نحن نقدم شكر خاص لإيف Couder لكثير من المناقشات المفيدة. نشكر عاطف Asnacios لمعايرة الكابولي والمناقشة. نشكر ليزا ويليس، إليوت Meyerowitz، وأوليفر Hamant لقراءة نقدية. وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من منحة RGP0062/2005-C برنامج العلوم الحدودي الإنسان؛ الوكالة الوطنية للبحوث دي لا تتوقع&#39;&#39; Growpec،&#39;&#39;&#39;&#39; وMechastem&#39;&#39;.

1. إعداد الشرائح الزجاجية لتركيب عينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الطمر وسائل الإعلام الاغاروز: 0.7٪ انخفاض ذوبان الاغاروز في 10٪ مانيتول (في الماء). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام أداة معدنية قوية (مثل الحفر طرف، والجير)، حفر خارج المنطقة 0.5 سم × 0.5 في وسط شريحة زجاجية مجهرية. أو بدلا من ذلك، الغراء قطعة صغيرة من الزجاج لاميلا (حوالي 20 × 200 ميكرون) إلى شريحة زجاجية باستخدام الغراء Araldite. ملاحظة: هذا roughens السطح من أجل تسهيل التصاق الاغاروز لضمان أن العصي وسائل الإعلام الاغاروز أو الإصلاحات إلى الشريحة. يمكن إعادة استخدامها هذه الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرات من حوالي 20 ميكرولتر من وسائل الإعلام الطمر الاغاروز على المنطقة محفورا من شريحة زجاجية. وهذا يعطي طبقة رقيقة من الاغاروز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين شريحة زجاجية في مربع الرطبة وانتظر الإعلام لترسيخ الاغاروز. </li></ol> 2. تشريح وتركيب عينات النسيج الإنشائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microdissect الخلايا الإنشائية لimagi متحد البؤرنانوغرام: إزالة البراعم الزهرية واحدا تلو الآخر من جذع عن طريق سحب عليهم مع ملاقط غرامة فائقة. فمن المهم لإزالة جميع البراعم الزهرية حتى البراعم التي لا تظهر كأسية (أي براعم P1 14). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام شفرة حلاقة أو غيض من ملاقط، وقطع النسيج الإنشائي بعيدا عن الجذع. وينبغي أن يكون خفض مواز للمنطقة من سطح النسيج الإنشائي الذي سيتم قياس مع فؤاد. وينبغي أن تكون قمة حصل بين 300 ميكرون و 600 ميكرون عالية لتناسب تحت غيض فؤاد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع قمة في الفيلم من وسائل الإعلام الاغاروز أعدت في الخطوة 1.1.4. اختيار الموقف على شريحة زجاجية / الاغاروز ودفع مثل هذه بلطف أن النسيج الإنشائي على حد سواء على اتصال مباشر مع شريحة زجاجية ويبرز الخروج من الاغاروز. فمن الأهمية بمكان لوضع النسيج الإنشائي في الاغاروز في غضون بضع ثوان التي تتبع خفض من الجذع. ملاحظة: هذا هو من أجل منع النسيج الإنشائي من التجفيف. في هذه المرحلة، سيتم النسيج الإنشائي واقفا في CRACك لأن الاغاروز بكسر على تطبيق الضغط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد العديد من الخلايا الإنشائية لهذا الطريق لدفعة التصوير، وتوفير أنهم من نفس الارتفاع ويتم وضع أقل من 500 ميكرون من بعضها البعض على الشريحة. الحفاظ على الخلايا الإنشائية أعدت في مربع الرطبة بينما تشريح عينات أخرى. ملاحظة: إنه يحد من الاختلاف يأتي من المعايرة. من الناحية المثالية 2 عينات من كل شرط يمكن إعداد وقياس عشوائيا. حتى الآن ليس هناك أي تأثير لوحظ من التصوير دفعة على القياس (الاجهاد الناجم الاستجابة). هذا يمكن أن يكون ذلك بفضل التخفيف من الإجهاد يشير الجزيئات في أجار و / أو الحل في تصاعد مستمر. بدلا من الاستجابة للضغط النفسي هو نفسه بغض النظر عن كمية من العينة مستعدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الانتقال