نشكر الدكتور مارتن روزنبرغ، الدكتور غاري تربلي، والدكتور كيث الخشب لدعم هذا العمل، والدكتور جيمس كالي لقراءة نقدية للمخطوطة. DLD، JM، HB، NM، AN، JC، وMU هم موظفون لشركة PROMEGA. MF، RJ، RA، وDA هم موظفون من MS Bioworks، LLC.

ملاحظة: بروتوكول التالية يمكن استخدامها مع أي الانصهار HaloTag وعلى أي خط الخلية الاختيار ستابلي أو عابر. لهذه الأمثلة، وسنقدم بروتوكولات لترنسفكأيشن عابرة للاندماج HaloTag في الخلايا HEK293T أو هيلا. لجميع التجارب، ونحن نوصي استخدام عنصر التحكم البروتين فقط. 1. فيوجن التعبير البروتين اختبار <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على البروتين الانصهار بناء: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول مسبقة الصنع HaloTag الانصهار ناقلات أو إنشاء باستخدام ناقلات القائم. لمزيد من المعلومات حول ثوابت المتاحة، يرجى الاطلاع جدول الكواشف محددة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا جعل أي استنساخ، فمن المستحسن أن تسلسل التحقق من الحمض النووي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار تعبير عن انصهار بروتين والسيطرة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل عينة، وإعداد 250 ميكرولتر من 1X SDS صبغ تحميل العازلة (60 ملي تريس pH6.8 HCL، برموفينول 0.75 ملي الأزرق، 12.5٪ الجلسرين، و 100 ملي dithiothreitol، 0.5٪ SDS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل انصهار بروتينوتحكم، لوحة 0.5 مل من HEK293T أو خلايا هيلا في وسائل الإعلام على النحو المناسب في مناطق ذات كثافة من 2-4 × 10 5 خلية / مل في معيار 24 لوحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 18-24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2، ثم بالنقل النحو الموصى به. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، إضافة 0.5 ميكرولتر من 5MM رباعي الميثيل رودامين (TMR) يجند إلى وسائل الإعلام من كل بئر وتخلط بلطف لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل تحتوي يجند لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح قبالة سائل الإعلام التي تحتوي يجند وغسل كل بئر من الخلايا برفق مع 1 مل PBS RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح قبالة PBS وإجراء غسيل الثانية مع 1 مل PBS RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 200 ميكرولتر من 1X العازلة SDS تحميل الصبغة مباشرة إلى الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة المحللة من لوحة إلى 1.5 مل أنبوب إيبندورف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغلي لمدة 5 دقائق المحللة في 95 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة 5-10 ميكرولتر من رد الفعل والحمل على هلام SDS-PAGE. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الماسح الضوئي الكشف الفلورسنت(TMR الإثارة: 555 نانومتر، الانبعاث: 585 نانومتر) لكشف العصابات. استخدام علامات بروتين فلوري عن المعايير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان الماسح الضوئي الكشف الفلوري غير متوفر، أداء البقع الغربية باستخدام أجسام مضادة ضد بروتين إما الطعم أو انصهار بروتين علامة للكشف عن التعبير عن بروتين الانصهار. </li></ol></li></ol> 2. Pulldowns البروتين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا عابر: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل الانصهار أو السيطرة إعداد واحد 15 سم الطبق مع 30 مل من الخلايا في 3-4 × 10 5 خلية / مل أو 1-1.2 × 10 7 خلايا الإجمالية لكل بناء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 18-24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2، ثم بالنقل بناء على النحو الموصى به. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 24-48 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وإزالة وسائل الإعلام وغسل بلطف طبقة الخلايا مع 20-25 مل من برنامج تلفزيوني الباردة الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة برنامج تلفزيوني يغسل، ثم يضاف 25-30 مل من 4 ° C برود برنامج تلفزيوني وكشط بلطف خلايا قبالة لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الخلايا في أنابيب مخروطية وcentriFUGE لمدة 5-10 دقيقة في 2،000 x ج و 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف ووضع بيليه خلية في -80 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة أو مدة أقصاها 6 أشهر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موازنة من الراتنج HaloLink: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل الانصهار أو السيطرة العينة، وإعداد 12 مل من الراتنج موازنة / غسل العازلة (100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 0.005٪ IGEPAL CA-630) ملاحظة: من المهم جدا لجعل واستخدام الراتنج موازنة العازلة في غضون 12 ساعة كما المخفف IGEPAL CA-630 ليست مستقرة أو فعالة خارج هذا الإطار الزمني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بلطف يهز أو مزيج الراتنج للحصول على تعليق موحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل تجربة المنسدلة، الاستغناء 200 ميكرولتر من الراتنج إلى 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 800 x ج (على سبيل المثال، 3،000 دورة في الدقيقة في microcentrifuge)، ثم إزالة بعناية وتجاهل طاف (الإيثانول) من دون إزعاج الراتنج في الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 800 ميكرولتر من الراتنج موازنة / واش العازلة ومزيج دقيق من قبل قلب الأنبوب عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 800 x ج، ثم إزالة بعناية وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 2.2.5 2.2.6 ومرتين أخريين ليصبح المجموع 3 يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لا تقم بإزالة غسل النهائي أو حتى طاف على استعداد لإضافة لست] الخلوية هو موضح أدناه (الخطوة 2.3.8) لمنع الراتنج من الجفاف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملزمة وغسل المجمعات الانصهار: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لكل عينة، وإعداد 500 ميكرولتر من الاحتياطي تحلل الثدييات (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1٪ تريتون X-100، 0.1٪ نا Deoxycholate) و 1 مل من 1X العازلة TBS (100 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.5 و 150 ملي مول كلوريد الصوديوم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد الكريات الخلايا و resuspend في 300 ميكرولتر من الثدييات الاحتياطي تحلل من قبل pipetting صعودا وهبوطا أو لفترة وجيزة vortexing ل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 6 ميكرولتر من 50X البروتياز كوكتيل المانع (800 ميكروغرام / مل benzamidine حمض الهيدروكلوريك، و 500 ميكروغرام / مل phenanthroline، 500 ميكروغرام / مل أبروتينين، 500 ميكروغرام / مل leupeptin، 500 &amp; #181؛ ز / مل pepstatin A، 50MM PMSF) ملاحظة: الكوكتيلات البروتياز التي تشمل AEBSF لا يمكن أن تستخدم هذه تتداخل مع بروتين الانصهار علامة ملزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 3 ميكرولتر الدناز RQ1 وعكس لمدة 10 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dounce مع الزجاج الخالط 2.0 مل حجم؛ 25-30 السكتات الدماغية على الجليد، أو تمرير الخلايا خلال 25 أو 27 إبرة G 5-10 مرات لاستكمال تحلل ملاحظة: لا ينصح صوتنة كما المجمعات قد ينهار والإفراط في التدفئة قد تؤثر على النشاط علامة البروتين الانصهار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 14،000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية لمسح المحللة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل المحللة واضحة، ما يقرب من 300 الحجم الإجمالي ميكرولتر، إلى أنبوب جديد ومكان على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة لمسح المحللة في 700 ميكرولتر من العازلة إضافية 1X TBS ومزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ أنابيب الراتنج معايرتها أعدت في الخطوة 2.2.8 وإزالة النهائي غسل / طاف من دون إزعاج الراتنج الراتنج في الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى كل تويكون من الراتنج، و1 مل من المحللة المخفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان مع الخلط على محور دوار أنبوب (أو خلاط لطيف) لمدة 15 دقيقة في 22 درجة مئوية. ملاحظة: توطين من الراتنج خلال هذا الوقت يقلل من كفاءة ملزمة. إذا ملزمة في 4 درجات مئوية هو المطلوب، أن تفعل ذلك عن طريق خلط لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي الراتنج لمدة 2 دقيقة في 800 XG وتجاهل طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الراتنج موازنة / غسل العازلة التي قدمت في الخطوة 2.2.1 ومزيج دقيق من قبل قلب الأنبوب الراتنج باليد عدة مرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي الراتنج لمدة 2 دقيقة في 800 XG وتجاهل غسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 2.3.12 2.3.14 تليها ثلاث مرات إضافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 1 مل من الراتنج موازنة / غسل العازلة واحتضان عند 22 درجة مئوية لمدة 5 دقائق مع دوران مستمر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنابيب الطرد المركزي الراتنج لمدة 2 دقيقة في 800 XG وتجاهل غسيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبعا التطبيق نهاية (انظر مقدمة لمزيد من التوضيح)، انتقل إلى القسم إما 2.4 أو 2.5. