This work was funded by the Creative Inquiry Program for Undergraduate Research and the Calhoun Honors College at Clemson University.

1. عامة المثقبيات تربية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن المواد الصلبة لإعداد وسائل الاعلام SDM79 (الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزينها في 4 درجة مئوية في 50 مل المخروطية أو كيس زيبلوك. ملاحظة: الكواشف مستقرة لمدة 6 أشهر على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد مصل الجنين البقري (FBS) في 37 ° C بالحمام المائي، وتخلط بشكل دوري بواسطة انقلاب. ملاحظة: يتم تلقى FBS من الشركة باعتبارها محلول معقم. فلتر تعقيم FBS يقلل من قدرتها على دعم نمو الطفيل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمجرد إذابة الزجاجة بأكملها، حرارة تعطيل مصل لمدة 30 دقيقة في 56 درجة مئوية بالحمام المائي، والخلط بشكل دوري للحد من ترسب مكونات المصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد البنسلين / حل الستربتوميسين (القلم / بكتيريا)، هيمن (2 ملغ / مل في 50 ملي هيدروكسيد الصوديوم)، وبصل متوسطة النسر فيتامين الحل في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى 1،000 مل تخرج اسطوانة، إضافة 20.2 غرام من المواد الصلبة SDM79 (الجدول 1) إلى المكونات السائلة (الجدول 2) وتخلط جيدا على طبق من ضجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط درجة الحموضة إلى 7.35، وجلب الحجم إلى 850 مل بالماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فلتر تعقيم وسائل الإعلام عن طريق ربط خرطوم فراغ إلى أسفل زجاجة التصفية. تطبيق فراغ حتى يتم تصفية الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة رأس مرشح في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية وإضافة 150 مل من الحرارة المعطل FBS. إزالة الغطاء البلاستيك من غطاء زجاجة معقمة وسائل الإعلام الختم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسائل الاعلام SDM80 بنفس الطريقة كما SDM79 مع الاستثناءات التالية. عدم إضافة السكر أو استخدام الجلوكوزامين وMEM دون الجلوتامين. بدلا من 150 مل من الحرارة المعطل FBS، إضافة 135 مل من مدال، الحرارة المعطل FBS، و 15 مل من الحرارة المعطل FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة الطفيليات PCF في 25 سم 2 قارورة مع 10 مل المتوسطة المناسب حتى 27 درجة مئوية وCO 2 5٪. ملاحظة: يجب عد خلايا يوميا باستخدام عدادة الكريات أو تدفق عداد الكريات (انظر القسم 6) وينبغي الحفاظ على الثقافات بكثافة بين 1 × 10 5 و 5 × 10 6 خلية / مل. </li></ol> 2. آرansfection PCF من الطفيليات مع مراسل تعبيد الفلورسنت ملاحظة: لمتابعة glycosome ديناميكية، يتم التعبير عن بروتين مراسل تحتوي على تسلسل استهداف peroxisomal (PTS2) من ألدولاز تنصهر لتعزيز بروتين فلوري الأصفر في الطفيليات. تم استنساخ تسلسل ترميز البروتين الانصهار في pXS2bla 12، الذي يحتوي على المروج procyclin والمناطق بين تويولين التي إعادة التركيب مثلي المباشر في الجينوم والجينات المقاومة blasticidin للاختيار. يتم تحويل خطوط الخلايا Procyclic إيواء الجينات التي تكود T7 البلمرة والتتراسيكلين كاظمة (PF29-13) مع بناء الاستهداف، pXS2: PTS2eYFP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد cytomix عن طريق خلط المكونات المدرجة في الجدول 3. فلتر تعقيم وتخزينها في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطي DNA البلازميد مع MluI بواسطة pipetting 10 ميكرولتر من الحمض النووي (1 ميكروغرام / ميكرولتر)، 5 ميكرولتر عازلة انزيم التقييد، والمياه 33 ميكرولتر، و 2 μ؛ ل من MluI الانزيم في أنبوب microcentrifuge. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية تقييد هضم بإضافة 1 حجم العازلة ملزمة لتقييد انزيم هضم. مزيج عازلة ملزم DNA وهضمها من قبل vortexing. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة لجمع العينة في أسفل الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج عمود DNA ملزم في أنبوب جمع 2 مل، ونقل هضمها الحمض النووي / حل العازلة إلى العمود ملزمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي ل10،000 x ج لمدة 1 دقيقة. بعد الطرد المركزي، وتجاهل الترشيح من أنبوب جمع وإعادة العمود إلى أنبوب جمع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 700 ميكرولتر من SPW غسل العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رشاحة تجاهل من أنبوب جمع، والعودة العمود إلى أنبوب جمع وتكرار غسل وSPW خطوة الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلصي من الترشيح، العمود العودة إلى أنبوب جمع، وأجهزة الطرد المركزي عمود فارغ لمدة 3 دقائق في 10،000 x ج لإزالة الإيثانول المتبقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية، ورمي بعيدا العقيدأنبوب فصل من الكتاب المقدس والعمود مكان في أنبوب microcentrifuge العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى أزل الحمض النووي، إضافة 25 ميكرولتر من الماء المعقم إلى العمود ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. أجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 25 ميكرولتر آخر من الماء المعقم في غطاء محرك السيارة سلامة الأحيائية إلى العمود ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي على سرعة 10،000 x ج لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خزانة السلامة البيولوجية نقل كامل حجم الحمض النووي لأنبوب microcentrifuge العقيمة الجديد. ملاحظة: هذه الخطوة تمنع التلوث من الغطاء مفتوحا أثناء الطرد المركزي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة عقيمة، النقى DNA خطي (10 ميكروغرام) إلى 400 ميكرولتر من cytomix فلتر تعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا كما هو موضح في القسم 6 وحصاد 5 X10 7 -10 8 الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 800 x ج لمدة 15 دقيقة في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخلصي من طاف و resuspend بيليه الخلية في 450 ميكرولتر من الحمض النووي + cytomix باستخدام 1 مل ماصة المصلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل نقل تحتوي على م<html> LLS، DNA، وcytomix إلى معقمة 4 ملم الفجوة كفيت وكفيت مكان في غرفة Electroporation لل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;الاضمحلال الأسي&quot; يدويا وأدخل الإعدادات التالية: الجهد: 1.5 كيلو فولت، السعة: 25 MF، المقاومة: Ω، وكوفيت: 4 مم. الصحافة النبض. بمجرد اكتمال النبض، وإزالة كفيت من غرفة Electroporation للوالعودة الى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في قارورة معقمة جديدة، ماصة 10 مل من SDM79. نقل الخلايا تحولت إلى القارورة مع 10 مل من SDM79. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان دون اختيار الدواء لمدة 24 ساعة عند 27 درجة مئوية، 5٪ CO 2. بعد 24 ساعة، إضافة G418 (15 ميكروغرام / مل)، هيغروميسين (50 ميكروغرام / مل)، وblasticidin (10 ميكروغرام / مل). تمرير 1 مل من الخلايا تحولت مع المخدرات في 9 مل من SDM79 مع المخدرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحليل خلايا يوميا كما هو موضح في المقاطع 6 و 7. عندما تكون الخلايا الفلورسنت، وصلت كثافة خلية من 1 × 10 7 / مل، وجعل stabilates للتخزين طويل الأجل (3،1-3،3). </li></ol>ve_title &quot;&gt; 3. جعل Stabilates <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجعل تجميد وسائل الإعلام، إضافة حجم مساو من الجلسرين بنسبة 100٪ لcytomix وفلتر تعقيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 200 ميكرولتر من تجميد وسائل الإعلام إلى 800 ميكرولتر من الخلايا (1 × 10 7) في cryovial، مزيج بلطف بواسطة انقلاب وقعت بين اثنين من الرفوف الستايروفوم وتجميد في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة المجمدة (~ 24 ساعة)، وخلايا نقل إلى النيتروجين السائل. ملاحظة: من المهم تحريك الخلايا في LN 2 بعد 24 ساعة، والتخزين الطويل في -80 درجة مئوية يؤدي إلى انخفاض في بقاء الخلية. </li></ol> 4. الأرصدة المجمدة ذوبان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قارورة المجمدة من -80 ° C وذوبان الجليد في RT لحوالي 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 9 مل من SDM79 مع المخدرات في قارورة معقمة جديدة. إضافة إلى إذابة خلايا هذه القارورة. تمر خلايا 01:10 بإضافة 1 مل من هذه الثقافة إلى 9 مل من SDM79 في قارورة جديدة (تركيز النهائي من 1 × 10 5 / مل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل الخلايا تصل كثافة 10 7 / مل، تبدأ وضع عداد الكرياتصعودا والمقايسات التخفيف. </li></ol> 5. الإعداد عداد الكريات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على تدفق عداد الكريات وفتح برنامج CFlow زائد. ملاحظة: قبل تشغيل أي عينات، ينبغي backflushed على fluidics وتشطف وفقا لخطوات 5،2-5،7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال أنبوب المياه nanopure التي يتم تخزين رشفة مع أنبوب فارغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد زر &quot;backflush&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة backflush كاملة، وإزالة أنبوب microcentrifuge من رشفة وتجاهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أنبوب microcentrifuge الجديد يحتوي على 1 مل من الماء nanopure جديد على رشفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر بئر جديد في برنامج CFlow. تحت عنوان &quot;حدود تشغيل&quot; ضبط الوقت لمدة 2 دقيقة. تحت عنوان &quot;Fluidics&quot; حدد &quot;سريع&quot; و &quot;تشغيل&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة المهلة 2 دقيقة كاملة، انقر فوق الزر &quot;حذف نموذج البيانات&quot;. </li></ol> 6. العد الخلية باستخدام عداد الكريات التدفق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال الماء مع العينة لفرزها. ضبط &quot;حدود تشغيل &quot;إلى 30 ثانية،&quot; Fluidics &quot;إلى&quot; سريع &quot;ثم حدد&quot; تشغيل &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد مهلة 30 ثانية كاملة، بالإضافة إلى CFlow سيوفر الأحداث / ميكرولتر تحت عنوان &quot;الماضي البعيد&quot;. كرر تعداد لكل ثقافة. ملاحظة: قبل خلايا تصل إلى 1 × 10 7 خلية / مل، والمضي قدما مع التخفيف الفحص. ينبغي وقف الخلايا بعد اكتمال فحص واحد التخفيف. الخلايا المستزرعة لفترات أطول تفقد قدرتها على الاستجابة للظروف البيئية. </li></ol> 7. قياس الإسفار باستخدام عداد الكريات التدفق <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم مضان، تعيين &quot;حدود تشغيل&quot; ل10،000 الأحداث، و &quot;Fluidics&quot; إلى &quot;بطيء&quot;. حدد &quot;تعيين عتبة&quot;. تحت عنوان &quot;عتبة الابتدائية&quot;، حدد &quot;بشكل دائم على قضاء الأحداث&quot;، &quot;FSC-H&quot; (في القائمة المنسدلة مربع) وأدخل أقل من 30،000. انقر على &quot;تطبيق&quot;، ثم &quot;إغلاق&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد220، الرسم البياني &quot;زر في واحدة من النوافذ مؤامرة جديدة وحدد&quot; FSC-A &quot;من القائمة المنسدلة، حدد&quot; FL1-A &quot;. ملاحظة: التدابير FL1-A مضان في الطول الموجي 530 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;تشغيل&quot; وتكرار لجميع الثقافات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل محلول التنظيف من خلال خط fluidics لمدة 2 دقيقة والماء لمدة 2 دقيقة. </li></ol> 8. التخفيف فحوصات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمر الخلايا إلى كثافة من 1 × 10 5 خلية / مل في 3 مل من SDM79 في 25 سم 2 قارورة الثقافة وقياس الإزهار مباشرة بعد مرور ثم في 3 ساعة و 24 ساعة. </li></ol> تحليل البيانات 9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;تحليل&quot; علامة على CFlow زائد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انقر سوف &quot;الرسم البياني&quot; زر تحت &quot;جعل مؤامرة جديدة.&quot; حدد &quot;FSC-A&quot; وقائمة منسدلة تظهر. اختر قناة &quot;FL1-A&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسليط الضوء جيدا لتحليل. اختر زر &quot;بوابة&quot;، ورسم يدويا بوابةلسكان الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وتدفق زائد توفير خلية &quot;عدد&quot; في هذا الباب و&quot;٪ من هذه المؤامرة&quot;. </li></ol>