إلى الخطوة التالية، تأكد من أن الحدود بين النسيج الإنشائي وبراعم الأزهار جافة. إن لم يكن، وإزالة الماء الزائد بلطف باستخدام ورق الترشيح. هذا ينبغي أن يمنع في المرحلة المقبلة أن ذابتالاغاروز الفيضانات العينة بسبب القوى الشعرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع ماصة 20 ميكرولتر، إضافة ما يكفي من ذاب تصاعد الاغاروز لملء في صدع إنشاؤها في الخطوة 1.2.3. وتحيط بكل النسيج الإنشائي. الاغاروز ينبغي أن تصل إلى مستوى ندبة من برعم زهرة إزالتها (منشم). لتحقيق هذا، قد يكون من الضروري إضافة الاغاروز في نهاية كل من الكراك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند إضافة الاغاروز، وسوف تغرق بسرعة في صدع؛ باستخدام ماصة، تمتص قبالة جزء من ذاب تصاعد الاغاروز لضمان أن النسيج الإنشائي هو أعلى نقطة على الشريحة. هذا على إصلاح النسيج الإنشائي بحيث لا يمكن أن تتحرك خلال التصوير. </li></ol> 3. تركيب الجذر أو عينات التحتفلقي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجذور وhypocotyls، لا تشريح ضروري. في الفيلم رقيقة من الاغاروز على شريحة زجاجية استعداد، وجعل أخدود إما مباشرة فوق لحفر في الزجاج أو على طول الصفيحة الزجاجية. ضع الجذر أو التحتفلقي في هذا الأخدود ضمان أنه في اتصال معالزجاج على طوله كله. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الانتقال إلى الخطوة التالية، تأكد من أن العينة الجافة في سطحه. إن لم يكن، وإزالة بلطف وفائض من المياه باستخدام ورق الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ذاب تصاعد الاغاروز حول عينة كما في الخطوة 1.2.6. </li></ol> 4. إعداد فؤاد وحساسية معايرة (لو NanoWizard JPK فؤاد) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل ناتئ على فؤاد. يجب أن يتم تنظيمها ناتئ مع إندينتر على شكل مستدير. فإن نصف قطرها تحديد س، ص، ض القرار وعمق المسافة البادئة في القياس الدقيق الذي يمكن أرشفة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لأخذ القياسات ميزو النانوية على سطح البشرة، واستخدام إندينتر الجولة 50 نانومتر نصف قطرها؛ لأخذ القياسات المتوسطة المدى، واستخدام 0.5 ميكرومتر إندينتر الجولة دائرة نصف قطرها؛ لأخذ القياسات الميكروسكيل (2-3 عبر الخلايا)، واستخدام إندينتر الجولة دائرة نصف قطرها 2.5 ميكرومتر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الليزر على طرف ناتئ. محاذاة الليزر إلى منتصفمن الآسر باستخدام مرآة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع كوب نظيف تحت فؤاد. ملاحظة: يتم تعيين التالية لتحويل إشارة لموقف الليزر على مستقبلات فؤاد إلى تشوه ناتئ، وتقييم مستمر ربيع ناتئ، لترجمته إلى قوة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النهج مع قوة الهدف &quot;نقطة مجموعة&quot; من 1 V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;التحليل الطيفي القوة&quot;. القيام المسافة البادئة من خلال تحديد الحد الأقصى &quot;نقطة مجموعة النسبية&quot; ل2 V، و &quot;تمديد السرعة&quot; إلى 40 ميكرون / ثانية، و &quot;طول ض&quot; إلى 5 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من القائمة &quot;المعايرة مدير&quot;، حدد الخطية جزء من منحنى إلى الأمام لتناسب حساسية باستخدام زر &quot;اختيار مجموعة مناسبة&quot;. &quot;نقطة مجموعة النسبية&quot; يجب أن تتحول من &quot;فولت&quot; إلى &quot;متر&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من القائمة &quot;مدير