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SDS شطف لتغيير طبيعة المواد الهلامية، والبقع الغربي، أو قياس الطيف الكتلي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend والراتنج من كل عينة في 50 ميكرولتر العازلة SDS شطف (1٪ SDS و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك pH7.5) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يهز أنابيب في RT لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 800 x ج ونقل eluates لأنابيب جديدة للتحليل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لطخة غربية أو هلام الفضة وصمة عار، تحميل 5-10 ميكرولتر على تغيير طبيعة هلام SDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمطياف الكتلة، حفظ 40 ميكرولتر من كل عينة في -20 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TEV البروتياز شطف لفحوصات وظيفية، البقع الغربية، أو قياس الطيف الكتلي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إزالة غسل الماضي، resuspend والراتنج في 50 ميكرولتر العازلة ProTEV الانقسام و 30 وحدة من TEV الانزيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان عند 25 درجة مئوية مع الهز لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 800 × ز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل شطافة لأنابيب جديدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عينة تخزينها في 4 درجة مئوية لاستخدامها الفوري في المقايسات الفنية. </li></ol></li></ol> 3.التصوير الخلوية من Fluorescently صفتها البروتينات الانصهار باستخدام السيتوبلازم والنووية نافذ يجند <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنقل، والتسمية، وخلايا الصورة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في 8 ساترة غرف جيدا لكل البروتين الانصهار أو سيطرتها، لوحة 400 ميكرولتر من خلايا هيلا في وسائل الإعلام المناسبة في كل بئر في مناطق ذات كثافة من 1-2 × 10 5 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لمدة 18-24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2، ثم بالنقل النحو الموصى به. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 18-24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وتمييع 1:200 TMR يجند في وسائل الإعلام الخلوية المناسبة، ثم إضافة 100 ميكرولتر من هذا الحل إلى كل بئر وبلطف المزيج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل تحتوي يجند لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح قبالة سائل الإعلام التي تحتوي يجند واستبدالها مع 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام المناسبة التي تفتقر إلى البروتين الانصهار علامة يجند، الذي تم قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر مرتين ليصبح المجموع ثلاثة يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الخلايا مرة أخرى في حاضنة (376؛ مئوية و 5٪ CO 2) لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح قبالة الإعلام واستبدالها مع 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام المناسبة، والتي تم قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصورة على المجهر باستخدام المعلمات اقتناء المناسب (TMR الإثارة: 555 نانومتر، الانبعاث: 585 نانومتر). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Altelaar, A. F., Munoz, J., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+proteomics:+towards+an+integrative+view+of+proteome+dynamics.">Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics.</a> Nat Rev Genet. 14, 35-48 (2013).</li><li>Tyers, M., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+genomics+to+proteomics.">From genomics to proteomics.</a> Nature. 422, 193-197 (2003).</li><li>Coulombe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+networks+of+the+molecular+machines+that+decode,+replicate,+and+maintain+the+integrity+of+the+human+genome.">Interaction networks of the molecular machines that decode, replicate, and maintain the integrity of the human genome.</a> Mol Cell Proteomics. 3, 851-856 (2004).</li><li>Gavin, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+survey+reveals+modularity+of+the+yeast+cell+machinery.">Proteome survey reveals modularity of the yeast cell machinery.</a> Nature. 440, 631-636 (2006).</li><li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae.">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440, 637-643 (2006).</li><li>Sardiu, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probabilistic+assembly+of+human+protein+interaction+networks+from+label-free+quantitative+proteomics.">Probabilistic assembly of human protein interaction networks from label-free quantitative proteomics.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 1454-1459 (2008).</li><li>Domon, B., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+and+protein+analysis.">Mass spectrometry and protein analysis.</a> Science. 312, 212-217 (2006).</li><li>Daniels, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examining+the+complexity+of+human+RNA+polymerase+complexes+using+HaloTag+technology+coupled+to+label+free+quantitative+proteomics.">Examining the complexity of human RNA polymerase complexes using HaloTag technology coupled to label free quantitative proteomics.</a> J Proteome Res. 11, 564-575 (2012).</li><li>Encell, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+dehalogenase-based+protein+fusion+tag+capable+of+rapid,+selective+and+covalent+attachment+to+customizable+ligands.">Development of a dehalogenase-based protein fusion tag capable of rapid, selective and covalent attachment to customizable ligands.</a> Curr Chem Genomics. 6, 55-71 (2012).</li><li>Ohana, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag-based+purification+of+functional+human+kinases+from+mammalian+cells.">HaloTag-based purification of functional human kinases from mammalian cells.</a> Protein Expr Purif. 76, 154-164 (2011).</li><li>Black, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KDM4A+Lysine+Demethylase+Induces+Site-Specific+Copy+Gain+and+Rereplication+of+Regions+Amplified+in+Tumors.">KDM4A Lysine Demethylase Induces Site-Specific Copy Gain and Rereplication of Regions Amplified in Tumors.</a> Cell. 154, 541-555 (2013).</li><li>Deplus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TET2+and+TET3+regulate+GlcNAcylation+and+H3K4+methylation+through+OGT+and+SET1/COMPASS.">TET2 and TET3 regulate GlcNAcylation and H3K4 methylation through OGT and SET1/COMPASS.</a> EMBO J. 32, 645-655 (2013).</li><li>Galbraith, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF1A+Employs+CDK8-Mediator+to+Stimulate+RNAPII+Elongation+in+Response+to+Hypoxia.">HIF1A Employs CDK8-Mediator to Stimulate RNAPII Elongation in Response to Hypoxia.</a> Cell. 153, 1327-1339 (2013).</li><li>Collins, M. O., Choudhary, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+multiprotein+complexes+by+affinity+purification+and+mass+spectrometry.">Mapping multiprotein complexes by affinity purification and mass spectrometry.</a> Curr Opin Biotechno. 19, 324-330 (2008).</li><li>Collins, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+comprehensive+atlas+of+the+physical+interactome+of+Saccharomyces+cerevisiae.">Toward a comprehensive atlas of the physical interactome of Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 439-450 (2007).</li><li>Mellacheruvu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRAPome:+a+contaminant+repository+for+affinity+purification-mass+spectrometry+data.">The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data.</a> Nat Methods. 10, 730-736 (2013).</li><li>Dawson, M. A., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+epigenetics:+from+mechanism+to+therapy.">Cancer epigenetics: from mechanism to therapy.</a> Cell. 150, 12-27 (2012).</li><li>Jang, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bromodomain+protein+Brd4+is+a+positive+regulatory+component+of+P-TEFb+and+stimulates+RNA+polymerase+II-dependent+transcription.">The bromodomain protein Brd4 is a positive regulatory component of P-TEFb and stimulates RNA polymerase II-dependent transcription.</a> Mol Cell. 19, 523-534 (2005).</li><li>Rahman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Brd4+extraterminal+domain+confers+transcription+activation+independent+of+pTEFb+by+recruiting+multiple+proteins,+including+NSD3.">The Brd4 extraterminal domain confers transcription activation independent of pTEFb by recruiting multiple proteins, including NSD3.</a> Mol Cell Biol. 31, 2641-2652 (2011).</li><li>Yang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+P-TEFb+for+stimulation+of+transcriptional+elongation+by+the+bromodomain+protein+Brd4.">Recruitment of P-TEFb for stimulation of transcriptional elongation by the bromodomain protein Brd4.</a> Mol Cell. 19, 535-545 (2005).</li><li>Halley, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioluminogenic+HDAC+activity+assay:+validation+and+screening.">A bioluminogenic HDAC activity assay: validation and screening.</a> J Biomol Screen. 16, 1227-1235 (2011).</li><li>Mack, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=To+selectivity+and+beyond.">To selectivity and beyond.</a> Nat Biotechnol. 28, 1259-1266 (2010).</li><li>Daniels, D. L., Urh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+intracellular+protein--DNA+complexes+using+HaloCHIP,+an+antibody-free+alternative+to+chromatin+immunoprecipitation.">Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation.</a> Methods Mol Biol. 977, 111-124 (2013).</li><li>Urh, M., Rosenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag+a+Platform+Technology+for+Protein+Analysis.">HaloTag a Platform Technology for Protein Analysis.</a> Curr Chem Genomics. 6, 72-78 (2012).</li></ol>

