Name: high-throughput gene tagging in trypanosoma brucei
Uploaded: 2016-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei at JoVE.com

SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.

1. 96-جيدا طويل التمهيدي PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تجميد 96-جيدا PCR برودة في الثلاجة -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب 10 مل، وإعداد ميكس ماجستير A: 2100 ميكرولتر ده 2 O، و 105 ميكرولتر PCR الصف DMSO، 105 ميكرولتر 10 ملي dNTPs و 105 ميكرولتر pPOT قالب (25 نانوغرام / ميكرولتر) 9، عن حجم ما مجموعه 2،415 ميكرولتر لكل لوحة . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 23 ميكرولتر في كل بئر من لوحة 96-جيدا PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكرولتر من 100 ميكرومتر المجمعة الاشعال لكل محملة جيدا باستخدام P20 12 قناة متعددة ماصة. ختم مع فيلم، ومكان لوحة على برودة PCR قبل المبردة والسماح لتجميد مدة لا تقل عن 20 دقيقة في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب 10 مل، وإعداد ميكس ماجستير ب: 2048 ميكرولتر ده 2 O، 525 ميكرولتر العازلة 10X، 52.5 البلمرة ميكرولتر لإجمالي حجم 2626 ميكرولتر لكل لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة وPCR برودة من الفريزر -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع لوحة لا تزال على برودة PCR، إضافة 25 ميكرولتر ميكس ماجستير B على رأس جمدتن ميكس ماجستير ولحجم رد الفعل ما مجموعه 50 ميكرولتر. هذا هو الوقت الحرج، ويجب أن تكتمل قبل ميكس A يمكن أن ذوبان الجليد. ختم لوحة مع الفيلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين cycler الحرارية على النحو التالي: 94 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ثم 30 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة تليها فترة التمديد النهائي من 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل لوحة PCR بعد أن بلغ كتلة 94 درجة مئوية. </li></ol> 2. التحقق من صحة 96-جيدا طويل التمهيدي PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يلقي كبيرة 1٪ (ث / ت) هلام الاغاروز في تريس خلات EDTA (تاي) العازلة على التوالي مع أمشاط 4 × 28-جيدا لإعطاء جل مع 4 صفوف من الآبار. محاذاة أسنان بديلة للمشط مع نصائح من 12 قناة متعددة ماصة. بعناية غمر جل في تاي العازلة على التوالي بعد أن يتم تحميل الممرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 1 كيلو بايت سلم الحمض النووي في شارع 1 و 28 بئر من كل صف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام P20 12 قناة ماصة الأقنية، ونقل 2 ميكرولتر من دير المنتج PCRectly إلى كل حارة من هلام (الشكل 1A). القيام بذلك بسرعة للحد من إمكانية تلوث amplicons. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل منتجات PCR من الصف ألف من لوحة PCR في الممرات الوتر من الصف 1st من هلام (A1 - حارة 3، A2 - حارة 5 ...... A11 - حارة 23، A12 - حارة 25) وتحميل المنتجات PCR من الصف B من لوحة PCR في الممرات حتى مرقمة من الصف الحادي 1 من هلام (B1 - حارة 4، A2 - حارة 6 ...... B11 - حارة 24، B12 - حارة 26). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل منتجات PCR من الصف C و D من لوحة PCR باستخدام نفس النمط كما هو موضح أعلاه، مع صف C في الممرات مرقمة والصف D الغريب في الممرات زوجية. يستمر هذا النمط التحميل حتى يتم تحميل كل بئر من لوحة PCR على هلام. ليس مطلوبا عازلة الحمض النووي التحميل لتحميل هذا الجل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجل في خزان تشغيل وملء خزان مع تاي العازلة تشغيل حتى يتم المغمورة هلام. تشغيل في 100 فولت لمدة 30 دقيقة وتصور باستخدام الأشعة فوق البنفسجية نقل transilluminator. انظر الشكل 1B لهلام سبيل المثال. ملاحظة: منتجات PCR يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لعدة أسابيع قبل ترنسفكأيشن </li></ol> 3. ترنسفكأيشن 96-جيدا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام T. البروسية procyclic خط الخلية شكل SMOXP9 10 لهذا الإجراء وتنمو في SDM-79 وسائل الإعلام التي تحتوي على 10٪ FCS 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 1 × 10 7 خلايا لكل ترنسفكأيشن (ما مجموعه 1.1 × 10 9 خلايا) عندما وضع علامات على محطة N من البروتين و 2 × 10 7 خلايا لكل ترنسفكأيشن (ما مجموعه 2.2 × 10 9 خلايا) عندما وضع علامات على محطة C من البروتين. الحفاظ على الخلايا في منتصف سجل (1.2 × 10 6 -1 × 10 7 خلية / مل) لعدة أيام قبل ترنسفكأيشن وحصاد الخلايا لترنسفكأيشن في مناطق ذات كثافة من 5-8 × 10 6 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح للمنتجات PCR المجمدة لترنسفكأيشن لذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام هيمocytometer أو مكافحة الخلايا التلقائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه العدد المطلوب من الخلايا في أنابيب متعددة 50 مل في 800 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد طاف الطرد المركزي تجاهل وresuspend الخلايا في 10 مل cytomix المعدلة (0.8 ملي EGTA، 24 ملي بوكل، 0.15 ملي CaCl 2 و 10 ملي فوسفات البوتاسيوم العازلة pH7.6، 25 ملي HEPES-كوه pH7.6، 2.6 ملي MgCl 2، 0.5٪ (ث / ت) الجلوكوز، 100 ميكروغرام / مل BSA، 1 ملم هيبوزانتين، 144 ملي السكروز) في أنبوب. نقل عن حلول الخلية إلى أنبوب واحد وتدور مرة أخرى في 800 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي، وتجاهل طاف و resuspend الخلايا في 23 مل من cytomix تعديل لتركيز النهائي من 5 × 10 7 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الخلايا هي الغزل، إضافة 1 مل من SDM-79 وسائل الإعلام إلى كل بئر من لوحات زراعة الأنسجة 4 × 24 أيضا. تسمية لوحات م ورسم حلقة حول جيدا A1 على كل لوحة في علامة دائمة للمساعدة في توجيه لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط معالج لوحة لelectroporator. على electroporaتعيين وحدة تور الجهد إلى 1500 V، وطول النبض إلى 100 μsec وعدد النبضات إلى 12 والفترة النبض إلى 500 مللي ثانية. على معالج لوحة، وتعيين عدد النبض إلى 1. وهذا يضمن أن هذا electroporator سيتم تطبيق نبضة واحدة على كل من 12 عمودا من لوحة Electroporation