وأيد هذا العمل من قبل التمويل الأساسي من مجلس البحوث الطبية. نحن ممتنون لكريغ نيكول لإعداد الرسومات الفنية. نحن ممتنون لماثيو بيرسون وبول بيري لدعم التصوير الخاصة بهم.

تم تنفيذ جميع الأعمال في الحيوان فقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية بموجب ترخيص من قبل وزارة الداخلية في المملكة المتحدة (رقم الترخيص المشروع PPL 60/3785 و60/4424). 1. إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية melanoblasts في الجلد النامية من خلال الجمع بين لجنة المساواة العرقية-recombinase معربا عن خط الماوس المناسبة مع مراسل خط الماوس الفلورسنت. صور :: بجمعية العقارات، صور :: CREB 8 و 14 لجنة المساواة العرقية Wnt1 :: استخدمت بنجاح كخطوط لجنة المساواة العرقية، معربا عن و R26YFPR 9 كخط المراسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مستنبت في غطاء تدفق الصفحي؛ تكملة Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) مع (1٪ ت / ت البنسلين / الستربتوميسين)، و 10٪ ت / ت مصل العجل الجنين و0.584 جم / L L-الجلوتامين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويرد جهاز التصوير الحي في الشكل 1 تعقيم قاعدة غرفة التصوير بواسطة مسح أسفل مع الايثانول 70٪. تعقيم إدراج، ومقاطع التصوير، والحلقات التي تمرغ اوفernight في الايثانول 70٪. استخدام غطاء العقيمة من لوحة 6 كذلك غطاء للغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السطح السفلي من غرفة التصوير تتكون من غشاء مرتبك الذي عقد في مكان من قبل يا الدائري (الشكل 1). تبدأ مع 35 ملم الغاز طبق مرتبك قابلة للاختراق. وضع الطبق على غرفة التصوير وقطع غشاء نفاذية الغاز مع واحد شفرة حلاقة ذو حدين. دفع يا الدائري على الغشاء لضمان الحصول عليها إلى غرفة التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقطات التصوير (6 في المجموع) المشبك الجلد الجنينية في مكان (الشكل 1) قبل الاستخدام يجب أن تكون مليئة 1٪ الاغاروز. إعداد محلول 2٪ من الاغاروز مع DH 2 O معقمة بواسطة الميكروويف والتبريد إلى 60 درجة مئوية. مزيج 01:01 مع 10 مل مستنبت (راجع الخطوة 2) مسخن إلى 60 درجة مئوية. الوقوف لقطات التصوير في 6 العقيمة لوحة 6 جيدا. بالتنقيط الحل الاغاروز 1٪ في وسط كل مقطع باستخدام pastette غرامة والسماح لتبرد. إضافة 1 مل PBS الباردة العقيمة إلى كل بئر لمنع وgarose من الجفاف. يمكن تخزين مقاطع التصوير لعدة ساعات في برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتنفيذ الفصل حساسة من الجلد الجنينية وللتعامل مع الأنسجة تشريح استخدام &#39;طريقة عصا الشعر &quot;كما هو موضح في كاشيواغي وآخرون. 3 بدلا من استخدام عود ويمكن استخدام سيخ كباب الخيزران. جعل فتحة صغيرة في نهاية شقة للسيخ واحد باستخدام شفرة حلاقة ذو حدين وإدراج فرشاة أسنان ناعمة الشعر الخشن. تقليم سيخ بحيث يكون ما يقرب من 15 سم في الطول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المجهر متحد البؤر البيئية مع غرفة كاملة أو مرحلة أعلى الغرفة توفير 5٪ CO 2 في الهواء. Prewarm المرحلة المجهر إلى 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة على الأقل قبل التصوير. هذا يساعد على منع الانجراف العينة الناجمة عن التوسع في مكونات المرحلة لأنها الاحماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد مجموعة متعددة الموقف باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة المجهر بحيث يمكن للمرء أن بسرعة وسهولة تركز على منتصف كل ثقافة لاقامة التجربهر. </li></ol> 2. الإجراءات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتزاوج الفئران وتعيين آخر اليوم الأول coitum