<ol>
	<li>Stuart, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetoplastids:+related+protozoan+pathogens,+different+diseases.">Kinetoplastids: related protozoan pathogens, different diseases.</a> J Clin Invest. 118, 1301-1310 (2008).</li><li>Herman, M., Perez-Morga, D., Schtickzelle, N., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turnover+of+glycosomes+during+life-cycle+differentiation+of+Trypanosoma+brucei.">Turnover of glycosomes during life-cycle differentiation of Trypanosoma brucei.</a> Autophagy. 4, 294-308 (2008).</li><li>Herman, M., Gillies, S., Michels, P. A., Rigden, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+and+related+processes+in+trypanosomatids:+insights+from+genomic+and+bioinformatic+analyses.">Autophagy and related processes in trypanosomatids: insights from genomic and bioinformatic analyses.</a> Autophagy. 2, 107-118 (2006).</li><li>Michels, P. A., Bringaud, F., Herman, M., Hannaert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+functions+of+glycosomes+in+trypanosomatids.">Metabolic functions of glycosomes in trypanosomatids.</a> Biochim Biophys Acta. 1763, 1463-1477 (2006).</li><li>Michels, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peroxisomes,+glyoxysomes+and+glycosomes+(review).">Peroxisomes, glyoxysomes and glycosomes (review).</a> Mol Membr Biol. 22, 133-145 (2005).</li><li>Moyersoen, J., Choe, J., Fan, E., Hol, W. G., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+of+peroxisomes+and+glycosomes:+trypanosomatid+glycosome+assembly+is+a+promising+new+drug+target.">Biogenesis of peroxisomes and glycosomes: trypanosomatid glycosome assembly is a promising new drug target.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 603-643 (2004).</li><li>Parsons, M., Furuya, T., Pal, S., Kessler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis+and+function+of+peroxisomes+and+glycosomes.">Biogenesis and function of peroxisomes and glycosomes.</a> Molecular and biochemical parasitology. 115, 19-28 (2001).</li><li>Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosomes:+parasites+and+the+divergence+of+peroxisomal+purpose.">Glycosomes: parasites and the divergence of peroxisomal purpose.</a> Mol Microbiol. 53, 717-724 (2004).</li><li>Michels, P. A., Hannaert, V., Bringaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+aspects+of+glycosomes+in+trypanosomatidae+-+new+data+and+views.">Metabolic aspects of glycosomes in trypanosomatidae - new data and views.</a> Parasitol Today. 16, 482-489 (2000).</li><li>Michels, P. A., Hannaert, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+evolution+of+kinetoplastid+glycosomes.">The evolution of kinetoplastid glycosomes.</a> J Bioenerg Biomembr. 26, 213-219 (1994).</li><li>Hannaert, V., Michels, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+function,+and+biogenesis+of+glycosomes+in+kinetoplastida.">Structure function, and biogenesis of glycosomes in kinetoplastida.</a> J Bioenerg Biomembr. 26, 205-212 (1994).</li><li>Bauer, S., Morris, J. C., Morris, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environmentally+regulated+glycosome+protein+composition+in+the+african+trypanosome.">Environmentally regulated glycosome protein composition in the african trypanosome.</a> Eukaryot Cell. 12, 1072-1079 (2013).</li><li>Colasante, C., Ellis, M., Ruppert, T., Voncken, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+proteomics+of+glycosomes+from+bloodstream+form+and+procyclic+culture+form+Trypanosoma+brucei+brucei.">Comparative proteomics of glycosomes from bloodstream form and procyclic culture form Trypanosoma brucei brucei.</a> Proteomics. 6, 3275-3293 (2006).</li><li>Opperdoes, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentation+of+carbohydrate+metabolism+in+trypanosomes.">Compartmentation of carbohydrate metabolism in trypanosomes.</a> Annu Rev Microbiol. 41, 127-151 (1987).</li><li>Kessler, P. S., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+role+of+compartmentation+of+glycolysis+in+procyclic+form+Trypanosoma+brucei:+RNA+interference+studies+of+PEX14,+hexokinase,+and+phosphofructokinase.">Probing the role of compartmentation of glycolysis in procyclic form Trypanosoma brucei: RNA interference studies of PEX14, hexokinase, and phosphofructokinase.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 9030-9036 (2005).</li><li>Bringaud, F., Riviere, L., Coustou, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+of+trypanosomatids:+adaptation+to+available+carbon+sources.">Energy metabolism of trypanosomatids: adaptation to available carbon sources.</a> Molecular and biochemical parasitology. 149, 1-9 (2006).</li><li>Coustou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose-induced+remodeling+of+intermediary+and+energy+metabolism+in+procyclic+Trypanosoma+brucei.">Glucose-induced remodeling of intermediary and energy metabolism in procyclic Trypanosoma brucei.</a> The Journal of biological chemistry. 283, 16342-16354 (2008).</li><li>Lamour, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proline+metabolism+in+procyclic+Trypanosoma+brucei+is+down-regulated+in+the+presence+of+glucose.">Proline metabolism in procyclic Trypanosoma brucei is down-regulated in the presence of glucose.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 11902-11910 (2005).</li><li>Vertommen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+of+glycosomal+and+mitochondrial+proteins+in+the+two+major+life-cycle+stages+of+Trypanosoma+brucei.">Differential expression of glycosomal and mitochondrial proteins in the two major life-cycle stages of Trypanosoma brucei.</a> Molecular and biochemical parasitology. 158, 189-201 (2008).</li><li>Vickerman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+cycles+and+biology+of+pathogenic+trypanosomes.">Developmental cycles and biology of pathogenic trypanosomes.</a> British medical bulletin. 41, 105-114 (1985).</li><li>Lorenz, P., Maier, A. G., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elongation+and+clustering+of+glycosomes+in+Trypanosoma+brucei+overexpressing+the+glycosomal+Pex11p.">Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pex11p.</a> The EMBO journal. 17, 3542-3555 (1998).</li><li>Saveria, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+PEX19-binding+motifs+required+for+protein+targeting+to+mammalian+peroxisomal+and+trypanosome+glycosomal+membranes.">Conservation of PEX19-binding motifs required for protein targeting to mammalian peroxisomal and trypanosome glycosomal membranes.</a> Eukaryot Cell. 6, 1439-1449 (2007).</li><li>Banerjee, S. K., Kessler, P. S., Saveria, T., Parsons, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+trypanosomatid+PEX19:+functional+characterization+reveals+impact+on+cell+growth+and+glycosome+size+and+number.">Identification of trypanosomatid PEX19: functional characterization reveals impact on cell growth and glycosome size and number.</a> Molecular and biochemical parasitology. 142, 47-55 (2005).</li><li>Milagros Camara Mde, L., Bouvier, L. A., Miranda, M. R., Pereira, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+Trypanosoma+cruzi's+glycosomal+adenylate+kinase+containing+a+peroxisomal+targeting+signal.">Identification and validation of Trypanosoma cruzi's glycosomal adenylate kinase containing a peroxisomal targeting signal.</a> Experimental parasitology. 130, 408-411 (2012).</li><li>Wiemer, E. A., Wenzel, T., Deerinck, T. J., Ellisman, M. H., Subramani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+the+peroxisomal+compartment+in+living+mammalian+cells:+dynamic+behavior+and+association+with+microtubules.">Visualization of the peroxisomal compartment in living mammalian cells: dynamic behavior and association with microtubules.</a> The Journal of cell biology. 136, 71-80 (1997).</li><li>Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+maintenance+of+mammalian+peroxisomes+involves+a+de+novo+PEX16-dependent+pathway+from+the+ER.">The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER.</a> The Journal of cell biology. 173, 521-532 (2006).</li><li>Hoepfner, D., Schildknegt, D., Braakman, I., Philippsen, P., Tabak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+the+endoplasmic+reticulum+to+peroxisome+formation.">Contribution of the endoplasmic reticulum to peroxisome formation.</a> Cell. 122, 85-95 (2005).</li><li>Furuya, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+is+toxic+to+glycosome-deficient+trypanosomes.">Glucose is toxic to glycosome-deficient trypanosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 14177-14182 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Glycosomes هي، ديناميكية، العضيات الطفيلي محددة الأساسية. المرجح أن تشمل العمليات التي تنظم نشوء حيوي والصيانة وانتشار وإعادة عرض هذه العضيات أهداف المخدرات التي يمكن استغلالها لأغراض علاجية. على الرغم من وفرة كبيرة محتملة من هذه الأهداف المخدرات، وتخلفت مجال glycosome نشو?...