لل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام P200 12 قناة ماصة الأقنية، ونقل ردود الفعل PCR من لوحة PCR إلى لوحات Electroporation للتصرف 96-جيدا، والفجوة 4 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تم نسج الخلايا ومعلق على التركيز النهائي 5 × 10 7 خلية / مل (الخطوة 3.7)، ونقل إلى خزان كاشف. ماصة 200 ميكرولتر من محلول خلية في كل بئر من لوحة Electroporation للاستخدام P200 12 قناة متعددة ماصة، مع مزيج من المنتجات PCR من قبل pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الأنسجة إزالة أي قطرات من الجزء العلوي من لوحة لتجنب قصيرة الدوائر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق هذا الفيلم ختم المقدمة في التعبئة والتغليف لوحة إلى الجزء العلوي من لوحة Electroporation لل، ونقاط البيعitioning عليه وذلك لترك فتحات للأقطاب التي تم اكتشافها في الجزء العلوي والسفلي من كل عمود. تجنب تغطي النقاط التي أثيرت تستخدم لتوجيه الفيلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل لوحة Electroporation للفي معالج لوحة وإغلاق الغطاء. اضغط على &quot;نبض&quot; على وحدة electroporator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد Electroporation لل، بسرعة نقل الخلايا من لوحة Electroporation لل96-جيدا لوحات زراعة الأنسجة 4 × 24-جيدا. لنقل الخلايا، واستخدام P200 12 قناة متعددة ماصة مع كل طرف الآخر مفقود من هذا القبيل أن 6 نصائح المتبقية تصطف مع 6 صفوف في لوحة زراعة الأنسجة 24-جيدا. نقل الخلايا electroporated في لوحات electroporations 96-جيدا في نمط محدد مسبقا إلى لوحات زراعة الأنسجة 24-جيدا (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد نصائح ماصة P200 - لكل 96-جيدا ترنسفكأيشن إعداد 2 صناديق من 96 نصائح مع كل عمود آخر إزالتها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الآبار A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 على لوحة Electroporation لل96-جيدا للوحة صف ألف من لوحات زراعة الأنسجة 24-جيدا، B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 في صف وB، C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 في صف وC وD1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 في صف وD. بعد نقل كل مجموعة من 6 آبار من لوحة 96-جيدا لوحة 24-جيدا، ثم يتم غسلها الآبار في لوحة 96-جيدا مع وسائل الإعلام من الآبار المقابلة في 24- جيد ثم يتم نقلها لوحة وغسل العودة إلى بئر في 24 لوحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> آبار نقل E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 على لوحة Electroporation لل96-جيدا ل24-جيدا لوحة B الصف A، F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 في صف وB، G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 في صف وC و H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 في صف وD. بعد نقل كل مجموعة من 6 آبار من لوحة 96-جيدا لوحة 24-جيدا، والآبار في ال 96 ثم تغسل لوحة -well مع وسائل الإعلام من الآبار المقابلة في 24 لوحة جيدا ويغسل ثم يتم نقلها إلى بئر في 24 لوحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> آبار نقل A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 على لوحة Electroporation لل96-جيدا ل24-جيدا لوحة C الصف A، B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 في صف وB، C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 في صف وC و D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 في صف وD. بعد نقل كل مجموعة من 6 آبار من 96 لوحة -well إلى 24 لوحة جيدا، ثم يتم غسلها الآبار في لوحة 96-جيدا مع وسائل الإعلام من الآبار المقابلة في 24 لوحة جيدا ويغسل ثم يتم نقلها إلى بئر في 24 لوحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> آبار نقل E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 على لوحة Electroporation لل96-جيدا ل24-جيدا لوحة D الصف A، F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 في صف وB، G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 في صف وC و H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 في صف وD. بعد نقل كل مجموعة من 6 آبار من لوحة 96-جيدا لوحة 24-جيدا، والآبار في ال 96 ثم تغسل لوحة -well مع وسائل الإعلام من الآبار المقابلة في 24 لوحة جيدا ويغسل ثم يتم نقلها إلى بئر في 24 لوحة جيدا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام النقيض من المرحلة المجهر المقلوب، فحص 1 جيدا من كل عمود للتحقق من الخلايا. سوف يكون هناك خليط من الخلايا الحية والميتة معكمية كبيرة من الحطام الخلية. الخلايا الحية يمكن تمييزها عن الخلايا الميتة لأنها سوف يكون مشرقا تحت المجهر مرحلة التباين وسوف تتحرك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحات 24-جيدا في ذلك، مربع من البلاستيك نظيفة مع غطاء التي تشكل ختم ضيق. وضع مربع في 28 درجة مئوية الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بين 6-8 ساعة في وقت لاحق، إضافة 1 مل من SDM-79 مع 10٪ FCS تحتوي على المضادات الحيوية الانتقائية 2X إلى كل بئر. في تجربتنا، وخطوط الخلايا حيث يتم وضع علامة على الجينات على محطة N مقاومة لتركيزات أعلى من المخدرات انتقائية. لذلك، وذلك باستخدام blasticidin على سبيل المثال، وضع علامات على محطة N يتطلب تركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل blasticidin ووضع علامات على C محطة يتطلب تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل blasticidin. ملاحظة: خطوط الخلايا المعدلة وراثيا تصبح مرئية 9-10 أيام بعد ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرور ما لا يقل عن مرتين في المخدرات الطازجة وسائل الإعلام قبل التحليل. ويبين الشكل 2B النتائج من نموذجية حوالة 96-جيداction لوضع علامات على 96 البروتينات المختلفة على محطة N. تقييم كل بئر من قبل النقيض من المرحلة المجهر لتحديد ما إذا كان يحتوي على الخلايا السليمة، ومقاومة المخدرات. بئر صحي يحتوي في الغالب (&lt;95٪) خلايا نشطة للغاية التي هي مشرق في المجهر عقد المرحلة. مطلوب تحليلها لاحقا بواسطة المجهر epifluorescence أو لطخة غربية لتحديد ما إذا كان البروتين تم وضع علامة عليها بنجاح. </li></ol>