وترعى رسوم النشر لهذه المادة من قبل شركة PROMEGA. دانيت L. دانيلز، جاكي منديز، هيلين Benink، أندرو نايلز، نانسي ميرفي وMarjeta Urh هم موظفون لشركة PROMEGA، صاحب التجارية بالتنازل عن براءات الاختراع للتكنولوجيا HaloTag وتطبيقاتها. مايكل فورد، ريتشارد جونز، رافي أمونوجاما، وديفيد ألين هم موظفون من MSBioworks، التي تقدم خدمات قياس الطيف الكتلي وصفها في هذه المخطوطة.

المقدمة هنا نوعان من البروتينات الانصهار، هالو هالو-BRD4 و-HDAC1، وتتميز في خلايا الثدييات حقيقية النواة للتعبير، والبروتين العزلة معقدة والنشاط، وتوطين الخلوية. في العمل من خلال هذه البروتوكولات المختلفة، وهناك العديد من الخطوات الهامة لنجاح كل تجربة. كما هو الحال مع أي انصهار بروتين، ومستوى التعبير ووضع العلامة نفسها يمكن أن تكون حاسمة للحفاظ على وظائف الأعضاء. ولذلك فمن المهم أن نرى أن N-و / أو اندماج-C محطة سوف تحتاج إلى أن تكون مصممة إذا لم يثبت علم مسبق أو العمل مع علامة أخرى للبروتين معين في الاختيار. بخصوص التعبير، إذا كان مستوى مرتفع جدا، التخفيف من الحمض النووي يمكن أن يؤديها خلال ترنسفكأيشن أو استخدام ناقلات مع المروجين أضعف وممكن لتحقيق المستوى المناسب. وقد تم العمل السابقة تظهر العزلة كفاءة من المجمعات الجزيئات أجريت في الذاتية جنيهVELS التعبير 8، مما يتيح العمل على مستويات منخفضة جدا من التعبير. إذا كان ذلك ممكنا، فإن الدراسات توطين الخلوية أيضا أن تكون قادرة على تقديم فكرة عن الموقف الأمثل موضع العلامة وكذلك مستوى التعبير النسبية اللازمة لعلم وظائف الأعضاء المناسبة. مرة واحدة البروتينات الانصهار مستعدون للتجارب المنسدلة، للحصول على أقصى قدر من النجاح مع بروتوكول فمن المهم جدا اتباع الأطر الزمنية الموصى بها في تحلل، ملزمة، وأقسام الغسيل، باعتبارها واحدة من أكبر مزايا هي سرعة العزلة معقدة العملية. إذا تطول في الوقت المناسب أي من هذه الخطوات، مثل والمطلوبة لطريقة التقاط القائم على الضد، هناك خطر تفارق معقدة أو زيادة ملزمة 8 غير محددة. وبالمثل إذا تم تقصير مرات خلال تحلل الخلوية أو ملزمة، والخلايا قد لا تكون هي lysed تماما أو أسروا بكفاءة على التوالي. إذا كان عدد من يغسل هو decrخففت أو لا يحدث خلط جيدة من الراتنج خلال يغسل ملزمة أو، ثم سيتم زيادة مستويات الخلفية للبروتينات غير محددة. أيضا، وسيلة للتحلل من المهم جدا كما تتعلق كفاءة ملزمة لالراتنج. سوف محاولات ليصوتن العينات، وإزالة المنظفات الموصى بها، إضافة SDS أو المنظفات القوية الأخرى، و / أو تشمل AEBSF مثبط البروتياز يؤدي إلى انخفاض أو فقدان ملزم البروتينات الانصهار والمجمعات لالراتنج. الأساليب القائمة لعزل معقدة من خلايا الثدييات والإنسان البروتين النضال التحليل مع التحدي المتمثل في الحد من خلفية في تحليل الطيف الكتلي 16. وقد كان هذا من الأهمية بمكان أن مستودع من البروتينات تلويث تم إنشاؤها من قبل العديد من الجماعات مطياف الكتلة 16. الخلفية في عينات مطياف الكتلة المنسدلة يمكن تعريفها بأنها أي شيء مما يمنع تحديدinteractors الحقيقي للبروتين الطعم. على هذا النحو، يمكن أن تنشأ من الخلفية تلويث البروتينات غير محددة أو أيضا على تركيزات كبيرة من البروتين الطعم أو الأجسام المضادة المستخدمة لترسيب بروتينات الطعم. وقد تم عمل كبير في تحسين كل من بروتوكول المنسدلة المقدمة هنا وكذلك الراتنج لتقليل مستوى البروتينات تلويث غير محددة في عملية المنسدلة. هذا هو واضح في المواد الهلامية وصمة عار الفضة وتحليل الطيف الكتلي لعنصر التحكم (الشكل 2). لمعالجة مستويات عالية من البروتين الطعم أو الأجسام المضادة التي يمكن أن تكون ضارة على قدم المساواة مع الملوثات ومع المنهجيات الأخرى التي النضال، ينصح المنسدلة مع SDS شطف (القسم بروتوكول 2.4). ويرجع ذلك إلى التعلق التساهمية إلى الراتنج، وهذه العملية سوف يترك الغالبية العظمى من البروتين الانصهار انطلاق المرفقة تساهميا إلى الراتنج. ويلاحظ وجود نسبة صغيرة من الطعم في تحليل الطيف الكتلي، الذي يعتقدأن يحدث من خلال التحلل، لكنه لا يمثل مشكلة للكشف عن التفاعلات الأخرى أضعف أو عابرة 8. كما ذكر في المقدمة، تم تفعيل تقدما كبيرا في البروتينات بواسطة تقدما كبيرا في مطياف الكتلة 1،7. وبالتالي، فمن المهم تسليط الضوء على المعالم الهامة للاختيار تحليل الطيف الكتلي لdeconvolute خليط من البروتينات التي تم الحصول عليها في pulldowns. يجب أن تكون الأجهزة قوية وقادرة على روتيني وكفاءة تحليل العينات التي تحتوي على كمية صغيرة من البروتين، وغالبا ما تكون أقل من &lt;1 ميكروغرام. وعادة ما تستخدم اللوني النانوية تنطوي 50-75 ميكرومتر أعمدة القطر HPLC الداخلية مع معدلات التدفق في 100-300 NL / دقيقة مجموعة من أجل التوافق مع أحجام عينة صغيرة وتعظيم حساسية مطياف الكتلة. لتحقيق أقصى قدر من المعلومات المكتسبة في حالة س تحليل واحدو في الطيف الشامل الفن قادر على الحصول على دقة عالية أطياف الشامل على نطاق الوقت متوافق مع فصل النانو المذكورة آنفا، ≥ 10 هرتز، وعادة ما يعملون. هذه الصكوك لديهم مستويات attomolar من الحساسية ويمكن الحصول على البيانات مع السلائف جزء في المليون الفرعية وايون المنتج التحمل الخطأ الشامل بشكل روتيني. تخدم هذه خصائص الأداء لزيادة الغلة من عدد من البروتينات التي تم تحديدها والثقة المرتبطة بتلك تحديد الهوية. مع هذه البيانات التي تثبت التعريب الفسيولوجية الخلوية، وبروتين المناسبة: تفاعلات البروتين جنبا إلى جنب مع القدرة على اكتشاف التفاعلات الرواية، وعزل جميع مجمعات نشاطا باستخدام بناء واحد. التكنولوجيات البديلة في الواقع يمكن استخدامها لكل من هذه الجوانب المختلفة، ولكن من المحتمل أن لا لجميع 23،24. مع التكنولوجيا HaloTag، يمكن أن تستخدم نهجا متعدد الوظائف، والنهوض proteomICS الدراسات والحصول على فهم أكثر اكتمالا وظيفة البروتين في خلايا الثدييات.