المثقبية البروسية يسبب مرض النوم الأفريقي في البشر ومرض الهزال، ناغانا، في الماشية. الأدوية المستخدمة في علاج هذه الأمراض العتيقة وسامة للغاية، واللقاحات غير متوفرة، وإمكانية تطوير مقاومة المخدرات تستلزم البحث عن أهداف جديدة المخدرات 1. خلال دورة حياتها، T. البروسية، المناوبين بين ناقلات الامراض والحشرات والثدييات المضيفة. مضيفين أن تقديم بيئات مختلفة جدا التي الطفيلي يجب البقاء على قيد الحياة. يحدث عدد من التغيرات الأيضية والمورفولوجية كما يتعرض الطفيلي للظروف البيئية المختلفة. ويلاحظ بعض التغييرات الأكثر دراماتيكية في microbodies محددة الطفيلي يحدها غشاء واحد، يسمى glycosomes 13. مستويات الجلوكوز مرتفعة نسبيا (~ 5 ملم) في مجرى الدم والطفيليات مجرى الدم (البنك السعودي الفرنسي) حصريا من خلال توليد ATP WH تحللوقمع الأيض الميتوكوندريا إيل 14. خلافا لحقيقيات النوى الأخرى التي يحدث تحلل في السيتوبلازم، T. البروسية compartmentalizes معظم الإنزيمات حال السكر في glycosomes 14،15. تؤخذ الطفيليات من قبل ذبابة التسي تسي خلال bloodmeal وتشهد انخفاض الجلوكوز، والذي يقع إلى مستويات غير قابلة للكشف خلال 15 دقيقة من بلعها بواسطة الطاير. عملية التمثيل الغذائي للحشرة، شكل procyclic (PCF)، والطفيليات هي أكثر مرونة والجلوكوز، وكذلك الأحماض الأمينية مثل البرولين، ويمكن استخدامها في تركيب ATP 16-18. دراسات البروتين المقارنة تكشف التغيرات في دورة حياة تعتمد glycosomal وبروتينات الميتوكوندريا مع البروتينات حال السكر زيادة في مجرى الدم والطفيليات بروتينات الميتوكوندريا المشاركة في دورة TCA والسلسلة التنفسية 13،19. في حين ركزت العديد من الدراسات على الاختلافات بين البنك السعودي الفرنسي وglycosomes PCF، لا يعرف إلا القليل عن التغيرات في glycosomes PCF التي تحدث ردا على الحياة الفطريةالتغييرات ironmental. في المعى المؤخر من ذبابة، ومستويات الجلوكوز منخفضة مع الزيادات العابرة خلال التغذية 20. في معظم الدراسات في المختبر، وتزرع الطفيليات PCF في وسائل الإعلام التي تحتوي على الجلوكوز. ومع ذلك، فقد أظهرت الدراسات الحديثة أن التغييرات الأيض PCF بشكل كبير ردا على الجلوكوز توفر 17. في غياب الجلوكوز، وامتصاص البرولين والبرولين زيادة النشاط نازعة 18. هذا التغيير في استقلاب الميتوكوندريا المرجح يرافقه تغيير في تكوين glycosome والتشكل، ومع ذلك، لم يتم تقييم هذا مباشرة. والإلكترون المجهري مضان والتقنيات الشائعة المستخدمة لدراسة ديناميات glycosome في T. 2،21-24 البروسية. هذه البروتوكولات هي الوقت والعمل المكثف، ومكلفة، وصعبة للتكيف مع الدراسات في الوقت الحقيقي والبروتوكولات إنتاجية عالية. للتغلب على هذا القيد، وهو نظام مراسل فلوري عضية-Uااا لدراسة العضيات في أنظمة الثدييات والخميرة تم تعديله للاستخدام في T. 12 البروسية. وقد نظم مراسل الفلورسنت عضية تستخدم على نطاق واسع في حقيقيات النوى أعلى مثل الخميرة، والنبات، وخلايا الثدييات 25-27. في هذه النظم، وتنصهر بروتين فلوري إلى تسلسل الأحماض الأمينية التي يستهدف البروتين لعضيات محددة. يتم قياس تدهور أو تخليق البروتينات المستهدفة عبر مضان وتنعكس التغييرات في تكوين عضية بالتغيرات في مضان الخلية. عندما تنصهر في إطار القراءة المفتوح المعززة بروتين فلوري الأصفر (EYFP) إلى النوع الثاني peroxisomal تسلسل استهداف (PTS2) 12، يتم استيراد البروتين PTS2eYFP إلى ناضجة، glycosomes استيراد المختصة ومضان يمكن رصدها عبر التدفق الخلوي. وتنعكس التغيرات في تكوين glycosome بالتغيرات في مضان الخلوية. هذا النظام يمكن أن تساعد في RESOLفينج الآليات التي تنظم التغييرات الناجمة بيئيا في glycosome التكوين. تصف هذه المخطوطة توليد نظام مراسل glycosome في الطفيليات PCF بالتزامن مع التدفق الخلوي لمراقبة ديناميات glycosome الوقت الحقيقي في الطفيليات الحية وتقدم مثالا للكيفية التي تم استخدامها لمتابعة التغيرات في تكوين glycosome ردا على بيئات مختلفة. وباختصار، يتأثر glycosome التكوين حسب تركيزات الجلوكوز خارج الخلية ومرور ثقافات المرحلة السجل إلى وسائل الإعلام العذبة يؤدي تغيرات في تكوين glycosome. يمكن تعديل هذا النظام لدراسة السلوك الديناميكي من العضيات الأخرى في المثقبيات والطفيليات الأخرى.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1257">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:396px;">Adenosine</td>
			<td style="width:425px;">Avocado Research Chemicals Ltd</td>
			<td style="width:180px;">A10781</td>
			<td style="width:256px;">SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Alanine</td>
			<td>Avocado Research Chemicals Ltd</td>
			<td>A15804</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-arginine</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>1820</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">p-aminobenzoic acid</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td>102569</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Basal Medium Eagle Vitamin Solution (100X)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6891</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biotin</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP232-1</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH0224</td>
			<td>Cytomix</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S311-100</td>
			<td>Cytomix ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZNA Gel Extraction kit</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>D2500-01</td>
			<td>DNA purifiation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Research grade Serum</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>03-600-511</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Folic acid</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td>101725</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucosamine HCl</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td>194671</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glucose</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>15023-021</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-glutamine</td>
			<td>CalBiochem</td>
			<td>3520</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>Ac15892-0010</td>
			<td>Freezing media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Graces insect cell media powder</td>
			<td>GIBCO</td>
			<td>11300-043</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hemin</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194025</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Guanosine</td>
			<td>Avocado Research Chemicals Ltd</td>
			<td>A11328</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>194025</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP214-500</td>
			<td>Cytomix ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-methionine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP388-100</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Amino Acids (50X)</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>25-030-CI</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NEAA Mixture (100X)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>13-114E</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimal Essential Medium (1X) with L-glutamine</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>10-010-CM</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MOPS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP308-500</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Biocarbonate</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S233-500</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30-002-CI</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-phenylalanine</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td>102623</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>P217-500</td>
			<td>Cytomix ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Phosphate Dibasic Anhydrous</td>
			<td>Fisheer</td>
			<td>P290-212</td>
			<td>Cytomix ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-proline</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP392-100</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-serine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>56-45-1</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pyruvic acid, sodium salt</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>113-24-6</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-taurine</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>A0295</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-threonine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>72-19-5</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-tyrosine</td>
			<td>ICN Biomedicals</td>
			<td>103183</td>
			<td>SDM79 Ingredient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">E.Z.N.A.Cycle Pure kit</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>D6492-02</td>
			<td>DNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Binding buffer</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>PDR041</td>
			<td>DNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SPW wash buffer&#160;</td>
			<td>Omega Biotek</td>
			<td>PDR045</td>
			<td>DNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gene Pulser Xcell&#160;</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>165-2660</td>
			<td>Trypanosome transformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 mm electroporation cuvettes</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td>Trypanosome transformation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using fluorescent proteins to monitor glycosome dynamics in the african trypanosome