<ol>
	<li>Kelly, S., Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+in+Trypanosoma+brucei:+a+collection+of+vectors+for+the+expression+of+tagged+proteins+from+endogenous+and+ectopic+gene+loci.">Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci.</a> Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).</li><li>Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interference+in+Trypanosoma+brucei+by+heritable+and+inducible+double-stranded+RNA.">Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA.</a> RNA. 6 (7), 1069-1076 (2000).</li><li>Alsford, S., Turner, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+phenotyping+using+parallel+sequencing+of+RNA+interference+targets+in+the+African+trypanosome.">High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome.</a> Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).</li><li>Alsford, S., Eckert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+decoding+of+antitrypanosomal+drug+efficacy+and+resistance.">High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance.</a> Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).</li><li>Mony, B. M., MacGregor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+dissection+of+the+quorum+sensing+signalling+pathway+in+Trypanosoma+brucei.">Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).</li><li>Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., S&#233;raphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration+:+Abstract+Nature+Biotechnology.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology.</a> Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Los, G. V., Encell, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag:+A+Novel+Protein+Labeling+Technology+for+Cell+Imaging+and+Protein+Analysis.">HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).</li><li>Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolkit+enabling+efficient,+scalable+and+reproducible+gene+tagging+in+trypanosomatids.">A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids.</a> Open biol. 5 (1), 140197 (2015).</li><li>Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+and+optimized+single+marker+system+for+generating+Trypanosoma+brucei+cell+lines+expressing+T7+RNA+polymerase+and+the+tetracycline+repressor.">A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor.</a> Open biol. 2 (2), 110037 (2012).</li><li>Lam, S. S., Martell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).</li><li>Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells,+tissues,+and+organisms.">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLoS biology. , (2011).</li><li>Schimanski, B., Nguyen, T. N., G&#252;nzl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+tandem+affinity+purification+of+trypanosome+protein+complexes+based+on+a+novel+epitope+combination.">Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination.</a> Eukaryotic Cell. , (2005).</li><li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei.">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