المعايرة&quot;، حدد &quot;ربيع دائم&quot; لتقييم ايلasticity من ناتئ باستخدام التقلبات الحرارية. اضغط على &quot;تشغيل&quot; للحصول على المؤامرة الكثافة الطيفية للناتئ. العثور على ذروة صدى مع أدنى تردد. أنها تناسب باستخدام زر &quot;اختيار مجموعة مناسبة&quot;. ملاحظة 1: للحصول على مزيد من التفاصيل على ضبط التقلبات الحرارية، وقراءة كوك 15 آخرون. ملاحظة 2: يفضل استخدام الطريقة المباشرة لتقييم مرونة ناتئ باستخدام ناتئ المرجعية (أو المواد مع صلابة المعروفة). وقد تبرعت تلك المستخدمة هنا تفضلت عاطف Asnacios 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من 10٪ محلول مانيتول تحت طرف ناتئ. إعادة تنظيم الليزر لمنتصف الآسر باستخدام مرآة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة ضبط حساسية: من القائمة &quot;المعايرة مدير&quot;، انقر على زر &quot;غير معروف&quot;؛ كرر الخطوات من 2.3 إلى 2.5 خلال. </li></ol> 5 الحصول على البيانات: ولي يونغ معامل رسم الخرائط <ol&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العينات التي شنت تحت فؤاد وإضافة قطرات 500 ميكرولتر من 10٪ محلول مانيتول على العينة. الحل مانيتول plasmolyzes الخلايا في غضون دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النهج مع قوة الهدف (&quot;نقطة تعيين&quot;) 20 ن ن (&quot;تعيين نقطة&quot; لا ينبغي أن يكون أكثر من 3 V) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المسافة البادئة مع &quot;نقطة التحديد النسبي&quot; 200 ن ن، وهو &quot;تمديد السرعة&quot; من 40 ميكرون / ثانية، و &quot;طول ض&quot; من 5 ميكرون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط &quot;نقطة مجموعة النسبية&quot; من أجل الحصول على المسافة البادئة من 100 نانومتر ل200 نانومتر شنت ناتئ أو 0.5 ميكرومتر ل1 ميكرون / 5 ميكرون شنت ناتئ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وضع &quot;خرائط القوة&quot;، حدد لمسح المنطقة: لالخلايا الإنشائية، و 70 ميكرومتر × 70 ميكرون مع قرار (&quot;بكسل&quot;) 64 × 64؛ لhypocotyls والجذور، 100 ميكرون × 100 ميكرون مع قرار من 64 × 64. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصحافة مسح لإطلاق التجارب. حفظ الإخراج. </لى&gt; </ol> 6 تحليل البيانات: حسابات معامل ولي يونغ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح ملف البيانات في البرنامج وتحليل البيانات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;تجهيز الدفعات&quot; لتطبيق نفس التحليل لجميع منحنيات خريطة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;تصحيح الارتفاع لالانحناء للناتئ&quot; لذلك لاستخراج عمق المسافة البادئة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;معامل تناسب وظيفة يونغ&quot; التي ستتولى القوة يتناسب مع مجال المسافة البادئة. تعيين &quot;شكل نصيحة&quot; إلى مكافئ لنفترض أن المسافة البادئة هو شكل قطع مكافئ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتشير دائرة نصف قطرها من الحافة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد تفضيلي &quot;التراجع&quot; منحنى لتحليل لأنها أقل حساسية للتضاريس من منحنى &quot;تمديد&quot;. ومع ذلك، إذا كان هناك خلاف كبير من التحقيق خلال &quot;التراجع&quot;، استخدم منحنى &quot;تمديد&quot;، والتي هي حساسة للالتصاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مجموعةنسبة بواسون إلى 0.5. الصحافة على تحليل وحفظ الإخراج. </li></ol>