المثقبية البروسية هو طفيلي kinetoplastid الذي يسبب داء المثقبيات الأفريقي البشري (HAT)، أو مرض النوم، ومرض الهزال، ناغانا، في الماشية 1. المناوبين الطفيلي بين مجرى الدم من المضيف الثدييات وذبابة التسي تسي ناقلات. تكوين العديد من العضيات الخلوية يتغير استجابة لهذه الظروف خارج الخلية مختلفة 2-5. Glycosomes هي peroxisomes درجة عالية من التخصص فيها العديد من الأنزيمات المشاركة في تحلل هي مجزأة. تغييرات تكوين Glycosome بطريقة التنموية وتنظيما للبيئة 4-11. حاليا، والتقنيات الأكثر شيوعا لدراسة ديناميات glycosome هي الإلكترون ومضان المجهري. التقنيات التي هي باهظة الثمن والوقت وكثيفة العمالة، وعدم تكييفها بسهولة لتحليل إنتاجية عالية. للتغلب على هذه القيود، نظام مراسل الفلورسنت glycosome فيمما عزز الأصفر بروتين فلوري (EYFP) وتنصهر إلى تاكسدي استهداف تسلسل (PTS2)، التي توجه إلى انصهار بروتين glycosomes 12، أنشئت. عند الاستيراد من البروتين الانصهار PTS2eYFP، glycosomes تصبح الفلورسنت. تدهور عضية ونتائج إعادة التدوير في فقدان مضان التي يمكن قياسها عن طريق التدفق الخلوي. يمكن تحليل أعداد كبيرة من الخلايا (5،000 خلية / ثانية) في الوقت الحقيقي دون إعداد عينة واسعة مثل التثبيت والتركيب. تقدم هذه الطريقة وسيلة سريعة للكشف عن تغيرات في تكوين عضية استجابة لتغير الظروف البيئية.