وقد وفرت تحسينات كبيرة في حساسية البروتينات وطرق transcriptomics في 5-10 سنوات الماضية بيانات قيمة عن الآلاف من الجينات ومنتجاتها. ومع ذلك، فإن أدوات للتصدي لها وظيفة هذه البروتينات لا تواكب. وضع علامات على بروتين يسهل العديد من التجارب لتحديد وظيفتها. على سبيل المثال، وهو بروتين يمكن أن تنصهر لبروتين فلوري في مجموعة متنوعة من الألوان المختلفة لتسهيل توطين وشارك في توطين الدراسات. الكلمات وضعت لالمجهر الإلكتروني، مثل APEX2 أو miniSOG 11،12، تسمح توطين التركيبية للبروتين الكلمات الدلالية. الكلمات الدلالية لالكيمياء الحيوية، مثل علامة TAP، وProtC-TEV-ProtA (PTP) علامة 7،13 تسمح تنقية المجمعات المرتبطة البروتين لتحديد الشركاء ملزمة أو في فحوصات البيوكيميائية في المختبر. الخطوات المحددة التي تعتبر بالغة الأهمية لنجاح protocرأ هي: إدماج DMSO في مزيج PCR ماستر 1، تجميد PCR ميكس ماجستير 1 قبل إضافة ميكس ماستر 2، واستخدام البلمرة التجاري في ميكس ماجستير 2 وتعديل المخزن المؤقت cytomix Electroporation لل. في تجربتنا، فمن الضروري استخدام ضعف عدد الخلايا للC تعداء محطة العلامات بالنسبة للN تعداء محطة العلامات من أجل تحقيق نسبة مماثلة من الآبار إيجابية. لذلك، يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات كما هو موضح. ومن المرجح فقط أن تكون ناجحة عندما transfecting والحشرات procyclic شكل المثقية هذه التقنية. أشكال مجرى الدم لديهم أقل كفاءة ترنسفكأيشن 14، وعلاوة على ذلك فهي عرضة للوفاة خلال اختيار نظرا لسمية التي تعتمد على كثافة أن لا علاقة للدواء انتقائية. وبالتالي، يمثل بروتوكول لدينا السابق أفضل التقنيات الحالية لوضع علامات على شكل المثقبيات مجرى الدم 9. ومن المرجح أيضا أن العابرةوكفاءة الخمج (العدوى) تختلف يعتمد على عزل المثقية محددة. وكان محسن هذا البروتوكول باستخدام 927 SMOX أشكال procyclic - سلالات أخرى قد تتطلب التحسين إضافية. التدابير التي قد تزيد من احتمال النجاح وتشمل: زيادة كمية PCR amplicon، وزيادة عدد الخلايا المدرجة في ترنسفكأيشن. ونحن نقدم وسيلة حيث مئات من البروتينات يمكن الموسومة بشكل متواز. وهذا سيسهل دراسات واسعة النطاق على توطين والتفاعل، واستكمال قواعد البيانات الكبيرة القائمة وتوفير معلومات لا تقدر بثمن للمجتمع. هي قوالب التمهيدي متوفرة عند الطلب وقائمة قوالب البلازميدات هو متاح من: http://www.sdeanresearch.com/

المثقبية البروسية هو طفيلي المسبب trypanosomasis افريقيا البشرية وناغانا في الماشية. ت. البروسية هو كائن حي مثالية لتحليل وظيفة البروتين بسبب مزيج من العوامل الوراثية ذات جودة عالية، والعديد من البروتينات ومجموعات البيانات transcriptomics والأدوات الجزيئية متطورة 1-3. وقد أدى التقدم في البروتينات والتسلسل في مجموعات كبيرة من البيانات التي تبرز يحتمل أن تكون جينات مثيرة للاهتمام 4-6. ومع ذلك، فإن العديد من الجينات لديهم الحد الأدنى من المعلومات المرتبطة بها في قواعد البيانات الموجودة. ولذلك هناك حاجة إلى طريقة الإنتاجية العالية للمساعدة توصيف وظيفي البروتين. التعبير عن بروتين الموسومة يمكن أن تعطي تعدد الرؤى إلى وظيفة البروتين و. على سبيل المثال، وهو بروتين الموسومة ب بروتين فلوري أو حاتمة يمكن أن تكون مترجمة بواسطة المجهر مضان، الذي يعطي معلومات عن مكان وجود بروتعين يمكن ممارسة التأثير البيولوجي. بدلا من ذلك، وهو بروتين ذات الكلمات الدلالية مع TAP 7، 8 HaloTag أو علامة يمكن ان يكون له تنقيته لفحوصات الكيمياء الحيوية وتحديد الشركاء تفاعلها. وضعنا مؤخرا منهجية وضع علامات قوية لT. البروسية 9. تستخدم هذه التمهيدي طويلة PCR لتوليد الحمض النووي لترنسفكأيشن ويسمح وضع علامات على العشرات من البروتينات في موازاة - تحسنا كبيرا على البروتوكولات الحالية. ونحن قد تحسنت الآن قابلية هذا البروتوكول في أشكال procyclic بأمر من حجمها. هنا، نقدم طريقة لدينا حيث أننا أداء PCR وترنسفكأيشن في لوحات 96-جيدا، مع انتعاش واختيار تحدث في 24 لوحات جيدا. كما يمكن الآن الموسومة مئات من البروتينات بشكل متواز وهذه الطريقة توفر وسيلة فعالة من حيث التكلفة وقابلا للعلامات الجينوم المثقية بأكمله.