وتعادل معقد فهم وظيفة الخلوية، والاستجابة للمؤثرات، والتغيرات في الدول تطوير و / أو المرض للتخلص من الإلتواء من بروتيوم طوال هذه الدول ديناميكية مختلفة 1،2. وقد تم فعل الكثير لفهم بروتيوم من الكائنات أقل، ومع ذلك، وبالنظر إلى عدد من البروتينات وجميع التفاعلات الممكنة، وقد كان هذا تحديا كبيرا في التصدي للبروتيوم الإنسان 1،3-7. التقدم في مطياف الكتلة قد مكنت كثيرا من القدرة على إجراء هذه الدراسات، وهنا نقدم على النهوض إضافية وهامة مع تطور التكنولوجيا HaloTag لكلا القبض على كفاءة من المجمعات البروتين وتوصيف وظيفي للبروتينات بشرية من خلايا الثدييات 8-10. وقد تم مؤخرا أظهرت هذه التكنولوجيا في العديد من الدراسات أن يكون عاملا حاسما لاكتشاف التفاعلات الهامة، والسماح لنظرة ثاقبة وظيفة البروتين الرواية وunderstandiنانوغرام من المرض 11-13. وقد وضعت البروتين الانصهار HaloTag في البداية لمعالجة العديد من التحديات من الأكواد تقارب التقليدية والأجسام المضادة وعلاقتها التقاط البروتين، وتنقية، ووضع العلامات 8-10. في ما يقرب من جميع طرق لالتقاط البروتين وتنقية، وهناك خطوة التفاعل غير التساهمية التي تستخدم لتخصيب خاصة بروتين 14. خلال هذه الخطوة، يمكن للبروتين و / أو معقدة تنأى بسبب نشرها، خصوصا إذا كانت العملية تتطلب ساعات بدلا من دقائق لإكمال. لمعالجة هذا القلق، تم تصميم هذا البروتين الانصهار خصيصا للتفاعل بسرعة وبشكل لا رجعة فيه مع بروابط، والتي يمكن أن تكون إما الجزيئات، السطوح، أو fluorophores 9. ولمرة واحدة كان من المحتم أن يجند لها، إلا أنها تبقى ملزمة، والتي هي واحدة من أكثر العوامل التفريق بالمقارنة مع العلامات الأخرى تقارب. أظهرت أيضا هنا، هو القدرةلمعالجة المسائل البيولوجية المختلفة مع بناء واحد، وهو أمر ممكن بالتناوب بروابط 9 (الشكل 1). على سبيل المثال، لاستجواب تفاعلات البروتين أو وظيفة، وتستخدم بروابط السطح للقبض على البروتين أو المجمعات (الشكل 1). في تجربة منفصلة، ​​وهو نفس البروتين الانصهار يمكن fluorescently المسمى لدراسة توطين الخلوية، والاتجار، أو دوران البروتين (الشكل 1). من المهم أن نتذكر أنه بمجرد ولكن لا بد ليجند، سواء كان على سطح أو fluorophore، فإنه لا رجعة فيه، وبالتالي بروابط أخرى لا يمكن أن تكون ملزمة ثم في وقت لاحق في نفس التجربة. تحليل التكنولوجيات القائمة لرسم خريطة التفاعلات البروتين تكشف عن صعوبة لعزل بكفاءة تفاعلات محددة، بما في ذلك تلك التي هي أكثر عابرة أو هي في انخفاض فرة 1،6،7،14،15. أيضا، والعمل مؤخرا من قبل العديد من مجموعةو يظهر القلق أنه في غضون أساليب العزلة التقليدية، وخاصة في مجال تحليل البروتينات البشرية، وهناك عدد كبير من الملوثات البروتين الذي قد يخفي إشارات من interactors صحيحا في تحليل الطيف الكتلي 16. الخصائص المتقدمة للبروتين HaloTag وعنوانه شارك في تطوير الراتنج جيدا هذه المخاوف. لا يمكن أن يتحقق في بروتوكول لpulldowns معقدة (الشكل 1)، ملزم المجمعات في 15 دقيقة، كل من تعزيز القبض المعقدة والحد من مستويات ملزم غير محددة 8. بالإضافة إلى ذلك، ملزم لا رجعة فيه يسمح لالتقاط كفاءة من البروتينات وفرة منخفضة ويسمح لاستخدام عدد أقل بكثير من الخلايا، ومرة أخرى تخفيض خلفية 8. مرة واحدة يتم تأسيس القبض على المجمعات، ويشمل البروتوكول الظروف غسل خفيفة للحفاظ على سلامة المعقدة. شطف من المجمعات استولت يمكن القيام بها من قبل اثنين من الأساليب واختيار أي تمليه الأسلوب هدف الشرج المصبysis. إذا كانت هناك رغبة في تحليل أو اكتشاف البروتينات التفاعل من قبل لطخة غربية أو مطياف الكتلة، ثم فمن المستحسن أن أزل المجمعات مع denaturants مثل SDS أو اليوريا (الشكل 1). هذا أمر مفيد لقياس الطيف الكتلي مثل البروتين تنصهر في الأصل لHaloTag، ووصف البروتين الطعم، سيظل وراء منضمة إلى الراتنج وبالتالي لن تهيمن على السكان من الببتيدات الكشف في مطياف الكتلة. وهذا يعني أيضا أن البروتين ولكن الطعم من المحتمل أن لا تكون واضحة في تحليل لطخة غربية، أي بفارق كبير بالمقارنة مع غيرها من التنقيات تقارب غير التساهمية أو زملاء immunoprecipitations. إذا كان الهدف هو لتنقية مجمع سليمة لاستخدامها في الدراسات وظيفية، شطف يمكن القيام بها باستخدام TEV (التبغ إحفر الفيروسات) البروتيني، الذي يعترف به تسلسل الانقسام وما شابه ذلك المشفرة بين انصهار بروتين والبروتين الطعم (الشكل 1). Tويمكن أيضا أن يتم تحليل العينات ذات المناظر بواسطة مطياف الكتلة، ولكن كما هو موضح في وقت لاحق، وسوف تحتوي على كمية كبيرة من البروتين الطعم التي قد تحول دون الكشف عن وفرة أقل، interactors محددة. هنا نقدم المنسدلة والتصوير بروتوكولات تطبيقها على اثنين من البروتينات العلاجية الهامة، البروتين bromodomain BRD4 وdeacetylase هيستون، HDAC1 17. أظهرنا مع هذه الأمثلة، والتفاعل مع الشركاء المتوقع على النحو الذي يحدده قياس الطيف الكتلي، النشاط الأنزيمي بعد العزلة معقدة لHDAC1، وتوطين الخلوية المناسبة لكليهما. معا، وهذه النتائج تدل على طبيعة متعددة الوظائف وقوة التكنولوجيا لتوصيف التفاعلات البروتين وحيد الخلية ووظيفتها.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="924">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:337px;">HeLa Cells</td>
			<td style="width:204px;">ATCC</td>
			<td style="width:103px;">CCL-2</td>
			<td style="width:280px;">Adherent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEK293T Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td style="width:280px;">Adherent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellular growth media</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS - tissue culture certified</td>
			<td>Invitrogen/Gibco</td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FuGENE HD Transfection Reagent</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2311</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag Control Vector</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6591</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag-BRD4</td>
			<td>Kazusa DNA Research Institute</td>
			<td>FHC11882</td>
			<td style="width:280px;">N-terminal HaloTag fusion</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag-HDAC1</td>
			<td>Kazusa DNA Research Institute</td>
			<td>FHC02563</td>
			<td style="width:280px;">N-terminal HaloTag fusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HaloTag Clones containing content</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Various</td>
			<td style="width:280px;">http://www.promega.com/FindMyGene/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HaloTag Flexi Vectors for cloning (N- or C-terminal)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>Various</td>
			<td style="width:280px;">Choose based upon expression level and HaloTag orientation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag TMR Ligand</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G8251</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">IGEPAL CA-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>18896</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag Mammalian Pull-Down and Labelling System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6500</td>
			<td style="width:280px;">Contains HaloTag TMR ligand</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag Mammalian Pull-Down System</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6504</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Protease Inhibitor Cocktail, 50X</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6521</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mammalian Lysis Buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9381</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloTag Monoclonal Antibody</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G9211</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ProTEV Plus</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V6101</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RQ1 Dnase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M6101</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HaloLink Resin</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>G1912</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HDAC-Glo</td>
			<td>Promega</td>
			<td>G6420</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS + 0.1% Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;">For optional imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4% paraformaldehyde/0.2M sucrose/PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;">For optional imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tissue culture vessels and dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable cell lifter</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>08-773-1</td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;">Glass homogenizer such as Kontes Dounce Tissue Grinder</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>K885300-0002</td>
			<td style="width:280px;">25-to 27- gauge needle could also be used</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tube rotator such as Labquake</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4002110Q</td>
			<td style="width:280px;">Ideal for binding and washing steps</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Shaking platform such as Eppendorf Thermomixer</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-400-200</td>
			<td style="width:280px;">Ideal for SDS elution and TEV cleavage steps</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chambered cover glass</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>155409</td>
			<td style="width:280px;">For optional imaging</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescent Microscrope (555nm Ex/585nm Em)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:280px;">For optional imaging</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discovering protein interactions and characterizing protein function using halotag technology