في هذا النظام، لوحظ وجود تغير تعتمد على الجلوكوز في glycosome التكوين. عندما تزرع الخلايا في وسائل الإعلام التي تحتوي على السكر، ويلاحظ اثنين من السكان. مشرق واحد وقاتمة واحد (الشكل 2A). خلايا قاتمة تؤوي glycosomes غير ناضجة، والتي يتم استيراد PTS2eYFP في حين أن الخلايا مشر...

Watch this Scientific Journal Video about Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome at JoVE.com

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

باستخدام البروتينات الفلورية لرصد ديناميات Glycosome في المثقبيات الأفريقي

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

using-fluorescent-proteins-to-monitor-glycosome-dynamics-african

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.9K Views.  Clemson University Eukaryotic Pathogens Innovation Center. Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

Video: Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester (CFSE) to Monitor Lymphocyte Proliferation

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3. CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. Thus, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny are endowed with half the number of carboxyfluorescein-tagged molecules and thus each cell division can be assessed by measuring the corresponding decrease in cell fluorescence via Flow cytometry. The capacity of CFSE to label lymphocyte populations with a high fluorescent intensity of exceptionally low variance, coupled with its low cell toxicity, make it an ideal dye to measure cell division. Since it is a fluorescein-based dye it is also compatible with a broad range of other fluorochromes making it applicable to multi-color flow cytometry. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes for the purpose of monitoring up to 8 cell divisions. These labeled cells can be used both for in vitro and in vivo studies.

The Use of Carboxyfluorescein Diacetate Succinimidyl Ester CFSE to Monitor Lymphocyte Proliferation

CFSE covalently labels long-lived intracellular molecules with the fluorescent dye, carboxyfluorescein. As such, when a CFSE-labeled cell divides, its progeny have half the amount of fluorescence, which can thereby be used to assess cell division. This article describes the procedures typically used for labeling mouse lymphocytes with CFSE.

استخدام ثنائي الأسيتات Carboxyfluorescein Succinimidyl إستر (CFSE) لمراقبة انتشار الخلايا الليمفاوية

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is an effective and popular means to monitor lymphocyte division1-3.  CFSE covalently labels long-lived ...