كما E0.5 اليوم. في E14.5 اليوم، اعدام الأنثى من قبل خلع عنق الرحم وفضح تجويف الجسم عن طريق إجراء شق خط الوسط الصغيرة، وسحب الجلد بعيدا نحو الرأس والذيل ثم قطع الصفاق الكامنة وتدوي مرة أخرى إلى جانبي الجسم. تشريح الرحم في برنامج تلفزيوني العقيمة الباردة من خلال عقد بحزم مع ملقط والقص على طول مسراق الرحم باستخدام مقص جراحي. الحفاظ على الرحم على الجليد حتى المطلوبة. للحصول على وصف مفصل نرى شيا وآخرون (2007) 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الأجنة من الرحم عن طريق قطع أول طول جدار الرحم مع مقص جراحي للافراج عن الساقط ومن ثم تشريح الأجنة من الساقط عن طريق سحب بينهما مع اثنين من أزواج من ملقط غرامة. الشاشة لالفلورسنت التعبير مراسل (إذا لزم الأمر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعدام بقطع الرأس الأجنة قبل تشريح. الغواصاتequently إزالة الذيل والأطراف وهند ثم الأمامية باستخدام شفرة حلاقة واحدة حدين. تحتفظ الأنسجة لالتنميط الجيني إذا لزم الأمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق في ventrum على مقربة من خط الوسط في اتجاه rostro-الذيلية. باستخدام العصي الشعر هو موضح في الخطوة 1.6، ندف بعناية بعيدا الجلد من الأنسجة الضامة الأساسي الدورية الجنين في نفس الوقت. لا تقم بإزالة الجلد تماما ولكن بدلا من ترك الأمر تعلق على طول أبعد حافة بطني من شق أولا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من المهم عدم السماح للالجلد يصبح سكران كما هو ثم من الصعب جدا لتركيب. لمنع هذا، تتسطح من الجلد باستخدام العصي الشعر (الجانب الجلد لأعلى) على سطح طبق بتري جاف ثم قطع بعيدا عن جذع الجنين باستخدام شفرة حلاقة واحدة حدين. ويمكن التمييز بين الجانب الجلد من الجانب البشرة عن طريق رصد دقيق من مفترق الطرق بين الأنسجة تشريح والجنين قبل أن يتم إزالة الجلد. مجال الأنسجة تشريح هوما يقرب من 0.5 مم 2 عند تشريح الجنين E14.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مقطع التصوير على أعلى من الجلد بحيث الاغاروز لمس الجانب الجلد من الأنسجة. السماح للوقوف لمدة 60 ثانية ثم بعناية ندف حواف الأنسجة تصل الجانبين من مقطع. عكس كليب واستخدام العصي لشد الشعر من الجلد وإزالة أي فقاعات الهواء، مع الحرص على تلمس سطح الأنسجة (في المنطقة التي سيتم تصويرها) أقل قدر ممكن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الحرير خيوط الجروح لادراك التعادل في الجلد لمقطع التصوير باستخدام الإبهام وهما عقدة بسيطة على جانبي مقطع التصوير بحيث تشديد وسحب الجلد في أخدود بالقرب من الجزء العلوي من مقطع. عكس كليب، ودفع داخل إدراج التصوير ومكان في القاعدة. الخطوط العريضة تملأ إدراج مع ~ 5 مل من مستنبت (انظر الخطوة 1.2). الشكل 1 تجميع غرفة التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكرار بروتوكول ل5 عينات المتبقية. </li></ol> 3. لايفالتصوير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غرفة التصوير لديه نفس أبعاد كمعيار لوحة 6 جيدا. استخدام لوحة إدراج المناسبة لتركيب غرفة على مسرح المجهر متحد البؤر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مطلوب مرحلة الآلي لصورة الثقافات في نفس الوقت. تحديد المواقف ستة لصورة في برنامج متحد البؤر. وسوف تعتمد على الضبط الدقيق على قدرة المجهر المستخدمة. وعادة ما تستخدم لض المكدس صغيرة (3-5 مناصب ض لحساب أي مرحلة الانجراف) في كل من مناصب 6 واستولت على ض المكدس كل 2 دقيقة ل 18-24 ساعة. للتطبيقات الحية التصوير فإنه من المفيد عموما لاستخدام أوسع من الإعداد الأمثل الثقب بصريا للحد من قوة الليزر وعدد من المقاطع ض المطلوبة. </li></ol>