وقد انفجرت البحث في البروتيوميات في السنوات الأخيرة مع التقدم في قدرات مطياف الكتلة التي أدت إلى توصيف العديد من proteomes، بما في ذلك تلك من الفيروسات والبكتيريا والخميرة. في المقارنة، وتحليل بروتيوم الإنسان متخلفة، ويرجع ذلك جزئيا إلى العدد الكبير من البروتينات التي يجب دراستها، ولكن أيضا مدى تعقيد شبكات والتفاعلات هذه الحاضر. للتصدي على وجه التحديد تحديات فهم بروتيوم الإنسان، وقد وضعنا التكنولوجيا HaloTag للبروتين العزلة، قوية بشكل خاص لعزل المجمعات multiprotein والسماح التقاط أكثر كفاءة من التفاعلات و / أو البروتينات ضعيفة أو عابرة في وفرة منخفضة. HaloTag هو المشفرة وراثيا علامة انصهار بروتين، والمصممة لالتساهمية، محددة، والشلل السريع أو وضع العلامات البروتينات مع مختلف بروابط. الاستفادة من هذه الخصائص، وقد وضعت العديد من التطبيقات لخلايا الثدييات إلى الطابعإيزي ظيفة البروتين وهنا نقدم المنهجيات بما في ذلك: البروتين سحب هبوطا تستخدم لاكتشاف التفاعلات رواية أو المقايسات الفنية، وتوطين الخلوية. نجد مزايا كبيرة في سرعة، والنوعية، والتقاط التساهمية من البروتينات الانصهار إلى السطوح لتحليل البروتين بالمقارنة مع الأساليب التقليدية الأخرى غير التساهمية. ونحن لشرح هذه الأداة المساعدة واسعة من التكنولوجيا باستخدام اثنين من البروتينات جينية مهمة كأمثلة، البروتين bromodomain الإنسان BRD4، وdeacetylase هيستون HDAC1. هذه الأمثلة تبرهن على قوة هذه التكنولوجيا في تمكين اكتشاف التفاعلات التي تميز الرواية وتوطين الخلوية في حقيقيات النوى، والتي سوف تزيد معا فهم البروتينات وظيفية الإنسان.

عند العمل مع أي انصهار بروتين الجديدة، من المهم أن الاختبار الأول للتعبير عن أن بروتين بعد ترنسفكأيشن والتحقق من أن البروتين من الوزن الجزيئي المناسبة يتم إنتاجها أيضا. كما HaloTag البروتينات الانصهار fluorescently يمكن أن يكون وصفت تساهميا مع، بروابط كتيمة قابلة للاختراق أو تبعا التعريب، فمن الممكن لتحديد التعبير بسرعة من خلال تطبيق لست] الخلوية لتغيير طبيعة الكهربائي هلام تليها المسح على fluorimager. باستخدام بروتوكول موضح في القسم 1.2، التعبير عن هالو-BRD4 (189 دينار كويتي) وHaloTag وحده التحكم (السيطرة) ويلاحظ (34 دينار كويتي، الشكل 2A). كما ورد في البروتوكول، ويمكن أيضا أن يتم الكشف عن التعبير عن البروتينات الانصهار باستخدام البقع الغربية التقليدية مع الأجسام المضادة للHaloTag، أو إذا كانت متاحة، والأجسام المضادة للبروتين الطعم. إذا كان ذلك ممكنا، فمن المستحسن استخدام يجند الفلورسنت بدلا كما هو أكثر تحديدا وأسرع وأسهل رهان الكشف عن الأجسام المضادة، وكذلك كمية 10. بعد أن يتم التحقق من التعبير السليم كامل طول البروتين الانصهار، pulldowns البروتين يمكن أن يؤديها. هو مبين في الشكل 2B هي الفضة الهلام الملون من مكررات البيولوجية من هالو-BRD4 والسيطرة pulldowns مزال بواسطة SDS (القسم بروتوكول 2.4) والتي تثبت استنساخ عالية. تظهر المواد الهلامية وصمة عار الفضة يتم العثور على عدد كبير من البروتينات للتفاعل مع البروتين ومنخفضة جدا BRD4 الخلفية في السيطرة (الشكل 2B). كما ذكر في المقدمة، في هذه العملية من شطف، لن يتم مزال هالو-BRD4 من الراتنج أنها لا تزال ملزمة تساهميا. وبالتالي، ليس هناك عصابة كبيرة في هذا الوزن الجزيئي يجري الكشف عنها في وصمة عار الفضة (الشكل 2B) أو لطخة غربية (لا تظهر البيانات). لتحديد ما إذا كانت هذه البروتينات هي محددة لBRD4، تم إجراء قياس الطيف اللوني السائل الشامل (LC-MS/MS) على جخليط omplex تم الحصول عليها بعد SDS شطف. هو مبين في الشكل 2C هي التهم الطيفية وتطبيع عامل وفرة الطيفية (NSAF) قيم interactors معروفة من BRD4 18-20 جدت في هالو-BRD4 تحليل الطيف الكتلي. وفرة عالية من المكونات من pTEFb 18،20 وكذلك البروتين BRD9 19 تأكيد القبض محددة من المجمعات BRD4. كما تنبأ الفضة وصمة عار المواد الهلامية (الشكل 2B)، كما تم تحديد العديد من البروتينات الأخرى كما interactors المحتملة للBRD4 التي لم تراع في التحكم (لا تظهر البيانات). لأن هذه هي لم تكن معروفة سابقا، وأنها بحاجة إلى التحقق بشكل مستقل من قبل منهجيات أخرى لتأكيد ما إذا كان البروتين هو interactor لصحيحا، وإذا كان الأمر كذلك، وإذا كان مباشر أو غير مباشر المرتبطة BRD4. ويمكن أيضا أن تدرس مجمعات معزولة عن النشاط؛ أنه يوصي أزل المجمعات باستخدام البروتيني TEV (القسم بروتوكول 2.5) بحيث تحافظ functionaliتاي. في الشكل 3A، الفضة وصمة عار الجل المجمعات المنسدلة هالو-HDAC1 صدر من الراتنج باستخدام TEV البروتيني هو مبين. كما TEV البروتيني سوف يلتصق في منطقة رابط بين العلامة البروتين الانصهار والاندماج شريك له، كميات كبيرة من البروتين الطعم، في هذه الحالة HDAC1، ويلاحظ (الشكل 3A). لتحديد ما إذا كان هذا الكسر الواردة النشاط HDAC1، تم اختبار عينات TEV مزال في مقايسة HDAC الانارة، HDAC-جلو 21. كما هو مبين في الشكل 3B، وأظهرت عينات HDAC1 المنسدلة مستويات عالية من النشاط HDAC1 (العمود 1)، والتي كانت تحول دون وجه