<table><tbody><tr><td>Oligonucleotide</td><td>Life technologies</td><td>na</td><td>desalt only (do not use additional purification)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Roche</td><td>Included with the Expand HiFi pack</td><td>Must be PCR grade</td></tr><tr><td>dNTP</td><td>any reputable</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Expand HiFi polymerase</td><td>Roche</td><td>11759078001</td><td></td></tr><tr><td>BTX ECM830</td><td>Harvard Apparatus</td><td></td><td>Electroporator</td></tr><tr><td>HT-200 plate handler</td><td>Harvard Apparatus</td><td>HT-200</td><td>Handles the 96-well eletroplates</td></tr><tr><td>MOS 96 ELECTROPLATE 4 mm</td><td>Harvard Apparatus</td><td>45-0452</td><td>Electroplate for the 96-well electroporation</td></tr><tr><td>Blasticidin S Hydrochloride</td><td>Melford</td><td>3513-03-9</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin b Gold</td><td>Invivogen</td><td>ant-hg-1</td><td></td></tr><tr><td>Phleomycin</td><td>Melford</td><td>P0187</td><td></td></tr><tr><td>225 cm TC Flask, canted neck, phenolic cap</td><td>Appletonwoods</td><td>BC006</td><td></td></tr><tr><td>24 well culture plates</td><td>Appletonwoods</td><td>BC017</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&amp;reg; PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z606634-1EA</td><td></td></tr><tr><td>96-well Multiply&amp;reg; PCR plate with lateral skirt</td><td>Sarstedt</td><td>72.1979.203</td><td></td></tr></tbody></table>

high-throughput gene tagging in trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

في هذا ترنسفكأيشن التمثيلي، وقد صممت الاشعال باستخدام البرنامج النصي TagIt بيرل 9 و تصنيعه تجاريا. تم إجراء 96-جيدا PCR والتحقق من صحتها كما هو موضح (الشكل 1A)؛ في هذا المثال، كانت 95/96 تقارير إنجاز المشروعات الناجحة (الشكل 1B). في تجربتنا، وتكرار ردود الفعل فشلت إما مع الاشعال الأصلية أو توليفها إعادة الاشعال لا يؤدي إلى PCR ناجحة. تم نقل amplicons في لوحات Electroporation لل96-جيدا ل electroporation (الشكل 2A)، ثم نقل إلى لوحات ثقافة 24-جيدا للانتعاش والاختيار. بعد ما يكفي من الوقت للسماح التحديد إلى أن يحدث، وسجل الآبار من أجل البقاء قبل إجراء مزيد من التحليل. في هذا المثال، كانت 88/96 بئرا (92٪) إيجابية بعد اختيار 15 يوما. <iبديل ملغ = &quot;الشكل 1&quot; SRC = &quot;/ ملفات / ftp_upload / 54342 / 54342fig1.jpg&quot; /&gt; الشكل 1: التحقق من التمهيدي طويلة PCR (A) نمط لنقل المنتجات PCR من 96-جيدا لوحة PCR على هلام الاغاروز للتأكد من صحة PCR. (ب) 96-PCR جيدا هلام التحقق من صحة التمثيل لوضع علامات على 95 الجينات على محطة N، و 1 amplicon التي لا تحتوي على 5 &quot;التي تستهدف تناظر ليكون بمثابة سيطرة سلبية في ترنسفكأيشن. يتم تحميل العينات على 1٪ (ث / ت) هلام الاغاروز وحلها في 100 فولت لمدة 30 دقيقة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" /> الشكل 2: 96-جيدا Electroporation للواختيار (A) نمط لنقل خلايا electroporated من 96 جيدا بلات Electroporation لل.ه لوحات زراعة الأنسجة 24-جيدا. (ب) رسم تخطيطي يظهر الحي / الميت التهديف نموذجي بعد 15 يوما من التحديد في 24 لوحات جيدا. يمثل اللون الأخضر على ترنسفكأيشن ناجحة، يمثل الرمادي جيدا مع الخلايا الميتة فقط. في هذا المثال، 88/96 (92٪) من الآبار الواردة الطفيليات transfected بنجاح. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei at JoVE.com