<ol>
	<li>Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+in+vitro+extensibility+of+growing+plant+cell+walls.">Measuring in vitro extensibility of growing plant cell walls.</a> Methods in molecular biology. 715, 291-303 (2011).</li><li>Durachko, D. M., Cosgrove, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+plant+cell+wall+extension+(creep)+induced+by+acidic+pH+and+by+alpha-expansin.">Measuring plant cell wall extension (creep) induced by acidic pH and by alpha-expansin.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , 1263 (2009).</li><li>Durachko, D. a. n. i. e. l. M., C, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+Plant+Cell+Wall+Extension+(Creep)+Induced+by+Acidic+pH+and+by+Alpha-Expansin.">Measuring Plant Cell Wall Extension (Creep) Induced by Acidic pH and by Alpha-Expansin.</a> J. Vis. Exp.. , 25 (2009).</li><li>Suslov, D., Verbelen, J. P., Vissenberg, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onion+epidermis+as+a+new+model+to+study+the+control+of+growth+anisotropy+in+higher+plants.">Onion epidermis as a new model to study the control of growth anisotropy in higher plants.</a> Journal of experimental botany. 60, 4175-4187 (2009).</li><li>Parre, E., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin+and+the+role+of+the+physical+properties+of+the+cell+wall+in+pollen+tube+growth+of+Solanum+chacoense.">Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solanum chacoense.</a> Planta. 220, 582-592 (2005).</li><li>Zerzour, R., Kroeger, J., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polar+growth+in+pollen+tubes+is+associated+with+spatially+confined+dynamic+changes+in+cell+mechanical+properties.">Polar growth in pollen tubes is associated with spatially confined dynamic changes in cell mechanical properties.</a> Developmental biology. 334, 437-446 (2009).</li><li>Radotic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+stiffness+tomography+on+living+Arabidopsis+thaliana+cells+reveals+the+mechanical+properties+of+surface+and+deep+cell-wall+layers+during+growth.">Atomic force microscopy stiffness tomography on living Arabidopsis thaliana cells reveals the mechanical properties of surface and deep cell-wall layers during growth.</a> Biophysical journal. 103, 386-394 (2012).</li><li>Milani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+local+wall+stiffness+at+the+shoot+apical+meristem+in+Arabidopsis+using+atomic+force+microscopy.">In vivo analysis of local wall stiffness at the shoot apical meristem in Arabidopsis using atomic force microscopy.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 67, 1116-1123 (2011).</li><li>Peaucelle, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pectin-induced+changes+in+cell+wall+mechanics+underlie+organ+initiation+in+Arabidopsis.">Pectin-induced changes in cell wall mechanics underlie organ initiation in Arabidopsis.</a> Current biology : CB. 21, 1720-1726 (2011).</li><li>Braybrook, S. A., Hofte, H., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+mechanical+contributions+of+the+pectin+matrix:+Insights+for+cell+growth.">Probing the mechanical contributions of the pectin matrix: Insights for cell growth.</a> Plant signaling &amp; behavior. 7, 1037-1041 (2012).</li><li>Routier-Kierzkowska, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+force+microscopy+for+in+vivo+measurements+of+plant+tissue+mechanics.">Cellular force microscopy for in vivo measurements of plant tissue mechanics.</a> Plant physiology. 158, 1514-1522 (2012).</li><li>Agudelo, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TipChip:+a+modular,+MEMS-based+platform+for+experimentation+and+phenotyping+of+tip-growing+cells.">TipChip: a modular, MEMS-based platform for experimentation and phenotyping of tip-growing cells.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 1057-1068 (2013).