التحديد المانع HDAC المعروفة، ساها 22 (العمود 2). كما ضوابط لمزيد من إثبات خصوصية، لم يلاحظ أي تثبيط HDAC مع ذات الصلة المانع الأسرة sirtuin، EX-527 22 (العمود 3) وتم الكشف عن عدم وجود إشارة باستخدام العازلة وحدها دون العينة HDAC1 المنسدلة المضافة (العمود 4). وثمة عنصر هام من وظيفةالبروتيوميات القاعدة والمجمعات فهم، ومن فهم أيضا البروتين التعريب و / أو الاتجار. لأن هذه ثوابت نفس الانصهار يمكن fluorescently المسمى داخل الخلايا، ونحن مراقبة توطين وذلك باستخدام التصوير متحد البؤر. بعد بروتوكول في القسم 3، خلايا هيلا عابر مع Halo-BRD4 (الشكل 4A) وهالو-HDAC1 (الشكل 4B) وfluorescently المسمى مع يجند TMR وتصويرها. كما هو مبين في الأرقام 4A و 4B، سواء المترجمة إلى النواة كما هو متوقع 17. تظهر هذه البيانات أن وجود علامة لم يغير توطين الخلوية الفسيولوجية للشركاء الانصهار فيها. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51553/51553fig1highres.jpg" width="600" /> الشكل 1. تخطيطي المنسدلة البروتين وتطبيقات التصوير متحد البؤر. طريق كما<html> إنجل بناء العديد من التطبيقات لفهم وظيفة البروتين في خلايا الثدييات ممكنة. للجميع، وبناء هالة الانصهار إما ثابت أو عابر أعرب في خلايا الثدييات ملتصقة أو تعليق. لpulldowns البروتين معقدة، ثم يتم هي lysed الخلايا، يتم التقاطها المجمعات تساهميا على الراتنج، ومزال إما عن طريق شطف SDS (المسار الأيسر) أو انشقاق TEV (المسار الأيمن). ينصح SDS شطف للمضي قدما لتحليل الطيف الكتلي، في حين TEV انشقاق هو الأمثل لأداء التحليل الوظيفي. لتوصيف التعبير وتوطين الخلوية، والأحداث الاتجار، أو دوران البروتين، والخلايا الحية معربا عن البروتينات الانصهار وfluorescently المسمى ومزيد من التحليل على SDS PAGE المواد الهلامية أو باستخدام التصوير متحد البؤر. تتوفر كل من خلية بروابط الفلورسنت نفاذية أو غير منفذة تبعا للتوطين أو عرض تقديمي من البروتين الانصهار داخل الخلية. igure 2 &quot;FO: محتوى العرض =&quot; 6in &quot;سرك =&quot; / files/ftp_upload/51553/51553fig2highres.jpg &quot;العرض =&quot; 600 &quot;/&gt; الشكل 2. هالو-BRD4 البروتين التعبير، المنسدلة، وتحليل الطيف الكتلي. المواد الهلامية (A) A SDS PAGE يظهر التعبير عن هالو-BRD4 الانصهار البروتين، 189 دينار كويتي، وهالو انصهار بروتين علامة وحده، 34 دينار كويتي، والتحكم (السيطرة) في غضون المحللة الخلوية HEK293T المسمى مع TMR يجند (القسم بروتوكول 2.1). تم مسحها المواد الهلامية مع fluorimager للكشف، وكان يستخدم الفلورسنت الوزن الجزيئي علامة (B) والمواد الهلامية الفضة وصمة عار من مكررات البيولوجية لpulldowns من هالو-BRD4 والسيطرة عينات مزال مع SDS. يشار إلى الأحجام الوزن الجزيئي للهلام (C) التهم الطيفي (اللوحة اليسرى) وتطبيع العوامل فرة الطيفية (NSAF) القيم (اللوحة اليمنى) والتي تمثل البروتين الوزن الجزيئي للبروتينات التي تم تحديدها في تحليل الطيف الكتلي من مكررات البيولوجية من هالو- BRD4 والسيطرة. أظهرت هي بروتينات معروفة للتفاعل ثإيث BRD4، بما في ذلك مكونات pTEFb (CDK9 وأحذية ركوب T) 18،20، وكذلك BRD9 19. تم تحديد أي من هذه الببتيدات والبروتينات في السيطرة. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51553/51553fig3highres.jpg" width="600" /> الرقم 3. هالو-HDAC1 العزلة معقدة وتحليل النشاط. (أ) المواد الهلامية الفضة وصمة عار تبين عزل المجمعات هالو-HDAC1 والخلفية من السيطرة بعد انشقاق TEV (بروتوكول القسم 2.5). وصفت الفرقة البارزين HDAC1 (55 كيلو دالتون) والفرقة البروتيني TEV. يتم إنشاء HDAC1 مجانا من TEV انشقاق داخل رابط الأمثل بين HaloTag وHDAC1 تسلسل الانصهار بعد القبض على الراتنج (الشكل 1). (B) رسم بياني يبين نشاط HDAC1 العزلة معقدة العينات في الانارة الفحص deacetylase هيستون، HDAC- 21 بالشبكة. العمود 1 من الرسم البياني يبين عالية لevels النشاط HDAC الواردة مع عينات المنسدلة هالو-HDAC1 (HDAC1). العمود 2 يكشف هذا النشاط يمكن انخفضت تحديدا إضافة المانع HDAC، ساها 22، إلى عينات المنسدلة HDAC1. والضوابط، العمود 3 يوضح المانع deacetylase محددة لعائلة sirtuin، ولكن ليس HDACs، EX-527 22، لا تمنع النشاط HDAC1 والعمود 4 عروض لوحظ أي نشاط باستخدام العازلة وحدها. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51553/51553fig4highres.jpg" width="600" /> الشكل 4. هالو هالو-BRD4 و-HDAC1 التصوير متحد البؤر. يعيش خلية التصوير متحد البؤر من خلايا هيلا transfected مع هالو-BRD4 (A) أو هالو-HDAC1 (B) fluorescently المسمى مع TMR يجند. يقتصر (A) هالو BRD4 التعبير إلى النواة و (ب) هالو-HDAC1 التعبير هي في الغالب مجلس التوحيد الوطنىلير. الجانب الأيسر من لوحات هي قناة الفلورسنت والجانب الأيمن هو تراكب للقناة فلوري مع قناة مدينة دبي للإنترنت لكل منها. تم الحصول على الصور على المجهر متحد البؤر مجهزة 37 ° C + CO 2 غرفة البيئية باستخدام مجموعات التصفية المناسبة. أشرطة النطاق = 20 ميكرومتر.