A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins into a wide variety of target cells1,2. The T6SS is composed of 13 core components and displays structural similarities with the tail-tube of bacteriophages3. The phage uses a tube and a puncturing device to penetrate the cell envelope of target bacteria and inject DNA. It is proposed that the T6SS is an inverted bacteriophage device creating a specific path in the bacterial cell envelope to drive effectors and toxins to the surface. The process could be taken further and the T6SS device could perforate other cells with which the bacterium is in contact, thus injecting the effectors into these targets. The tail tube and puncturing device parts of the T6SS are made with Hcp and VgrG proteins, respectively4,5.
The versatility of the T6SS has been demonstrated through studies using various bacterial pathogens. The Vibrio cholerae T6SS can remodel the cytoskeleton of eukaryotic host cells by injecting an "evolved" VgrG carrying a C-terminal actin cross-linking domain6,7. Another striking example was recently documented using Pseudomonas aeruginosa which is able to target and kill bacteria in a T6SS-dependent manner, therefore promoting the establishment of bacteria in specific microbial niches and competitive environment8,9,10.
In the latter case, three T6SS-secreted proteins, namely Tse1, Tse2 and Tse3 have been identified as the toxins injected in the target bacteria (Figure 1). The donor cell is protected from the deleterious effect of these effectors via an anti-toxin mechanism, mediated by the Tsi1, Tsi2 and Tsi3 immunity proteins8,9,10. This antimicrobial activity can be monitored when T6SS-proficient bacteria are co-cultivated on solid surfaces in competition with other bacterial species or with T6SS-inactive bacteria of the same species8,11,12,13.
The data available emphasized a numerical approach to the bacterial competition assay, including time-consuming CFU counting that depends greatly on antibiotic makers. In the case of antibiotic resistant strains like P. aeruginosa, these methods can be inappropriate. Moreover, with the identification of about 200 different T6SS loci in more than 100 bacterial genomes14, a convenient screening tool is highly desirable. We developed an assay that is easy to use and requires standard laboratory material and reagents. The method offers a rapid and qualitative technique to monitor the T6SS-dependent bactericidal/bacteriostasis activity by using a reporter strain as a prey (in this case Escherichia coli DH5&alpha;) allowing a-complementation of the lacZ gene. Overall, this method is graphic and allows rapid identification of T6SS-related phenotypes on agar plates. This experimental protocol may be adapted to other strains or bacterial species taking into account specific conditions such as growth media, temperature or time of contact.

We describe a qualitative assay to monitor bacterial competition mediated by the Pseudomonas aeruginosa type VI secretion system (T6SS). The assay relies on the survival/killing of Escherichia coli target cells carrying a lacZ-reporter. This technique is adjustable to assess the bactericidal/bacteriostasis activity of T6SS-proficient microorganisms.

A الفحص المرئي لمراقبة T6SS بوساطة المسابقة الجرثومي

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal infection, the virus can infect and replicate in the developing brain, which may induce severe neurological damage, including deafness and mental retardation. Despite the potential severity of the symptoms, the therapeutic options are limited by the unavailability of a vaccine and the absence of a specific antiviral therapy. Furthermore, a precise description of the molecular events occurring during infection of the central nervous system (CNS) is still lacking since observations mostly derive from the autopsy of infected children. Several animal models, such as rhesus macaque CMV, have been developed and provided important insights into CMV pathogenesis in the CNS. However, despite its evolutionary proximity with humans, this model was limited by the intracranial inoculation procedure used to infect the animals and consistently induce CNS infection. Furthermore, ethical considerations have promoted the development of alternative models, among which neonatal infection of newborn mice with mouse cytomegalovirus (MCMV) has recently led to significant advances. For instance, it was reported that intraperitoneal injection of MCMV to Balb/c neonates leads to infection of neurons and glial cells in specific areas of the brain. These findings suggested that experimental inoculation of mice might recapitulate the deficits induced by HCMV infection in children. Nevertheless, a dynamic analysis of MCMV infection of neonates is difficult to perform because classical methodology requires the sacrifice of a significant number of animals at different time points to analyze the viral burden and/or immune-related parameters. To circumvent this bottleneck and to enable future investigations of rare mutant animals, we applied in vivo imaging technology to perform a time-course analysis of the viral dissemination in the brain upon peripheral injection of a recombinant MCMV expressing luciferase to C57Bl/6 neonates.

Use of In vivo Imaging to Monitor the Progression of Experimental Mouse Cytomegalovirus Infection in Neonates

Human Cytomegalovirus (HCMV) infection of neonates represents an important cause of mental retardation, yet the molecular events leading to virus-induced pathogenesis are still poorly understood. To investigate the dynamics of brain infection, we adapted whole-animal in vivo imaging to perform time-course analysis of neonates infected with a luciferase-recombinant virus.

استخدام<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير لرصد تطور التجريبية ماوس عدوى الفيروس المضخم للخلايا في حديثي الولادة

Human Cytomegalovirus (HCMV or HHV-5) is a life-threatening  pathogen in immune-compromised individuals. Upon congenital or neonatal  infection, the virus ...

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of sexually transmitted infection and also the primary cause of preventable blindness in the world. An essential determinant for successful infection of host cells by Chlamydia is the bacterium's ability to manipulate host cell signaling from within a novel, vacuolar compartment called the inclusion. From within the inclusion, Chlamydia acquire nutrients required for their 2-3 day developmental growth, and they additionally secrete a panel of effector proteins onto the cytosolic face of the vacuole membrane and into the host cytosol. Gaps in our understanding of Chlamydia biology, however, present significant challenges for visualizing and analyzing this intracellular compartment. Recently, a reverse-imaging strategy for visualizing the inclusion using GFP expressing host cells was described. This approach rationally exploits the intrinsic impermeability of the inclusion membrane to large molecules such as GFP. In this work, we describe how GFP- or mCherry-expressing host cells are generated for subsequent visualization of chlamydial inclusions. Furthermore, this method is shown to effectively substitute for costly antibody-based enumeration methods, can be used in tandem with other fluorescent labels, such as GFP-expressing Chlamydia, and can be exploited to derive key quantitative data about inclusion membrane growth from a range of Chlamydia species and strains.

