e termina con qRT-PCR convalide dei risultati di matrice. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig2.jpg" /> Figura 2. Il confronto tra le varie preparazioni del campione e manipolazioni di acidi nucleici per ogni tecnica di rilevamento miRNA. (A) miRNA microarray utilizzando il metodo tecnologia μParaflo comprende arricchimento, poly-A tailing ed etichettatura legatura. (B) preparazione del campione tecnologia DLP e metodo di rilevazione comprende un loop cDNA sintesi di primer che si estende dopo la fase di denaturazione e offre un frammento più lungo ospitante il preparazione del campione inverse primer e sequenza di sonda. (C) tecnologia Cyanine colorantee metodo di rilevazione comprende poli A-tailing, e la sintesi cDNA con un primer oligo-dT tra cui una sequenza universale 5 &#39;. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig3.jpg" /> Figura 3. Coltura cellulare e l&#39;estrazione di RNA. (A) le cellule coltivate per illustrare l&#39;80% di confluenza necessario prima del trattamento con ligando. (B) Rappresentazione grafica della concentrazione dell&#39;RNA e la purezza dopo l&#39;estrazione. Ogni picco rappresenta un campione e un processo di estrazione con successo produce RNA puro (pannello superiore). Un RNA estratto male non mostra alcun picco di assorbimento chiara a 260 nm (pannello inferiore). <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig4.jpg" /> Figura 4. &amp; #160; controllo di qualità RNA risultati di analisi dell&#39;integrità dell&#39;RNA mostra la rappresentazione grafica per la scala (in alto), un RNA di buona qualità (al centro) e un campione di RNA degradato (in basso).. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51285/51285fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51285/51285fig5.jpg" /> Figura 5. L&#39;illustrazione di miRNA risultati profiling. (A) Una rappresentazione mappa termica di miRNA risultati di microarray per miRNA differenzialmente espressi. miR-A, B, C sono upregulated in-campione trattato E2 come indicato in rosso, mentre miR-D, E, F, G sono smorzati nel campione E2-trattate a verde. (B) Trame amplificazione per ciascun miRNA dai risultati DLP-LDA. miRNA rilevati sono amplificati come indicato dalla incremento del valore Rn. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51285/51285fig6highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51285/51285fig6.jpg&quot; /&gt; Figura 6. analisi qPCR dei regolamenti miRNA. (A) Analisi di fusione curva per un miRNA analizzati utilizzando il rilevamento Cyanine colorante, mostrando l&#39;omogeneità di tutti i campioni esaminati (a sinistra) e l&#39;amplificazione di frammenti multipli (a destra). (B) appezzamenti di amplificazione per ogni campione per un miRNA. Questo può essere sia da Cyanine tintura o DLP metodi di rilevamento. (C) rappresentazione grafica Bar di geni di riferimento adeguati per l&#39;mRNA analisi ARHGDIA (in alto) e per l&#39;analisi dei miRNA snRNA U6 (in basso), che non mostrano espressione differenziale significativo tra i campioni. (D) risultati miRNA qPCR per illustrare il confronto dei livelli di espressione relativi di miR-135a nel corso di un corso di tempo. Figura 6D è stato ristampato da Katchy et al. 1 con il permesso di Elsevier. I valori sono di solito la media di compe separatoiments (duplicati biologici) ± SD. T-test di Student serve a dimostrare significato: * p &lt;0,05.

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Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Molecular segnalazione sia attraverso gli estrogeni e microRNA sono fondamentali nello sviluppo del cancro al seno e la crescita. Estrogeni attiva i recettori degli estrogeni, che sono fattori di trascrizione. Molti fattori di trascrizione in grado di regolare l&#39;espressione dei microRNA, e microRNA regolati dagli estrogeni possono essere profilato utilizzando diverse tecniche su larga scala.

Profiling di microRNA regolati dagli estrogeni in cellule di carcinoma mammario

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

20.0K Views.  University of Houston.  Molecular segnalazione sia attraverso gli estrogeni e microRNA sono fondamentali nello sviluppo del cancro al seno e la crescita. Estrogeni attiva i recettori degli estrogeni, che sono fattori di trascrizione. Molti fattori di trascrizione in grado di regolare l'espressione dei microRNA, e microRNA regolati dagli estrogeni possono essere profilato utilizzando diverse tecniche su larga scala. 