Watch this Scientific Journal Video about Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology at JoVE.com

Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

التكنولوجيا HaloTag هي تقنية متعددة الوظائف التي أظهرت نجاحا كبيرا في عزل المجمعات البروتين كل صغيرة وكبيرة من خلايا الثدييات. نحن هنا تسليط الضوء على مزايا هذه التكنولوجيا مقارنة بالبدائل القائمة وتثبت فائدتها لدراسة جوانب عديدة من وظيفة البروتين داخل الخلايا حقيقية النواة.

اكتشاف بروتين تفاعلات البروتين وتميز وظيفة عن طريق HaloTag تكنولوجيا

Research in proteomics has exploded in recent years with advances in mass spectrometry capabilities that have led to the characterization of numerous ...

discovering-protein-interactions-characterizing-protein-function

Research

JoVE Journal

Biology

36.8K Views.  Promega Corporation.  التكنولوجيا HaloTag هي تقنية متعددة الوظائف التي أظهرت نجاحا كبيرا في عزل المجمعات البروتين كل صغيرة وكبيرة من خلايا الثدييات. نحن هنا تسليط الضوء على مزايا هذه التكنولوجيا مقارنة بالبدائل القائمة وتثبت فائدتها لدراسة جوانب عديدة من وظيفة ا?...

Video: Discovering Protein Interactions and Characterizing Protein Function Using HaloTag Technology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, preventing their identification and analysis through traditional biochemical methods such as co-immunoprecipitation. In this regard, the genetically encodable fluorescent proteins (GFP, RFP, etc.) and their associated overlapping fluorescence spectrum have revolutionized our ability to monitor weak interactions in vivo using F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET)1-3. Here, we detail our use of a FRET-based proximity assay for monitoring receptor-receptor interactions on the endothelial cell surface.

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

This protocol describes how to image protein-protein interactions using a FRET-based proximity assay.