Using Fluorescent Proteins to Visualize and Quantitate Chlamydia Vacuole Growth Dynamics in Living Cells

A live cell fluorescent protein based method for illuminating cellular vacuoles (inclusions) containing Chlamydia is described. This strategy enables rapid, automated determination of Chlamydia infectivity in samples and can be used to quantitatively investigate inclusion growth dynamics.

باستخدام نيون البروتينات إلى تصور وQuantitate<em&gt; الكلاميديا</em&gt; فجوة النمو حيوية في الخلايا الحية

The obligate intracellular bacterium Chlamydia elicits a great burden on global public health. C.&#160;trachomatis is the leading bacterial cause of ...

The Mesenteric Lymph Duct Cannulated Rat Model: Application to the Assessment of Intestinal Lymphatic Drug Transport

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine via a series of lymphatic vessels and nodes that converge at the superior mesenteric lymph duct. Cannulation of the mesenteric lymph duct thus enables the collection of mesenteric lymph flowing from the intestine. Mesenteric lymph consists of a cellular fraction of immune cells (99% lymphocytes), aqueous fraction (fluid, peptides and proteins such as cytokines and gut hormones) and lipoprotein fraction (lipids, lipophilic molecules and apo-proteins). The mesenteric lymph duct cannulation model can therefore be used to measure the concentration and rate of transport of a range of factors from the intestine via the lymphatic system. Changes to these factors in response to different challenges (e.g., diets, antigens, drugs) and in disease (e.g., inflammatory bowel disease, HIV, diabetes) can also be determined. An area of expanding interest is the role of lymphatic transport in the absorption of orally administered lipophilic drugs and prodrugs that associate with intestinal lipid absorption pathways. Here we describe, in detail, a mesenteric lymph duct cannulated rat model which enables evaluation of the rate and extent of lipid and drug transport via the lymphatic system for several hours following intestinal delivery. The method is easily adaptable to the measurement of other parameters in lymph. We provide detailed descriptions of the difficulties that may be encountered when establishing this complex surgical method, as well as representative data from failed and successful experiments to provide instruction on how to confirm experimental success and interpret the data obtained.

Here we describe a technique to cannulate the mesenteric lymph duct in rats which enables quantification of lipid and drug transport via the lymphatic system following intestinal delivery. The technique can be adapted to assess mesenteric lymph concentrations and/or transport of fluid, immune cells, peptides, proteins and lipophilic molecules.

المساريقي الليمفاوية القناة مقنى نموذج الفأر: بالتطبيق على تقييم المعوية اللمفاوي النقل المخدرات

The intestinal lymphatic system plays key roles in fluid transport, lipid absorption and immune function. Lymph flows directly from the small intestine ...

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

تلألؤ بيولوجي التصوير لكشف العدوى المرحلة المتأخرة من داء المثقبيات الأفريقي

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

"Phagosome Closure Assay" to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements of the actin cytoskeleton that is the driving force for plasma membrane extension around the particle. In addition, efficient engulfment of large material relies on focal exocytosis of intracellular compartments. This process is highly dynamic and numerous molecular players have been described to have a role during phagocytic cup formation. The precise regulation in time and space of all of these molecules, however, remains elusive. In addition, the last step of phagosome closure has been very difficult to observe because inhibition by RNA interference or dominant negative mutants often results in stalled phagocytic cup formation. 
We have set up a dedicated experimental approach using total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) combined with epifluorescence to monitor step by step the extension of pseudopods and their tips in a phagosome growing around a particle loosely bound to a coverslip. This method allows us to observe, with high resolution the very tips of the pseudopods and their fusion during closure of the phagosome in living cells for two different fluorescently tagged proteins at the same time.

&quot;Phagosome Closure Assay&quot; to Visualize Phagosome Formation in Three Dimensions Using Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy TIRFM

We describe an experimental setup to visualize with unprecedented high resolution phagosome formation and closure in three dimensions in living macrophages, using total internal reflection fluorescence microscopy. It allows monitoring of the base of the phagocytic cup, the extending pseudopods, as well as the precise site of phagosome scission.

&quot;يبلوع إغلاق الفحص&quot; لتصور يبلوع تشكيل في ثلاثة أبعاد عن طريق التأمل إجمالي الداخلية نيون الميكروسكوب (TIRFM)

Phagocytosis is a mechanism used by specialized cells to internalize and eliminate microorganisms or cellular debris. It relies on profound rearrangements ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

تطوير نظام الفيروسات مراسل التهاب الكبد B لرصد المراحل المبكرة من دورة النسخ المتماثل

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

أوفيركسريسيون وتنقية الإنسان<em&gt; رابطة الدول المستقلة</em&gt; -prenyltransferase في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most colonized hosts, the commensal reservoir does serve as a repository for infectious disease, and the presence of high fungal titers in the gut is associated with inflammatory bowel disease. Here, we describe a method to visualize C. albicans cell morphology and localization in a mouse model of stable gastrointestinal colonization. Colonization is established using a single dose of C. albicans in animals that have been treated with oral antibiotics. Segments of gut tissue are fixed in a manner that preserves the architecture of luminal contents (microorganisms and mucus) as well as the host mucosa. Finally, fluorescent in situ hybridization is performed using probes against fungal rRNA to stain for C. albicans and hyphae. A key advantage of this protocol is that it allows for simultaneous observation of C. albicans cell morphology and its spatial association with host structures during gastrointestinal colonization.

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

The purpose of this protocol is to visualize Candida albicans cell shape and localization in the mammalian gastrointestinal tract.

التصور من المبيضات الbicans في الجهاز الهضمي Murine باستخدام التهجين في الموقع الفلورسنت

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...