</li><li>Miedes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xyloglucan+endotransglucosylase/hydrolase+(XTH)+overexpression+affects+growth+and+cell+wall+mechanics+in+etiolated+Arabidopsis+hypocotyls.">Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase (XTH) overexpression affects growth and cell wall mechanics in etiolated Arabidopsis hypocotyls.</a> Journal of experimental botany. 64, 2481-2497 (2013).</li><li>Byrne, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Asymmetric+leaves1+mediates+leaf+patterning+and+stem+cell+function+in+Arabidopsis.">Asymmetric leaves1 mediates leaf patterning and stem cell function in Arabidopsis.</a> Nature. 408, 967-971 (2000).</li><li>Cook, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+implementation+of+dynamic+methods+for+measuring+atomic+force+microscope+cantilever+spring+constants.">Practical implementation of dynamic methods for measuring atomic force microscope cantilever spring constants.</a> Nanotechnology. 17, 20135-22145 (2006).</li><li>Desprat, N., Richert, A., Simeon, J., Asnacios, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creep+function+of+a+single+living+cell.">Creep function of a single living cell.</a> Biophysical journal. 88, 2224-2233 (2005).</li><li>Peaucelle, A., Braybrook, S., Hofte, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+wall+mechanics+and+growth+control+in+plants:+the+role+of+pectins+revisited.">Cell wall mechanics and growth control in plants: the role of pectins revisited.</a> Frontiers in plant science. 3, 121 (2012).</li><li>Mittler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+signaling:+the+new+wave.">ROS signaling: the new wave.</a> Trends in plant science. 16, 300-309 (2011).</li><li>Braybrook, S. A., Peaucelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechano-chemical+aspects+of+organ+formation+in+Arabidopsis+thaliana:+the+relationship+between+auxin+and+pectin.">Mechano-chemical aspects of organ formation in Arabidopsis thaliana: the relationship between auxin and pectin.</a> PLoS. 8, e57813 (2013).</li><li>Asnacios, A., Hamant, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanics+behind+cell+polarity.">The mechanics behind cell polarity.</a> Trends in cell biology. 22, 584-591 (2012).</li><li>Meister, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FluidFM:+combining+atomic+force+microscopy+and+nanofluidics+in+a+universal+liquid+delivery+system+for+single+cell+applications+and+beyond.">FluidFM: combining atomic force microscopy and nanofluidics in a universal liquid delivery system for single cell applications and beyond.</a> Nano letters. 9, 2501-2507 (2009).</li><li>Lintilhac, P. M., Wei, C., Tanguay, J. J., Outwater, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ball+tonometry:+a+rapid,+nondestructive+method+for+measuring+cell+turgor+pressure+in+thin-walled+plant+cells.">Ball tonometry: a rapid, nondestructive method for measuring cell turgor pressure in thin-walled plant cells.</a> Journal of plant growth regulation. 19, 90-97 (2000).</li><li>Kroeger, J. H., Zerzour, R., Geitmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulator+or+driving+force?+The+role+of+turgor+pressure+in+oscillatory+plant+cell+growth.">Regulator or driving force? The role of turgor pressure in oscillatory plant cell growth.</a> PloS one. 6, e18549 (2011).</li><li>Forouzesh, E., Goel, A., Mackenzie, S. A., Turner, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+extraction+of+Arabidopsis+cell+turgor+pressure+using+nanoindentation+in+conjunction+with+finite+element+modeling.">In vivo extraction of Arabidopsis cell turgor pressure using nanoindentation in conjunction with finite element modeling.</a> The Plant journal : for cell and molecular biology. 73, 509-520 (2013).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