التصوير البروتين البروتين التفاعلات في الجسم الحي</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

على البروتين MultiBac مجمع منصة الإنتاج في EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Budding Yeast Protein Extraction and Purification for the Study of Function, Interactions, and Post-translational Modifications

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously hard to disrupt. Here we describe the use of a bead mill homogenizer for the extraction of proteins into buffers optimized to maintain the functions, interactions and post-translational modifications of proteins. Logarithmically growing cells expressing the protein of interest are grown in a liquid growth media of choice. The growth media may be supplemented with reagents to induce protein expression from inducible promoters (e.g. galactose), synchronize cell cycle stage (e.g. nocodazole), or inhibit proteasome function (e.g. MG132). Cells are then pelleted and resuspended in a suitable buffer containing protease and/or phosphatase inhibitors and are either processed immediately or frozen in liquid nitrogen for later use. Homogenization is accomplished by six cycles of 20 sec&#160;bead-beating (5.5 m/sec), each followed by one minute incubation on ice. The resulting homogenate is cleared by centrifugation and small particulates can be removed by filtration. The resulting cleared whole cell extract (WCE) is precipitated using 20% TCA for direct analysis of total proteins by SDS-PAGE followed by Western blotting. Extracts are also suitable for affinity purification of specific proteins, the detection of post-translational modifications, or the analysis of co-purifying proteins. As is the case for most protein purification protocols, some enzymes and proteins may require unique conditions or buffer compositions for their purification and others may be unstable or insoluble under the conditions stated. In the latter case, the protocol presented may provide a useful starting point to empirically determine the best bead-beating strategy for protein extraction and purification. We show the extraction and purification of an epitope-tagged SUMO E3 ligase, Siz1, a cell cycle regulated protein that becomes both sumoylated and phosphorylated, as well as a SUMO-targeted ubiquitin ligase subunit, Slx5.

The preparation of high quality yeast cell extracts is a necessary first step in the analysis of individual proteins or entire proteomes. Here we describe a fast, efficient, and reliable homogenization protocol for budding yeast cells that has been optimized to preserve protein functions, interactions, and post-translational modifications.

مهدها الخميرة استخراج البروتين وتنقية لدراسة وظيفة، والتفاعلات، والتعديلات بعد متعدية

Homogenization by bead beating is a fast and efficient way to release DNA, RNA, proteins, and metabolites from budding yeast cells, which are notoriously ...

Protein-protein Interactions Visualized by Bimolecular Fluorescence Complementation in Tobacco Protoplasts and Leaves

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular fluorescence complementation (BiFC) is an in vivo method to monitor such interactions in plant cells. In the presented protocol the investigated candidate proteins are fused to complementary halves of fluorescent proteins and the respective constructs are introduced into plant cells via agrobacterium-mediated transformation. Subsequently, the proteins are transiently expressed in tobacco leaves and the restored fluorescent signals can be detected with a confocal laser scanning microscope in the intact cells. This allows not only visualization of the interaction itself, but also the subcellular localization of the protein complexes can be determined. For this purpose, marker genes containing a fluorescent tag can be coexpressed along with the BiFC constructs, thus visualizing cellular structures such as the endoplasmic reticulum, mitochondria, the Golgi apparatus or the plasma membrane. The fluorescent signal can be monitored either directly in epidermal leaf cells or in single protoplasts, which can be easily isolated from the transformed tobacco leaves. BiFC is ideally suited to study protein-protein interactions in their natural surroundings within the living cell. However, it has to be considered that the expression has to be driven by strong promoters and that the interaction partners are modified due to fusion of the relatively large fluorescence tags, which might interfere with the interaction mechanism. Nevertheless, BiFC is an excellent complementary approach to other commonly applied methods investigating protein-protein interactions, such as coimmunoprecipitation, in vitro pull-down assays or yeast-two-hybrid experiments.

Formation of protein complexes in vivo can be visualized by bimolecular fluorescence complementation. Interaction partners are fused to complementary parts of fluorescent tags and transiently expressed in tobacco leaves, resulting in a reconstituted fluorescent signal upon close proximity of the two proteins.

البروتين البروتين التفاعلات تصور من قبل ثنائي الجزيء الإسفار التكملة في Protoplasts التبغ وأوراق

Many proteins interact transiently with other proteins or are integrated into multi-protein complexes to perform their biological function. Bimolecular ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live cells. BRET is the non-radiative transfer of energy from a 'donor' luciferase enzyme to an 'acceptor' fluorescent protein. In the most common configuration of this assay, the donor is Renilla reniformis luciferase and the acceptor is Yellow Fluorescent Protein (YFP). Because the efficiency of energy transfer is strongly distance-dependent, observation of the BRET phenomenon requires that the donor and acceptor be in close proximity. To test for an interaction between two proteins of interest in cultured mammalian cells, one protein is expressed as a fusion with luciferase and the second as a fusion with YFP. An interaction between the two proteins of interest may bring the donor and acceptor sufficiently close for energy transfer to occur. Compared to other techniques for investigating protein-protein interactions, the BRET assay is sensitive, requires little hands-on time and few reagents, and is able to detect interactions which are weak, transient, or dependent on the biochemical environment found within a live cell. It is therefore an ideal approach for confirming putative interactions suggested by yeast two-hybrid or mass spectrometry proteomics studies, and in addition it is well-suited for mapping interacting regions, assessing the effect of post-translational modifications on protein-protein interactions, and evaluating the impact of mutations identified in patient DNA.

Interactions between proteins are fundamental to all cellular processes. Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer, the interaction between a pair of proteins can be monitored in live cells and in real time. Furthermore, the effects of potentially pathogenic mutations can be assessed.

التحقيق البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا الحية باستخدام الرنين ضوء بارد نقل الطاقة

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most of these require access to specialist equipment, and often require a degree of expertise to effectively establish reliable experiments and analyze data. Differential scanning fluorimetry (DSF) is being increasingly used as a robust method for initial screening of proteins for interacting small molecules, either for identifying physiological partners or for hit discovery. This technique has the advantage that it requires only a PCR machine suitable for quantitative PCR, and so suitable instrumentation is available in most institutions; an excellent range of protocols are already available; and there are strong precedents in the literature for multiple uses of the method. Past work has proposed several means of calculating dissociation constants from DSF data, but these are mathematically demanding. Here, we demonstrate a method for estimating dissociation constants from a moderate amount of DSF experimental data. These data can typically be collected and analyzed within a single day. We demonstrate how different models can be used to fit data collected from simple binding events, and where cooperative binding or independent binding sites are present. Finally, we present an example of data analysis in a case where standard models do not apply. These methods are illustrated with data collected on commercially available control proteins, and two proteins from our research program. Overall, our method provides a straightforward way for researchers to rapidly gain further insight into protein-ligand interactions using DSF.

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

تحديد تفاعلات البروتين يجند عن طريق المسح الضوئي التفاضلية Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

التحقيق عالية الكثافة ميكروأرس البروتين وظيفية لكشف البروتين البروتين التفاعلات

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...