يسمح هذا البروتوكول بتصوير أجنة الفئران أثناء تطورها. وهذا يتيح دراسة تكوين القلب المبكر بالتفصيل. مثل التقاط صور ثابتة للأجنة المزيفة ، يتيح التصوير الحي الوصول الكامل لدراسة العملية الديناميكية في تطور الجنين.
من الصعب فهم المهارات المطلوبة لتصوير الحياة من النشر النصي فقط. مشاهدة شخص آخر يفعل ذلك أمر ضروري للتعلم. للبدء ، اقطع قطع سلك التنغستن بطول سنتيمتر واحد وشحذها إلى قطر 0.02 إلى 0.05 ملم عن طريق غمر طرف السلك في محلول نترات الصوديوم المشبع.
لتحضير الشعيرات الدموية الزجاجية المرفقة، ضع نقطة منتصف الشعيرات الدموية الزجاجية القياسية التي يبلغ طولها ملليمترا واحدا فوق ولاعة بنسن لمدة ثلاث إلى ست ثوان، مع السحب ببطء من كلا الطرفين حتى تصبح الشعيرات الدموية رقيقة ومرنة. بعد ذلك ، اكسر الشعيرات الدموية إلى نصفين وقم بتسخينها لفترة وجيزة لإنتاج 90 درجة ثني سنتيمترين من الطرف. رأيت قطعة من بولي ميثيل ميثاكريلات يبلغ طولها حوالي سبعة ملليمترات وعرضها أربعة ملليمترات وسمكها ملليمترين.
امسك قطعة الميثاكريلات باستخدام رذيلة مقاعد البدلاء ، ثم احفر ثقوبا مخصصة بشكل عرضي عبر القطعة بأكملها. قم بتدوير المثقاب ببطء أثناء الضغط المنخفض ولكن المستمر. استخدم ملفا جيدا لتنعيم حافة الحامل وضبط حجمه.
بالإضافة إلى ذلك ، قم بإنشاء منحدر خفيف على حواف الحامل لتسهيل وضع الجنين. ضع الحامل النهائي في طبق به ماء مقطر لشطفه. تحت المجهر الاستريو ، تحقق من الحامل لمعرفة ما إذا كانت الثقوب تحتوي على غبار حفر.
في حالة وجود غبار ، استخدم إبر التنغستن لإزالته. لتعقيم الحامل ، ضعه في أنبوب مخروطي مملوء بالماء المقطر وصوتنيكات لمدة 20 دقيقة مع خرج طاقة لا يقل عن 20 واط. استخراج الرحم من يوم الجنين الرحيم 6.75 إلى 7.5 الفأر الحامل ووضعه على ورقة جافة ونظيفة.
ثم ، قم بقطع الرحم ، وإدخال طرف المقص الناعم من الجانب mesometrial ، وتحريك الشفرة على طول لفضح decidui ، ونقلها إلى وسط التشريح. تشريح الأجنة ، والحفاظ على مخروط المشيمة الخارجية سليمة. ثم ، انزع غشاء الرايختر ، واترك جزءا منه في المنطقة الجنينية الإضافية.
للحفاظ على درجة حرارة التشريح المتوسطة ، استبدلها كل 10 دقائق. علاوة على ذلك ، قم بتشريح decidui في مجموعات من ثلاثة إلى أربعة مع الاحتفاظ بالباقي في وسط تشريح يوضع في حمام 37 درجة مئوية. ضع على الفور الأجنة تشريح في وسط الثقافة.
حدد الأجنة ذات الميزات الفلورية المطلوبة باستخدام مجهر ستيريو مضان وضعها في الأنبوب الذي يحتوي على وسط المزرعة في حاضنة زراعة الخلايا للتعافي لمدة ساعتين قبل التصوير. بعد تشغيل جميع مكونات المجهر ، بما في ذلك الكمبيوتر والبرامج والليزر ، قم بتشغيل وحدة التحكم في ثاني أكسيد الكربون واضبطها على 7٪ ضع قطرة من شحم السيليكون عالي الفراغ على طبق 35 ملم مع غطاء زجاجي منزلق القاع. ضع الحامل أعلى القطرة واضغط برفق لتثبيته.
لتركيب الجنين ، انقل جنينين إلى ثلاثة أجنة من الحاضنة إلى الطبق مع حامل. باستخدام زوج من الملقط وإبرة التنغستن مدببة ، ضع الأجنة في الثقوب. استخدم الإبرة لربط الجنين بواسطة مخروط المشيمة الخارجية وإدخاله في فتحة مطابقة للحجم.
انقل بعناية الطبق الذي يحتوي على الأجنة والحامل إلى لوحة المجهر. خفض الهدف حتى يتم تشكيل الغضروف المفصلي السائل في واجهة الهدف المتوسطة. بعد وضع الجنين في بؤرة التركيز ، قم بتركيب غرفة الحضانة وختمها حول الهدف باستخدام شريط لاصق.
باستخدام التقاط مباشر في برنامج التحكم المجهري ، اضبط إخراج الليزر ومستويات الكسب. ثم قم بتغطية الوسط بزيت البارافين عن طريق تقطيره ببطء على الهدف. إعداد تسجيل الفاصل الزمني.
اضبط فاصلا زمنيا من خمس إلى 10 دقائق مع مسافة Z من ثلاثة إلى خمسة ميكرون بين الأكوام. اترك مساحة فارغة أعلى Z-Stack لتوقع نمو الجنين. ما لا يقل عن 50 ميكرون ، إضافة 30 ميكرون لكل ساعة لن يتم الإشراف على الاستحواذ.
قم بتمكين خيار الحفظ التلقائي للسماح بالإشراف على الاستحواذ من جهاز كمبيوتر للسماح بتعديل حجم Z-Stack إذا لزم الأمر ، لتناسب مجال الاهتمام ضمن التركيز. يظهر نمو قلب الجنين الحي لكامل الجسم عن طريق التصوير متعدد الفوتونات. في اليوم الجنيني 7.5 ، يوجد مضان وريدي في جميع أنحاء الأديم الظاهر العصبي ، مع وجود عدد قليل من النوى الإيجابية في الأديم المتوسط الجنيني الإضافي.
بعد أربع ساعات ، تنشط الأسلاف البطانية الوريدية وتتجمع لتشكيل أنبوب الشغاف والشريان الأورطي الأساسي ، والتي تصبح هياكل مغلقة بعد سبع ساعات. كن حذرا أثناء إزالة غشاء الرايختر. يمكن أن يكون عالقا حقا في الجنين ، خاصة في مراحل الخجل.
أثناء الإزالة ، حاول قرصة الغشاء بواسطة المنطقة الجنينية الإضافية.