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

الإنتاجية العالية جين توصيف في<em&gt; المثقبية البروسية</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

high-throughput-gene-tagging-in-trypanosoma-brucei

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

7.9K Views.  University of Oxford. Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Video: High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

النظر في هيكل G - المتراكمة في التيلومير المثقبية البروسية</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target against T. cruzi, it is important to validate the essentiality of the target gene in the mammalian stage of the parasite, the amastigote. Amastigotes of T. cruzi replicate inside the host cell; thus, it is difficult to conduct a knockout experiment without going through other developmental stages. Recently, our group reported a growth condition in which the amastigote can replicate axenically for up to 10 days without losing its amastigote-like properties. By using this temporal axenic amastigote culture, we successfully introduced gRNAs directly into the Cas9-expressing amastigote to cause gene knockouts and analyzed their phenotypes exclusively in the amastigote stage. In this report, we describe a detailed protocol to produce in vitro derived extracellular amastigotes, and to utilize the axenic culture in a CRISPR/Cas9-mediated knockout experiment. The growth phenotype of knockout amastigotes can be evaluated either by cell counts of the axenic culture, or by replication of intracellular amastigote after host cell invasion. This method bypasses the parasite stage differentiation normally involved in producing a transgenic or a knockout amastigote. Utilization of the temporal axenic amastigote culture has the potential to expand the experimental freedom of stage-specific studies in T. cruzi.

Introducing a Gene Knockout Directly Into the Amastigote Stage of Trypanosoma cruzi Using the CRISPR/Cas9 System

Here, we describe a protocol to introduce a gene knockout into the extracellular amastigote of Trypanosoma cruzi, using the CRISPR/Cas9 system. The growth phenotype can be followed up either by cell counting of axenic amastigote culture or by proliferation of intracellular amastigotes after host cell invasion.

إدخال الجين بالضربة القاضية مباشرة في مرحلة Amastigote من التريبانوسوما كروزي باستخدام نظام CRISPR/Cas9

Trypanosoma cruzi is a pathogenic protozoan parasite that causes Chagas&#8217; disease mainly in Latin America. In order to identify a novel drug target ...

Genetics

Genetic Manipulation in &Delta;ku80 Strains for Functional Genomic Analysis of Toxoplasma gondii

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene function and phenotype(s). The development of mutant strains with targeted gene deletions, targeted mutations, complemented gene function, and/or tagged genes provides powerful strategies to address gene function, particularly if these genetic manipulations can be efficiently targeted to the gene locus of interest using integration mediated by double cross over homologous recombination.
Due to very high rates of nonhomologous recombination, functional genomic analysis of Toxoplasma gondii has been previously limited by the absence of efficient methods for targeting gene deletions and gene replacements to specific genetic loci. Recently, we abolished the major pathway of nonhomologous recombination in type I and type II strains of T. gondii by deleting the gene encoding the KU80 protein1,2. The &Delta;ku80 strains behave normally during tachyzoite (acute) and bradyzoite (chronic) stages in vitro and in vivo and exhibit essentially a 100% frequency of homologous recombination. The &Delta;ku80 strains make functional genomic studies feasible on the single gene as well as on the genome scale1-4.
Here, we report methods for using type I and type II &Delta;ku80&Delta;hxgprt strains to advance gene targeting approaches in T. gondii. We outline efficient methods for generating gene deletions, gene replacements, and tagged genes by targeted insertion or deletion of the hypoxanthine-xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HXGPRT) selectable marker. The described gene targeting protocol can be used in a variety of ways in &Delta;ku80 strains to advance functional analysis of the parasite genome and to develop single strains that carry multiple targeted genetic manipulations. The application of this genetic method and subsequent phenotypic assays will reveal fundamental and unique aspects of the biology of T. gondii and related significant human pathogens that cause malaria (Plasmodium sp.) and cryptosporidiosis (Cryptosporidium).

Here we report a method for using type I and type II &Delta;ku80 strains of Toxoplasma gondii to efficiently generate targeted gene deletions and gene replacements for functional genomic analysis.