في النباتات، وتغيير الخواص الميكانيكية تلعب دورا رئيسيا في توجيه النمو والتشكل. حتى الآن لم يكن هناك تقدم كبير في كشف شبكات الوراثية والكيميائية التي تتحكم في نمو النبات، ولكن معرفتنا لكيفية مساهمة هذه الشبكات إلى وتتأثر التغيرات في الخواص الميكانيكية بدائية. يجب أ...

ويتحقق النمو في النباتات عن طريق التوسع المنسق لجدران الخلايا الجامدة التي تحيط كل خلية من خلايا الكائن الحي. تراكم الأدلة تشير إلى أنه من خلال تعديل الكيمياء جدار الخلية أن النباتات السيطرة محليا هذا التوسع. ويعتقد أن توسع لتكون مدفوعة أساسا عن طريق الضغط على جدران الخلايا، والناجمة عن ارتفاع ضغط تورم الخلية؛ ويخضع هذا الرد سلالة لضغوط تورم من قبل الخواص الميكانيكية للجدران الخلايا 1. لا يعرف الا القليل من هذه الخصائص الميكانيكية وكيف تتغير خلال التنمية. وعلاوة على ذلك والقليل المعروف عن كيفية التحكم في هذه الخصائص الميكانيكية وعما إذا كانت الاصداء يسهم في تغيير كيمياء جدار الخلية بطريقة ما يبدو أن يتم تنسيق عبر الأنسجة. إذا أردنا أن نفهم العلاقة بين التغيرات الكيميائية والميكانيكية في جدران الخلايا النباتية خلال التنمية، وفي نهاية المطاف كيف تحكم هذه التفاعلات المجهرية مصنعمطلوب النمو &#39;ق العيانية، وهو الأسلوب الذي يمكن رصد الخصائص الميكانيكية للجدران الخلايا في تطوير الأجهزة على المستوى الخلوي أو الأنسجة. أسلوب القوة الذرية المجهري (فؤاد) وصفها هنا، والتي تقوم على ميكرومتر أو نانومتر الضغط على الأنسجة أو المسافات البادئة، وقد وضعت على وجه التحديد لقياس الخواص الميكانيكية للجدران الخلايا في تطوير أجهزة في وقت واحد في قرارات التحت خلوية وعبر مناطق بأكملها من الأنسجة. أساليب أخرى إما قرارا منخفضة جدا أو مرتفعة جدا: على التمدد هو فقط قادرة على قياس متوسط ​​الخواص الميكانيكية للأنسجة كلها في نطاق ملليمتر 2-4، وهو النطاق الذي هو على سبيل المثال كبيرة جدا لقياس الأحداث في وقت مبكر من توالد؛ وmicroindenter يمكن أخذ القياسات في قرار التحت خلوية على مقياس متناهي الصغر، لكنه يقتصر على قياس خلايا معزولة وليس مجموعات من الخلايا أو الأجهزة 5-7. مع فؤاد، وتتطلبد الأنسجة الخلوية، وقرارات التحت خلوية ويمكن تحقيق 8-10. في الآونة الأخيرة تم تطوير العديد من البروتوكولات خصيصا لقياس اليات الأنسجة النباتات التي يمكن أن تستخدم أيضا 11 و 12. سنستعرض هنا كيفية تقييم مرونة الأنسجة من خلال قياس معامل الظاهر يونغ 13. يتم استخدام معامل يونغ عادة لوصف صلابة من المواد. خلال تشويه صغيرة القوة المطلوبة لتشوه مادة يتناسب مع مجال المسافة البادئة. معامل يونج هو هذا معامل. في حالة وجود مواد متجانسة المستمر سيتم قياس معامل نفسه بغض النظر عن نوع المسافة البادئة (الحجم والشكل) ولكن سوف يتغير مع سرعة القياس. في حالة من بنية معقدة من أنسجة النباتات، وقد لاحظنا حتى الآن أن القوة تتناسب مع تشوه السماح تحديدمعامل التناسب أننا اسم &quot;معامل الشباب على ما يبدو&quot;. في المقابل من وسائط الإعلام المستمر في النباتات، وهذا واضح معامل الشباب حساس لحجم المسافة البادئة. أنها لا تتوافق مع معاملات الرجوعية الشباب من جدار الخلية نقية. فهو يصف أفضل مرونة من السقالات من خلايا جدار الأنسجة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="850">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">NanoWizard</td>
			<td style="width:167px;">All the 3-generation are abele to do the work withe the same preferment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM stage</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">CellHesion</td>
			<td>Required for sample withe low topography (les then 11&#181;m between the lowest and the highest point in the aria of force scanning).</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">AFM optics</td>
			<td style="width:348px;">JPK</td>
			<td style="width:119px;">Top View Optics&#160;</td>
			<td>Very important in order to position the sample. Cold be replaces by long range a binocular or microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Stereo Microscopes&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;">M125</td>
			<td>Any type of stereo microscopes could do.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">150nm mounted cantilever&#160;</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td style="width:119px;">R150-NCL-10</td>
			<td>To measure only the cell wall at the surface of the epidermis use</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">1&#181;m mounted cantilever&#160;</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td>SD-Sphere-NCH-S-10&#160;</td>
			<td>to measure the mechanics of the cell wall orthogonal to the surface of the epidermis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tipless cantiliver</td>
			<td style="width:348px;">nanosensors Rue Jaquet-Droz 1Case Postale 216 CH-2002 Neuchatel Switzerland</td>
			<td>TL-NCH-20&#160;</td>
			<td>to measure the local mechanics of the tissue (2-3 cell wide) use a 5&#181;m mounted cantilever. We attached a 5&#181;m borasilicate bead to a tipless cantiliver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5&#181;m silicon microspheres</td>
			<td style="width:348px;">Corpuscular</td>
			<td style="width:119px;">C-SIO-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aradilte&#160;</td>
			<td style="width:348px;">Bartik S.A. 77170 Coubet France</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Aradilte for fixing the bead to the tip les cantiliver</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;low melting Agarows</td>
			<td style="width:348px;">Fishersci Fair Lawn , new jersey 07410</td>
			<td style="width:119px;">BP160-100</td>
			<td>34-45 Gelation Temperature</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">D-Mannitol</td>
			<td style="width:348px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce Street, St Louis Mo 63103 USA)</td>
			<td style="width:119px;">M4125-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:348px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">2&#160; Stainless Steel No. 5 Tweezers</td>
			<td style="width:348px;">Ideal-Tek 6828 Balerna Switzerland&#160;</td>
			<td align="right">951199</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