<ol>
	<li>Thomas, A. J., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+a+melanocyte:+the+specification+of+melanoblasts+from+the+neural+crest.">The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).</li><li>Mayer, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+migratory+pathway+of+neural+crest+cells+into+the+skin+of+mouse+embryos.">The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos.</a> Developmental Biology. 34 (1), 39-46 (1973).</li><li>Kashiwagi, M., Huh, N., Turksen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organ+Culture+of+Developing+Mouse+Skin+and+Its+Application+for+Molecular+Mechanistic+Studies+of+Morphogenesis.">Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis.</a> Epidermal Cells: Methods and Protocols. 289, 39-45 (2005).</li><li>Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+inhibition+of+hair+follicle+formation+by+epidermal+growth+factor+in+an+organ+culture+of+developing+mouse+skin.">Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin.</a> Developmental Biology. 189 (1), 22-32 (1997).</li><li>Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modified+ex+vivo+skin+organ+culture+system+for+functional+studies.">A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies.</a> Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).</li><li>Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+live+imaging+of+melanoblast+migration+in+embryonic+mouse+skin.">Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin.</a> Pigment Cell &amp; Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).</li><li>Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MGF+(KIT+ligand)+is+a+chemokinetic+factor+for+melanoblast+migration+into+hair+follicles.">MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles.</a> Developmental Biology. 225 (2), 424-436 (2000).</li><li>Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre-mediated+recombination+in+the+skin+melanocyte+lineage.">Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage.</a> Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).</li><li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus.">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac1+Drives+Melanoblast+Organization+during+Mouse+Development+by+Orchestrating+Pseudopod.">Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod.</a> Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).</li><li>Li, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activated+Mutant+NRas(Q61K)+Drives+Aberrant+Melanocyte+Signaling,+Survival,+and+Invasiveness+via+a+Rac1-Dependent+Mechanism.">Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).</li><li>Schachtner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+inducible+Lifeact+expression+allows+visualization+of+actin+dynamics+in+vivo+and+ex+vivo.">Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo.</a> European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).</li><li>Ma, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fascin+1+is+transiently+expressed+in+mouse+melanoblasts+during+development+and+promotes+migration+and+proliferation.">Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation.</a> Development. 140 (10), 2203-2211 (2013).</li><li>Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+gene+activity+in+mouse+embryos+in+utero+by+a+tamoxifen-inducible+form+of+Cre+recombinase.">Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase.</a> Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).</li><li>Shea, K., Geijsen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection+of+6.5+dpc+mouse+embryos.">Dissection of 6.5 dpc mouse embryos.</a> Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

نحن تصف طريقة لثقافة الجلد الجنينية التي هي قابلة خصوصية التصوير للعيش الخلية على المجاهر مبائر مقلوب. يتضمن الأسلوب التحسينات الأخيرة التي تسمح لل6 الثقافات ليمكن تصوير بالتوازي ويزيل الاعتماد على matrigel والأغشية Nuclepore الأسلوب الأصلي 6. الفرق الفنية الحاسمة من ...