التلاعب الجيني في<em&gt; Δku80</em&gt; سلالات لتحليل الجينوم الوظيفي لل<em&gt; التوكسوبلازما جوندياي</em

Targeted genetic manipulation using homologous recombination is the method of choice for functional genomic analysis to obtain a detailed view of gene ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in cattle1. The parasite alternates between the bloodstream of the mammalian host and the tsetse fly vector. The composition of many cellular organelles changes in response to these different extracellular conditions2-5.
Glycosomes are highly specialized peroxisomes in which many of the enzymes involved in glycolysis are compartmentalized. Glycosome composition changes in a developmental and environmentally regulated manner4-11. Currently, the most common techniques used to study glycosome dynamics are electron and fluorescence microscopy; techniques that are expensive, time and labor intensive, and not easily adapted to high throughput analyses.
To overcome these limitations, a fluorescent-glycosome reporter system in which enhanced yellow fluorescent protein (eYFP) is fused to a peroxisome targeting sequence (PTS2), which directs the fusion protein to glycosomes12, has been established. Upon import of the PTS2eYFP fusion protein, glycosomes become fluorescent. Organelle degradation and recycling results in the loss of fluorescence that can be measured by flow cytometry. Large numbers of cells (5,000 cells/sec) can be analyzed in real-time without extensive sample preparation such as fixation and mounting. This method offers a rapid way of detecting changes in organelle composition in response to fluctuating environmental conditions.

Glycosome dynamics in African trypanosomes are difficult to study by traditional cell biology techniques such as electron and fluorescence microscopy. As a means of observing dynamic organelle behavior, a fluorescent-organelle reporter system has been used in conjunction with flow cytometry to monitor real-time glycosome dynamics in live parasites.

باستخدام البروتينات الفلورية لرصد ديناميات Glycosome في المثقبيات الأفريقي

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many non-endemic countries due to the increase in migration. This disease affects nearly 8 million people, with new cases estimated at 50,000 per year. In the 1960s and 70s, two drugs for ChD treatment were introduced: nifurtimox and benznidazole (BZN). Both are effective in newborns and during the acute phase of the disease but not in the chronic phase, and their use is associated with important side effects. These facts underscore the urgent need to intensify the search for new drugs against T. cruzi.
T. cruzi is transmitted through hematophagous insect vectors of the Reduviidae and Hemiptera families. Once in the mammalian host, it multiplies intracellularly as the non-flagellated amastigote form and differentiates into the trypomastigote, the bloodstream non-replicative infective form. Inside the insect vector, trypomastigotes transform into the epimastigote stage and multiply through binary fission.
This paper describes an assay based on measuring the activity of the cytoplasmic &#946;-galactosidase released into the culture due to parasites lysis by using the substrate, chlorophenol red &#946;-D-galactopyranoside (CPRG). For this, the T. cruzi Dm28c strain was transfected with a &#946;-galactosidase-overexpressing plasmid and used for in vitro pharmacological screening in epimastigote, trypomastigote, and amastigote stages. This paper also describes how to measure the enzymatic activity in cultured epimastigotes, infected Vero cells with amastigotes, and trypomastigotes released from the cultured cells using the reference drug, benznidazole, as an example. This colorimetric assay is easily performed and can be scaled to a high-throughput format and applied to other T. cruzi strains.

In Vitro Drug Screening Against All Life Cycle Stages of Trypanosoma cruzi Using Parasites Expressing &#946;-galactosidase

We describe a high-throughput colorimetric assay measuring &#946;-galactosidase activity in three life cycle stages of Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease. This assay can be used to identify trypanocidal compounds in an easy, fast, and reproducible manner.

في المختبر فحص المخدرات ضد جميع مراحل دورة حياة المثقبيات الكروزية باستخدام الطفيليات التي تعبر عن β-galactosidase

Trypanosoma cruzi is the causative agent of Chagas disease (ChD), an endemic disease of public health importance in Latin America that also affects many ...

Biochemistry

Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades the central nervous system (CNS). In vivo study of the late stage has been limited as traditional methodologies require the removal of the brain to determine the presence of the parasites.
Bioluminescence imaging is a non-invasive, highly sensitive form of optical imaging that enables the visualization of a luciferase-transfected pathogen in real-time. By using a transfected trypanosome strain that has the ability to produce late stage disease in mice we are able to study the kinetics of a CNS infection in a single animal throughout the course of infection, as well as observe the movement and dissemination of a systemic infection.
Here we describe a robust protocol to study CNS infections using a bioluminescence model of African trypanosomiasis, providing real time non-invasive observations which can be further analyzed with optional downstream approaches.

This manuscript describes the use of a bioluminescent strain of African trypanosomes to enable the tracking of late stage infection and demonstrates how in vivo live imaging can be used to visualize infections within the central nervous system in real-time.

