يصف هذا البروتوكول طريقة سريعة وبسيطة لتوليد الصباغية الأولية والثقافات الخلايا الليفية من الفئران. لأن هذه التقنية لا تتطلب فصل البشرة والأدمة، يمكن أن يتم تنفيذها بسرعة وبشكل متسق مع الحد الأدنى من التدريب. يمكن استخدام هذه الطريقة لدراسة الخلايا الصباغية الجلدية والأحياء الليفية.
يمكن أن توفر التجارب في هذه الثقافات رؤى ذات صلة بالسرطان، وتضميد الجراح، وعيوب التصبغ. قبل البدء، تأكد من إعداد جميع الكواشف اللازمة والتحقق من درجة حرارة حمام الماء. إذا كنت تخطط لمعالجة عدة عينات، راجع دليل قياس الكاشف في الجدول الأول.
إثبات هذا الإجراء سيكون براندون ميرفي، طالب دراسات عليا من مختبري. في مجلس الوزراء تدفق لارينار، لفة لفترة وجيزة جذع كل فأر القتل الرحيم في طبق بيتري عقيمة تحتوي على 70٪الإيثانول. إزالة الماوس من الإيثانول ووضعها في طبق بيتري عقيمة فارغة.
بعد ذلك، تعقيم مقص جراحي في 70٪ الإيثانول. استخدم هذه المقصات لعمل شق في الجلد على الجانب البطني من الجذع ، بدءًا من الرقبة والاستمرار في الذيل. باستخدام ملقط معقمة، قشر الجلد بعيدا عن جذع الماوس، وإزالة الأنسجة الدهنية الزائدة من الجانب الجلدي من الجلد.
وضع الجلد، الجانب الأدمة إلى أسفل، في طبق ستة بئر تحتوي على ثلاثة ملليلتر من 1X محلول مضاد للمضادات الحيوية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. ثم، قم بتشغيل مروحية الأنسجة وضبط الإعدادات إلى تلك المعروضة هنا.
تأكد من توخي الحذر عند تثبيت شفرة المروحية الأنسجة وعند تشغيل الجهاز. نقل الجلد، الجانب الأدمة إلى أسفل، إلى طبق مروحية الأنسجة العقيمة وتمرير الجلد تماما من خلال المروحية الأنسجة ثلاث مرات. بعد ذلك، نقل الجلد المتجانسة إلى أنبوب مخروطي معقم 15 ملليلتر يحتوي على ثلاثة ملليلترات من عازلة هضم الجلد.
باستخدام P1000 الصغيرة ماصة، مزيج التعليق الناتج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا بقوة 10 إلى 15 مرات. اِكب الأنبوب المخروطي و احتضن العينة في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، مع التأكد من عكس الأنبوب كل ثلاث إلى خمس دقائق. المقبل، الطرد المركزي الأنبوب في الدوار دلو يتأرجح في 750 مرات G في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق ل بيليه الخلايا في تجانس الجلد.
استخدام P1000 الصغيرة ماصة لإزالة ببطء وبشكل كامل العازلة هضم الجلد، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه. تأكد من التعرق قبالة جميع الجلد هضم العازلة. إذا كنت تواجه مشكلة، وغسل بيليه الخلية مع اثنين إلى ثلاثة مل من وسائل الإعلام الصباغي وتكرار الطرد المركزي وإزالة فائض الجلد هضم العازلة.
ثم resuspend تماما بيليه الخلية في ملليلتر واحد من وسائل الإعلام الميلانوسيت عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 15 إلى 20 مرة مع ماص P1000. نقل الحل الناتج إسقاط من الحكمة إلى جيد غير المصقول في طبق ستة جيدا يحتوي على ملليلتر واحد من وسائل الاعلام الصباغية. احتضان تجانس الجلد مطلي في حاضنة زراعة الأنسجة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 40 دقيقة.
بعد ذلك، نقل فائق الثقافة من الطبق غير المصقول إلى بئر واحد من الكولاجين المغلفة مسبقا ستة طبق جيدا. أضف G-418 إلى الوسائط، بحيث يكون التركيز النهائي 100 نانوغرام لكل ملليلتر. إضافة ملليلترين من وسائل الإعلام الليفية إلى بئر واحد من الطبق غير المصقول الذي يحتوي الآن على الخلايا الليفية الملتصية.
احتضان كلا الثقافات بين عشية وضحاها في حاضنة زراعة الأنسجة في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد 16 إلى 24 ساعة من الحضانة، بشكل منفصل التعرق وسائل الإعلام وأي حطام من كل ثقافة. غسل كل طبق مرتين باستخدام ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني لكل غسل.
ثم، إضافة ملليلترين من وسائل الإعلام الصباغية الطازجة إلى ثقافة الخلايا الصباغية وإضافة ملليلترين من وسائل الإعلام الليفية الطازجة إلى ثقافة الخلايا الليفية. في هذه الدراسة، يتم إنشاء الثقافات الليفية والميلانوسيت في وقت واحد من نفس عينة الجلد. عندما يتم وضع الجلد المتجانس في أول مرة، تظهر الوسائط غائمة.
ومع ذلك، بعد حضانة تكتلات الخلايا أكبر والخلايا الليفية المتمسك تصبح مرئية في الطبق. يتم نقل الخلايا غير المنضمة من الثقافة إلى طبق مغلف بالكولاجين وتعامل مع G-418. وينظر الخلايا الليفية التي قتلت من قبل G-418 العائمة في المتوسطة ثقافة الصباغية للأيام الخمسة المقبلة.
بعد أربعة إلى خمسة أيام في الثقافة ، تبدأ الخلايا الصباغية في اتخاذ نمط ظاهري متشعب مع حبيبات الميلانوسية. هذا النمط الظاهري لا يزال قائما على passaging، في حين يتم فقدان مجموعات من تلويث keratinocytes. يتم تأكيد نقاء الصباغية الناتجة والثقافات الليفية باستخدام تدفق الخلايا.
التعبير عن علامة الصباغية GP100 هو خاص بثقافات الصباغية، في حين أن علامة الخلايا الليفية، FSP1، وجدت فقط في الخلايا الليفية الأولية. السيطرة C59 خلايا الكيراتينوسيات هي الثقافات الوحيدة التي وصمة عار إيجابية لعلامة keratinocyte, K14. يتم إجراء تحليلات إضافية لتحديد المدة التي يستغرقها إنشاء الثقافات الصباغية المخصب.
تبدأ الخلايا الإيجابية GP100 في الظهور في اليوم الرابع وذروة بعد 10 أيام في الثقافة. يمكن استخدام هذا الإجراء لتوليد الصباغية بسرعة وثقافات الخلايا الليفية لمجموعة متنوعة من في المختبر وعالية الإنتاجية أومي.