وقد تم استزراع الجلد الجنينية تقليديا من قبل تشريح الجنين من الماوس وتصاعد على Nuclepore غشاء البولي. ثم يتم طرح الغشاء على مستنبت، وبالتالي الحفاظ على واجهة الهواء السائل عبر السطح من الأنسجة النامية 3،4. وقد استخدمت هذه التقنية لفحص سلوك أرومة ميلانينية عن طريق تحديد الأنسجة وتقييم توزيع أرومة ميلانينية باستخدام β-غالاكتوزيداز كعلامة 7. قمنا بتطوير طريقة تسمح melanoblasts المسمى الحية التصوير fluorescently في فيفو السابقين الثقافة الجلد 6. نحن هنا وصف الأسلوب في التفاصيل من تشريح، لإعداد، ليعيش التصوير متحد البؤر وتشمل بعض التحسينات الأخيرة. Melanoblasts هي السلائف الجنينية من الخلايا الصباغية، والخلايا التي تنتج الصبغة في الشعر والجلد. تنشأ Melanoblasts في قمة العصبية المتاخمة للالأنبوب العصبي الجنيني في اليوم حوالي 9 (E9) في الماوس النامية البريدmbryo. في وقت لاحق تهاجر على طول الطريق بين ظهراني الأديم الظاهر وو somites النامية. في E12.5 ينتقلون من الأدمة إلى البشرة حيث تتكاثر ومواصلة هجرتهم. يبدأ نمط بصيلات الشعر الأولية لتشكيل في البشرة في E14.5 وmelanoblasts E15.5 وإضفاء الطابع المحلي لهذه المسام. لاستعراض تطوير أرومة ميلانينية / الصباغية رؤية توماس وإريكسون (2008) 1. من أجل تسمية السكان أرومة ميلانينية جمعنا :: صور حيوانات CREB التي تعبر عن لجنة المساواة العرقية-recombinase مدفوعا المروج الماوس التيروزينيز 8 مع الحيوانات R26YFPR التي تعبر عن بروتين فلوري الصفراء (YFP) مشروط من موضع ROSA26 9. نحن تصف طريقة لثقافة الجنينية الصور والتقاط الجلد باستخدام المجهر متحد البؤر مقلوب. وتكييفه شكل طريقة الأصلي وصفها في مورت وآخرون (2010) 6. الحاضرالأسلوب يسمح التصوير في شكل 6 جيدا ويزيل الاعتماد على الأغشية Nuclepore وعلى matrigel لدعم الثقافة. بدلا من ذلك باستخدام كتلة صغيرة من 1٪ الاغاروز لتحقيق الاستقرار في الجلد الجنينية. إزالة الاعتماد على matrigel أهمية خاصة في الحالات التي تكون فيها استجابة الجلد الجنينية لعوامل النمو للذوبان هو محور الدراسة. وقد تم بالفعل استخدام طريقة لدينا الأصلي للحصول على أفكار جديدة في تطوير أرومة ميلانينية 10-13 ونحن نتوقع أن التحسينات وصفنا هنا سوف جعلها أكثر قوة باعتبارها تقنية تجريبية خاصة حيث الثقافات المتعددة والمتوازية هي شرط.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="634">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM high glucose</td>
			<td style="width:132px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:119px;">F0475</td>
			<td style="width:167px;">without phenol red</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Streptomycin</td>
			<td style="width:132px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:132px;">Hyclone</td>
			<td style="width:119px;">SV30160.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Glutamax</td>
			<td style="width:132px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">35050-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Live imaging chamber</td>
			<td style="width:132px;">Custom made</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Lummox dishes</td>
			<td style="width:132px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">94.6077.410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">657-160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Single edged razor blade</td>
			<td style="width:132px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1244-3170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:132px;">Biogene</td>
			<td style="width:119px;">300-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fine pastette</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Kebab skewers</td>
			<td style="width:132px;">Waitrose</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bamboo BBQ skewers 30cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Toothbrush</td>
			<td style="width:132px;">Generic</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:132px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:119px;">633185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Suture thread</td>
			<td style="width:132px;">Look</td>
			<td style="width:119px;">SP115</td>
			<td>Black silk suture thread</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ex vivo culture of mouse embryonic skin and live-imaging of melanoblast migration