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Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multi-modal Imaging di angiogenesi in un modello di ratto Nudo di metastasi ossee cancro al seno utilizzando la risonanza magnetica, tomografia computerizzata volumetrica e Ultrasuoni

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

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Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional co-culture systems are frequently used to explicate tumor-stroma interactions, including their role in drug responses. However, many of the interactions that occur in vivo in the intact microenvironment cannot be completely replicated in these in vitro settings. Thus, direct visualization of these processes in real-time has become an important tool in understanding tumor responses to therapies and identifying the interactions between cancer cells and the stroma that can influence these responses. Here we provide a method for using spinning disk confocal microscopy of live, anesthetized mice to directly observe drug distribution, cancer cell responses and changes in tumor-stroma interactions following administration of systemic therapy in breast cancer models. We describe procedures for labeling different tumor components, treatment of animals for observing therapeutic responses, and the surgical procedure for exposing tumor tissues for imaging up to 40 hours. The results obtained from this protocol are time-lapse movies, in which such processes as drug infiltration, cancer cell death and stromal cell migration can be evaluated using image analysis software.

We describe a method for imaging response to anti-cancer treatment in vivo and at single cell resolution.

Vivo Imaging di risposte droga nel microambiente tumorale in modelli murini di cancro al seno

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Time-lapse imaging di primaria preneoplastiche cellule epiteliali mammarie Derivato da modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The interplay of signals between cancer cells and their microenvironment exerts a powerful influence on breast cancer growth and biological behavior1. However, most of these signals from the extracellular matrix are lost or their relevance is understudied when cells are grown in two dimensional culture (2D) as a monolayer. In recent years, three dimensional (3D) culture on a reconstituted basement membrane has emerged as a method of choice to recapitulate the tissue architecture of benign and malignant breast cells. Cells grown in 3D retain the important cues from the extracellular matrix and provide a physiologically relevant ex&#160;vivo system2,3. Of note, there is growing evidence suggesting that cells behave differently when grown in 3D as compared to 2D4. 3D culture can be effectively used as a means to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype and for underpinning the cellular and molecular signaling involved3. One of the distinguishing characteristics of benign epithelial cells is that they are polarized so that the apical cytoplasm is towards the lumen and the basal cytoplasm rests on the basement membrane. This apico-basal polarity is lost in invasive breast carcinomas, which are characterized by cellular disorganization and formation of anastomosing and branching tubules that haphazardly infiltrates the surrounding stroma. These histopathological differences between benign gland and invasive carcinoma can be reproduced in 3D6,7. Using the appropriate read-outs like the quantitation of single round acinar structures, or differential expression of validated molecular markers for cell proliferation, polarity and apoptosis in combination with other molecular and cell biology techniques, 3D culture can provide an important tool to better understand the cellular changes during malignant transformation and for delineating the responsible signaling.

Three dimensional culture of mammary epithelial cells on a reconstituted basement membrane is a useful method to recapitulate the in vivo architecture of the benign breast, and to differentiate the malignant phenotype from the benign breast phenotype. Importantly, this system can be applied to study invasive carcinomas in other tissues.

Tre Culture dimensionali: strumento per studiare normale acinose Architettura vs trasformazione maligna delle cellule mammarie

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional (3D) Model

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the extracellular matrix (ECM) has been demonstrated to be a critical regulator of cell behavior in culture and homeostasis in vivo. The current approach of culturing cells on two-dimensional (2D), plastic surfaces results in the disturbance and loss of complex interactions between cells and their microenvironment. Through the use of three-dimensional (3D) culture assays, the conditions for cell-microenvironment interaction are established resembling the in vivo microenvironment. This article provides a detailed methodology to grow breast cancer cells in a 3D basement membrane protein matrix, exemplifying the potential of 3D culture in the assessment of cell invasion into the surrounding environment. In addition, we discuss how these 3D assays have the potential to examine the loss of signaling molecules that regulate epithelial morphology by immunostaining procedures. These studies aid to identify important mechanistic details into the processes regulating invasion, required for the spread of breast cancer.

Quantification of Breast Cancer Cell Invasiveness Using a Three-dimensional 3D Model

This article provides detailed methodologies for the use of three-dimensional (3D) assays to quantify breast cancer cell invasion. Specifically, we discuss the procedures required to set up such assays, quantification, and data analysis, as well as methods to examine the loss of membrane integrity that occurs when cells invade.