afm-based mapping of the elastic properties of cell walls: at tissue, cellular, and subcellular resolutions

نحن تصف طريقة تم تطويرها مؤخرا لقياس الخواص الميكانيكية للأسطح الأنسجة النباتية باستخدام القوة الذرية المجهري (AFM) الصغيرة / نانو المسافات البادئة، لJPK فؤاد. على وجه التحديد، في هذا البروتوكول نقيس معامل يونغ واضحة من جدران الخلايا في قرارات التحت خلوية عبر المناطق تصل إلى 100 ​​× 100 ميكرومتر ميكرومتر في الخلايا الإنشائية الأزهار، hypocotyls، والجذور. هذا يتطلب إعدادا دقيقا من العينة، واختيار الصحيح من indenters الصغيرة وأعماق المسافة البادئة. لحساب خصائص جدار الخلية فقط، يتم تنفيذ القياسات في حلول مركزة للغاية من مانيتول ليحل الجبلة الخلايا، وبالتالي إزالة مساهمة ضغط تورم الخلية. وعلى النقيض من تقنيات موجودة الأخرى، وذلك باستخدام indenters مختلفة وأعماق المسافة البادئة، وهذه الطريقة تسمح قياسات متعددة النطاقات في وقت واحد، <em&gt; أي في قرارات التحت خلوية وعبر مئات من الخلايا تتكون من الأنسجة. وهذا يعني أن من الممكن الآن لتوصيف مكانيا زمانيا التغييرات التي تحدث في الخواص الميكانيكية للجدران الخلايا أثناء التطور، وتمكين هذه التغييرات تكون مرتبطة مع النمو والتمايز. هذا يمثل خطوة أساسية لفهم كيفية تحقيق التغيرات الخلوية المجهرية منسقة حول الأحداث التخلق العيانية. ومع ذلك، لا تزال هناك العديد من القيود: لا يمكن إلا أن طريقة استخدامها على عينات صغيرة نسبيا (حوالي 100 ميكرون في القطر) وفقط على الأنسجة الخارجية؛ طريقة حساسة للتضاريس الأنسجة؛ فهو يقيس جوانب معينة فقط من الخواص الميكانيكية المعقدة الأنسجة و. ويجري تطوير هذه التقنية بسرعة وأنه من المرجح أن معظم هذه القيود سيتم حلها في المستقبل القريب.

في الشكل 1 نقدم نموذجية معاملات الرجوعية الخرائط الشباب من الخلايا الإنشائية الأزهار (أرقام 1A و 1B)، hypocotyls الصغار والكبار (أرقام 1C-F)، والنسيج الإنشائي الجذر (الشكل 1G و1H). في جميع التجارب إندينتر هو نصف كروية، ولكن نصف قطرها ...

Watch this Scientific Journal Video about AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions at JoVE.com

AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

رسم الخرائط على أساس فؤاد للخصائص مطاطا جدران الخلايا: في الأنسجة، الخلوية، وقرارات التحت خلوية

We describe a recently developed method to measure mechanical properties of the surfaces of plant tissues using atomic force microscopy (AFM) ...

afm-based-mapping-elastic-properties-cell-walls-at-tissue-cellular

Research

JoVE Journal

Biology

12.8K Views.  Université Paris Diderot. We describe a method to map mechanical properties of plant tissues using an atomic force microscope (AFM). We focus on how to record mechanical changes that take place in cell walls during plant development at wide-field mesoscale, enabling these changes to be correlated with growth and morphogenesis.

Video: AFM-based Mapping of the Elastic Properties of Cell Walls: at Tissue, Cellular, and Subcellular Resolutions

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

أكتين المشارك الترسيب الفحص ، وبالنسبة للتحليل البروتين ملزمة لF - أكتين

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Single Molecule Methods for Monitoring Changes in Bilayer Elastic Properties

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein interactions and more general lipid bilayer-protein interactions. These interactions are particularly important in pharmacological research, as many current pharmaceuticals on the market can alter the lipid bilayer material properties, which can lead to altered membrane protein function.   The formation of gramicidin channels are dependent on conformational changes in gramicidin subunits which are in turn dependent on the properties of the lipid.  Hence the gramicidin channel  current is a reporter of altered properties of the bilayer due to certain compounds.  