Melanoblasts هي قمة العصبية المشتقة من الخلايا الصباغية السلائف؛ الخلايا المسؤولة عن إنتاج الصباغ في الجلد والشعر. Melanoblasts تهاجر من خلال البشرة للجنين حيث استعمار في وقت لاحق من الشعر النامي بصيلات 1،2. ودرس قمة العصبية خلية الهجرة على نطاق واسع في المختبر ولكن في طرق الحي لا تزال غير متطورة، خاصة في أنظمة الثدييات. بديل واحد هو استخدام فيفو السابقين الثقافة عضوي النمط 3-6. ثقافة الماوس الجلد الجنينية يتطلب الحفاظ على واجهة الهواء السائل (علي) عبر السطح من 3،6 الأنسجة. وقد أعاق عالية الدقة الحية التصوير من الجلد الماوس الجنينية بسبب عدم وجود وسيلة جيدة أن يحافظ ليس هذا فقط ولكن يسمح ALI الثقافة لتكون معكوسة، وبالتالي متوافقة مع مسافة عمل قصيرة العدسات موضوعية والمجاهر معظم متحد البؤر أيضا. توضح هذه المقالة التحسينات الأخيرة لميثالتطوير التنظيمي الذي يستخدم غشاء نفاذية الغاز للتغلب على هذه المشاكل والسماح عالية الدقة مبائر التصوير من الجلد الجنينية في فيفو السابقين الثقافة 6. باستخدام أرومة ميلانينية محددة جنة المساواة العرقية، معربا عن recombinase خط الماوس جنبا إلى جنب مع خط مراسل R26YFPR ونحن قادرون على تسمية fluorescently السكان أرومة ميلانينية داخل هذه الثقافات الجلد. يسمح تقنية التصوير الحي للmelanoblasts ومراقبة سلوكهم والتفاعل مع الأنسجة التي تتطور. يتم تضمين نتائج ممثلة لإثبات القدرة على العيش، صورة 6 الثقافات في نفس الوقت.

ويبين الشكل 2 نتائج ممثلة من تجربة مرور الوقت باستخدام الجلد الجنينية من صور :: CREB س الأجنة R26YFPR في E14.5. تم تصوير 6 الثقافات الجلد الجنينية بواسطة المجهر متحد البؤر كل 2 دقيقة لمدة 18 ساعة. تم استخدام برامج مجانية تحليل الصور حزمة يماغيج لتحليل سلوك melanobl...

Watch this Scientific Journal Video about Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration at JoVE.com

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

وصفنا تشريح الجسم الحي وخارج ثقافة الماوس الجلد الجنينية. يحافظ على نظام الثقافة واجهة الهواء السائل عبر سطح الأنسجة ويسمح التصوير على مجهر مقلوب. Melanoblasts، وهو مكون من الجلد النامية، fluorescently المسمى السماح سلوكهم الواجب مراعاتها باستخدام متحد البؤر المجهري.

فيفو السابقين الثقافة من الفأر الجنينية بالبشرة والتصوير لايف للهجرة أرومة ميلانينية

Melanoblasts are the neural crest derived precursors of melanocytes; the cells responsible for producing the pigment in skin and hair. Melanoblasts ...

ex-vivo-culture-mouse-embryonic-skin-live-imaging-melanoblast

Research

JoVE Journal

Biology

Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

12.5K Views.  University of Edinburgh.  وصفنا تشريح الجسم الحي وخارج ثقافة الماوس الجلد الجنينية. يحافظ على نظام الثقافة واجهة الهواء السائل عبر سطح الأنسجة ويسمح التصوير على مجهر مقلوب. Melanoblasts، وهو مكون من الجلد النامية، fluorescently المسمى السماح سلوكهم الواجب مراعاتها باستخ?...

Video: Ex vivo Culture of Mouse Embryonic Skin and Live-imaging of Melanoblast Migration

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo (New Culture)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  the formation and patterning of brain, neural tube, somite and heart primordia. Applications of chick embryo culture include electroporation of DNA or RNA constructs in order to analyze gene function, grafts of growth factor coated beads such as FGFs and BMPs , as well as whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry. This video demonstrates the different steps in chick embryo culture; First, the embryo is explanted in saline. Then, the embryo is centered on a glass ring. The membranes surrounding the embryo are lifted along the walls of the ring. The ring is then placed in a culture dish containing a pool of albumine. The culture dish is sealed and placed in a humid chamber, where the embryo is cultured for up to 24 hrs. Finally, the embryo is removed from the ring, fixed and processed for further applications. A troubleshooting guide is also presented.