Quantificazione del cancro al seno Cellula Invasività Utilizzando una tridimensionale (3D) Modello

It is now well known that the cellular and tissue microenvironment are critical regulators influencing tumor initiation and progression. Moreover, the ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Molecular Profiling del microambiente tumorale invasiva in un modello 3-Dimensional delle cellule del cancro colorettale e<em&gt; Ex vivo</em&gt; fibroblasti

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the functions of proteins involved in oncogenic progression or help to discover new tumor suppressors. In addition, injecting cancer cells into mice with different genotypes might provide a better understanding of the importance of the stromal compartment. Many models may be useful to investigate certain aspects of disease progression but do not recapitulate the entire cancerous process. In contrast, breast cancer cells engraftment to the mammary fat pad of mice better recapitulates the location of the disease and presence of the proper stromal compartment and therefore better mimics human cancerous disease. In this article, we describe how to implant breast cancer cells into mice orthotopically and explain how to collect tissues to analyse the tumor milieu and metastasis to distant organs. Using this model, many aspects (growth, angiogenesis, and metastasis) of cancer can be investigated simply by providing a proper environment for tumor cells to grow.

Cancer is a complex disease that is influenced by the tissue surrounding the tumor as well as local pro- and anti-inflammatory mediators. Therefore, orthotropic injection models, rather than subcutaneous models may be useful to study cancer progression in a manner that better mimics human pathology.

Iniezione ortotopico di cellule di carcinoma mammario nel mammaria Fat Pad di Mice per studiare la crescita del tumore.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo ed ex vivo approcci per studiare il cancro ovarico metastatico colonizzazione delle strutture Lattea Spot in peritoneale adiposo

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation assay (hereafter called soft agar assay), which measures the ability of cells to proliferate in semi-solid matrices, remain a hallmark of cancer research. A key advantage of this technique over conventional 2D monolayer or 3D spheroid cell culture assays is the close mimicry of the 3D cellular environment to that seen in vivo. Importantly, the soft agar assay also provides an ideal tool to rigorously test the effects of novel compounds or treatment conditions on cell proliferation and migration. Additionally, this assay enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations. We recently identified peptidylarginine deiminase 2 (PADI2) as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. Here we highlight the utility of the soft agar assay for preclinical anti-cancer studies by testing the effects of the PADI inhibitor, BB-Cl-amidine (BB-CLA), on the tumorigenicity of human ductal carcinoma in situ (MCF10DCIS) cells.

Here, we document the use of the soft agar colony formation assay to test the effects of a peptidylarginine deiminase (PADI) enzyme inhibitor, BB-Cl-amidine, on breast cancer tumorigenicity in vitro.

Utilizzo del saggio soft Agar Colony Formazione per identificare inibitori di tumorigenicità in cellule di carcinoma mammario

Given the inherent difficulties in investigating the mechanisms of tumor progression in vivo, cell-based assays such as the soft agar colony formation ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor initiation, metastasis and resistance to radio- and chemotherapy. Here we describe a specific methodology for culturing primary human pancreatic CSCs as tumor spheres in anchorage-independent conditions. Cells are grown in serum-free, non-adherent conditions in order to enrich for CSCs while their more differentiated progenies do not survive and proliferate during the initial phase following seeding of single cells. This assay can be used to estimate the percentage of CSCs present in a population of tumor cells. Both size (which can range from 35 to 250 micrometers) and number of tumor spheres formed represents CSC activity harbored in either bulk populations of cultured cancer cells or freshly harvested and digested tumors 1,2. Using this assay, we recently found that metformin selectively ablates pancreatic CSCs; a finding that was subsequently further corroborated by demonstrating diminished expression of pluripotency-associated genes/surface markers and reduced in vivo tumorigenicity of metformin-treated cells. As the final step for preclinical development we treated mice bearing established tumors with metformin and found significantly prolonged survival. Clinical studies testing the use of metformin in patients with PDAC are currently underway (e.g., NCT01210911, NCT01167738, and NCT01488552). Mechanistically, we found that metformin induces a fatal energy crisis in CSCs by enhancing reactive oxygen species (ROS) production and reducing mitochondrial transmembrane potential. In contrast, non-CSCs were not eliminated by metformin treatment, but rather underwent reversible cell cycle arrest. Therefore, our study serves as a successful example for the potential of in vitro sphere formation as a screening tool to identify compounds that potentially target CSCs, but this technique will require further in vitro and in vivo validation to eliminate false discoveries.

Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.