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition. This video-article details how to form a patch using bilayer patch electrodes, as well as how to use gramicidin channels as reporters of altered membrane properties.

طرق جزيء واحد لرصد التغيرات في خصائص طبقة ثنائية مطاطا

Membrane protein function is regulated by the cell membrane lipid composition.  This regulation is due to a combination of specific lipid-protein ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation2 and other products such as biocomposite materials6. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses, and the polyphenol lignin5 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls contribute extensively to the strength and structural integrity of the entire plant. Despite its necessary rigidity, the cell wall is a highly dynamic entity that is metabolically active and plays crucial roles in numerous cell activities such as plant growth and differentiation5. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerisation by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its monosaccharide composition of the hemicelluloses and other matrix polysaccharides1, and its content of crystalline cellulose7. The protocol for analyzing the lignin components in lignocellulosic biomass is discussed in Part I3.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of wall derived carbohydrates.

التركيبية تحليل شامل لجدران الخلايا النباتية (الكتلة الحيوية Lignocellulosic) الجزء الثاني : الكربوهيدرات

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

One-channel Cell-attached Patch-clamp Recording

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate depends on properties intrinsic to each channel protein as well as the mechanism by which it is generated and controlled and represents an important area of current research. Information about the operational dynamics of ion channel proteins can be obtained by observing long stretches of current produced by a single molecule. Described here is a protocol for obtaining one-channel cell-attached patch-clamp current recordings for a ligand gated ion channel, the NMDA receptor, expressed heterologously in HEK293 cells or natively in cortical neurons. Also provided are instructions on how to adapt the method to other ion channels of interest by presenting the example of the mechano-sensitive channel PIEZO1. This method can provide data regarding the channel&#8217;s conductance properties and the temporal sequence of open-closed conformations that make up the channel&#8217;s activation mechanism, thus helping to understand their functions in health and disease.

Described here is a procedure for obtaining long stretches of current recording from one ion channel with the cell-attached patch-clamp technique. This method allows for observing, in real time, the pattern of open-close channel conformations that underlie the biological signal. These data inform about channel properties in undisturbed biological membranes.

قناة واحدة الخلية المرفقة تسجيل التصحيح، المشبك

Ion channel proteins are universal devices for fast communication across biological membranes. The temporal signature of the ionic flux they generate ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

عزل خلايا الفئران صمام غشائي

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

الجهد والكالسيوم مزدوجة القناة البصرية رسم خرائط مثقف HL-1 الرجفان العضلية واحد رقائق

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

تشريح السمعية بولا بعد الولادة في الفئران: عزل العظام الأذن الوسطى وتحليل النسيجي

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

تحليل وظيفة خلايا بيتا باستخدام تصوير الكالسيوم القرار خلية واحدة في الجزيرات الزرد

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

فائقة الدقة تصوير الخلايا الحية من الهياكل دون الخلوية

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic properties. Density is a cell type identifying property, directly related to its metabolic rate, differentiation, and activation status. Magnetic levitation allows a one-step approach to successfully separate, image and characterize circulating blood cells, and to detect anemia, sickle cell disease, and circulating tumor cells based on density and magnetic properties. This approach is also amenable to detecting soluble antigens present in a solution by using sets of low- and high-density beads coated with capture and detection antibodies, respectively. If the antigen is present in solution, it will bridge the two sets&#160;of beads, generating a new bead-bead complex, which will levitate in between the rows of antibody-coated beads. Increased concentration of the target antigen in solution will generate a larger number of bead-bead complexes when compared to lower concentrations of antigen, thus allowing for quantitative measurements of the target antigen. Magnetic levitation is advantageous to other methods due to its decreased sample preparation time and lack of dependance on classical readout methods. The image generated is easily captured and analyzed using a standard microscope or mobile device, such as a smartphone or a tablet.

This paper describes a magnetic levitation-based method that can specifically detect the presence of antigens, either soluble or membrane-bound, by quantifying changes in the levitation height of capture beads with fixed densities.

القياس الكمي للكثافة الخلوية والخصائص المضادة للجينات باستخدام الارتفاع المغناطيسي

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...