Method for Culture of Early Chick Embryos ex vivo New Culture

This video demonstrates New culture, a method by which chick embryos are cultured outside the egg for up to 24 hr. This method enables one to study early development (primitive streak to 14 som.), a period corresponding to E7-9 in mouse. Applications of this technique include electroporation, in situ hybridization and immunohistochemistry.

طريقة لثقافة الفرخ المبكر فيفو السابقين الأجنة (الثقافة الجديدة)

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons. While recent progress has been made to describe the live migration of glial cells in the developing pupal wing (1), studies of Drosophila glial cell migration have typically involved the examination of fixed tissue. Live microscopic analysis of motile cells offers the ability to examine cellular behavior throughout the migratory process, including determining the rate of and changes in direction of growth. Paired with use of genetic tools, live imaging can be used to determine more precise roles for specific genes in the process of development. Previous work by Silies et al. (2) has described the migration of glia originating from the optic stalk, a structure that connects the developing eye and brain, into the eye imaginal disc in fixed tissue. Here we outline a protocol for examining the live migration of glial cells into the Drosophila eye imaginal disc. We take advantage of a Drosophila line that expresses GFP in developing glia to follow glial cell progression in wild type and in mutant animals.

Here we describe a protocol to examine the migration of glial cells into the developing Drosophila eye using live microscopic analysis paired with GFP tagged glial cells.

يعيش التصوير للهجرة الخلايا الدبقية في القرص العين تخيلي ذبابة الفاكهة

Glial cells of both vertebrate and invertebrate organisms must migrate to final target regions in order to ensheath and support associated neurons.  While ...

Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the developing zebrafish brain (Gutzman et al, 2008). Such analysis affords a new understanding of the underlying cell biology required for development of the 3D structure of the vertebrate brain, and significantly increases our ability to study neural tube morphogenesis. The embryonic zebrafish brain is shaped beginning at 18 hours post fertilization (hpf) as the ventricles within the neuroepithelium inflate. By 24 hpf, the initial steps of neural tube morphogenesis are complete. Using the method described here, embryos at the one cell stage are injected with mRNA encoding membrane-targeted green fluorescent protein (memGFP). After injection and incubation, the embryo, now between 18 and 24 hpf, is mounted, inverted, in agarose and imaged by confocal microscopy. Notably, the zebrafish embryo is transparent making it an ideal system for fluorescent imaging. While our analyses have focused on the midbrain-hindbrain boundary and the hindbrain, this method could be extended for analysis of any region in the zebrafish to a depth of 
80-100 &mu;m.

In this video, we demonstrate a method by which to analyze the developing vertebrate brain in live zebrafish embryos at single cell resolution by confocal microscopy. This includes the method by which we inject the single-cell zebrafish embryo and subsequently mount and image the developing brain.

يعيش تصوير الدماغ الجنينية اسماك الزرد بواسطة الميكروسكوب متحد البؤر

In this video, we demonstrate the method our lab has developed to analyze the cell shape changes and rearrangements required to bend and fold the ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

يعيش تصوير ذبابة الفاكهة السوداء البطن هجرات كرية دموية الجنينية

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

نظام ل<em&gt; خارج الجسم</em&gt; التثقيف البنكرياس الجنينية

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to isolate and culture individual organs of interest are essential to provide a method of both visualizing changes in development and allowing novel treatment strategies. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel. This substrate provides enough support to maintain the three-dimensional structure but is flexible enough to allow continued contraction. In brief, hearts are excised from the embryo and placed in a mixture of cold Matrigel diluted 1:1 with growth medium. After the diluted Matrigel solidifies, growth medium is added to the culture dish. Hearts excised as late as embryonic day 16.5 were viable for four days post-dissection. Analysis of the coronary plexus shows that this method does not disrupt coronary vascular development. Thus, we present a novel method for long-term culture of embryonic hearts.

A Novel Ex vivo Culture Method for the Embryonic Mouse Heart

Developmental studies in the mouse are hampered by the inaccessibility of the embryo during gestation. To promote the long-term culture of the embryonic heart at late stages of gestation, we developed a protocol in which the excised heart is cultured in a semi-solid, dilute Matrigel.

رواية<em&gt; خارج الحي</em&gt; الطريقة الثقافة لالجنينية القلب

Developmental studies in the mouse are hampered  by the inaccessibility of the embryo during gestation. Thus, protocols to  isolate and culture individual ...

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are produced by differentiated thyrocytes, organized in closed spheres called follicles, while calcitonin is synthesized by C-cells, interspersed in between the follicles and a dense network of blood capillaries. Although adult thyroid architecture and functions have been extensively described and studied, the formation of the &#8220;angio-follicular&#8221; units, the distribution of C-cells in the parenchyma and the paracrine communications between epithelial and endothelial cells is far from being understood.
This method describes the sequential steps of mouse embryonic thyroid anlagen dissection and its culture on semiporous filters or on microscopy plastic slides. Within a period of four days, this culture system faithfully recapitulates in vivo thyroid development. Indeed, (i) bilobation of the organ occurs (for e12.5 explants), (ii) thyrocytes precursors organize into follicles and polarize, (iii) thyrocytes and C-cells differentiate, and (iv) endothelial cells present in the microdissected tissue proliferate, migrate into the thyroid lobes, and closely associate with the epithelial cells, as they do in vivo.
Thyroid tissues can be obtained from wild type, knockout or fluorescent transgenic embryos. Moreover, explants culture can be manipulated by addition of inhibitors, blocking antibodies, growth factors, or even cells or conditioned medium. Ex vivo development can be analyzed in real-time, or at any time of the culture by immunostaining and RT-qPCR.
In conclusion, thyroid explant culture combined with downstream whole-mount or on sections imaging and gene expression profiling provides a powerful system for manipulating and studying morphogenetic and differentiation events of thyroid organogenesis.

An Ex vivo Culture System to Study Thyroid Development

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

و<em&gt; خارج الحي</em&gt; نظام الثقافة لدراسة التنمية الغدة الدرقية

The thyroid is a bilobated endocrine gland localized at the base of the neck, producing the thyroid hormones T3, T4, and calcitonin. T3 and T4 are ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

نظام الثقافة الماوس الجنين الأمعاء الجامعة ل<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; التلاعب في مسارات إشارات وتصوير لايف ثلاثي الأبعاد التنمية الزغبة

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

قياس صلابة من<em&gt; فيفو السابقين</em&gt; ماوس Aortas باستخدام مجهر القوة الذرية

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin defense by forming an intact skin barrier against environmental insults, such as UVB irradiation or pathogens, and also by initiating an inflammatory response upon those insults. Here we describe methods to isolate KCs from neonatal mouse skin and from adult mouse tail skin. We also describe culturing conditions using defined growth supplements (dGS) in comparison to chelexed fetal bovine serum (cFBS). Functionally, we show that both neonatal and adult KCs are highly responsive to high calcium-induced terminal differentiation, tight junction formation and stratification. Additionally, cultured adult KCs are susceptible to UVB-triggered cell death and can release large amounts of TNF upon UVB irradiation. Together, the methods described here will be useful to researchers for the setup of in vitro models to study epidermal biology in the neonatal mouse and/or the adult mouse.

Epidermal keratinocytes form a functional skin barrier and are positioned at the front line of host defense against external environmental insults. Here we describe methods for isolation and primary culture of epidermal keratinocytes from neonatal and adult mouse skin, and induction of terminal differentiation and UVB-triggered inflammatory response from keratinocytes.

عزل وثقافة الكرياتينية الماوس الرئيسية من حديثي الولادة والفأر الكبار الجلد

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...