تلألؤ بيولوجي التصوير لكشف العدوى المرحلة المتأخرة من داء المثقبيات الأفريقي

Human African trypanosomiasis (HAT) is a multi-stage disease that manifests in two stages; an early blood stage and a late stage when the parasite invades ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

الكشف عن<em&gt; المثقبية البروسية</em&gt; التبديل البديل البروتين السكري السطح بواسطة المغناطيسي خلية المنشط فرز والتدفق الخلوي

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers (Diethylaminoethyl-cellulose Columns)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is the best method for diagnosis of first stage HAT and furthermore this parasite purification method permits serological and research investigations.
HAT is caused by Tsetse fly transmitted Trypanosoma brucei gambiense and T. b. rhodesiense. Related trypanosomes are the causative agents of animal trypanosomiasis. Trypanosome detection is essential for HAT diagnosis, treatment and follow-up. The technique described here is the most sensitive parasite detection technique, adapted to field conditions for the diagnosis of T. b. gambiense HAT and can be completed within one hour. Blood is layered onto an anion-exchanger column (DEAE cellulose) previously adjusted to pH 8, and elution buffer is added. Highly negatively charged blood cells are adsorbed onto the column whereas the less negatively charged trypanosomes pass through. Collected trypanosomes are pelleted by centrifugation and observed by microscopy. Moreover, parasites are prepared without cellular damage whilst maintaining their infectivity.
Purified trypanosomes are required for immunological testing; they are used in the trypanolysis assay, the gold standard in HAT serology. Stained parasites are utilized in the card agglutination test (CATT) for field serology. Antigens from purified trypanosomes, such as variant surface glycoprotein, exoantigens, are also used in various immunoassays. The procedure described here is designed for African trypanosomes; consequently, chromatography conditions have to be adapted to each trypanosome strain, and more generally, to the blood of each species of host mammal.
These fascinating pathogens are easily purified and available to use in biochemical, molecular and cell biology studies including co-culture with host cells to investigate host-parasite relationships at the level of membrane receptors, signaling, and gene expression; drug testing in vitro; investigation of gene deletion, mutation, or overexpression on metabolic processes, cytoskeletal biogenesis and parasite survival.

Purification of Extracellular Trypanosomes, Including African, from Blood by Anion-Exchangers Diethylaminoethyl-cellulose Columns

This method of trypanosome separation from blood depends on their surface charge being less negative than mammalian blood cells. Infected blood is placed and treated on an anion-exchanger column. This method, the most fitting diagnostic for African trypanosomiasis, provides purified parasites for immunological, biological, biochemical, pharmaceutical and molecular biology investigations.

تنقية مثقبيات خارج الخلية، بما في ذلك البلدان الأفريقية، من الدم بشاردة-مبادلات (ديثيلامينوثيل-السليلوز أعمدة)

This method allows the separation of trypanosomes, parasites responsible for animal and human African trypanosomiasis (HAT), from infected blood. This is ...

تطوير مستشعر قائم على pHluorin2 لدرجة الحموضة الجليكوزومية في المثقبية البروسية

Measuring Dynamic Glycosomal pH Changes in Living Trypanosoma brucei

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. Little is known about the cellular responses generated when environmental glucose levels change. In both bloodstream and procyclic form (insect stage) parasites, glycosomes house most of glycolysis. These organelles are rapidly acidified in response to glucose deprivation, which likely results in the allosteric regulation of glycolytic enzymes such as hexokinase. In previous work, localizing the chemical probe used to make pH measurements was challenging, limiting its utility in other applications.
This paper describes the development and use of parasites that express glycosomally localized pHluorin2, a heritable protein pH biosensor. pHluorin2 is a ratiometric pHluorin variant that displays a pH (acid)-dependent decrease in excitation at 395 nm while simultaneously yielding an increase in excitation at 475 nm. Transgenic parasites were generated by cloning the pHluorin2 open reading frame into the trypanosome expression vector pLEW100v5, enabling inducible protein expression in either lifecycle stage. Immunofluorescence was used to confirm the glycosomal localization of the pHluorin2 biosensor, comparing the localization of the biosensor to the glycosomal resident protein aldolase. The sensor responsiveness was calibrated at differing pH levels by incubating cells in a series of buffers that ranged in pH from 4 to 8, an approach we have previously used to calibrate a fluorescein-based pH sensor. We then measured pHluorin2 fluorescence at 405 nm and 488 nm using flow cytometry to determine glycosomal pH. We validated the performance of the live transgenic pHluorin2-expressing parasites, monitoring pH over time in response to glucose deprivation, a known trigger of glycosomal acidification in PF parasites. This tool has a range of potential applications, including potentially being used in high-throughput drug screening. Beyond glycosomal pH, the sensor could be adapted to other organelles or used in other trypanosomatids to understand pH dynamics&#160;in the live cell setting.

تسليط الضوء على المؤلف: التطورات في مراقبة درجة الحموضة السكرية في المثقبية بروسي باستخدام المستشعر الحيوي pHluorin2

We describe a method to study how pH responds to environmental cues in the glycosomes of the bloodstream form of African trypanosomes. This approach involves a pH-sensitive heritable protein sensor in combination with flow cytometry to measure pH dynamics, both as a time-course assay and in a high-throughput screen format.

قياس التغيرات الديناميكية في درجة الحموضة الجليكوزومية في المثقبيات الحية بروسي

Glucose metabolism is critical for the African trypanosome, Trypanosoma brucei, as an essential metabolic process and regulator of parasite development. ...

الإنتاجية العالية جين توصيف في

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

النظر في هيكل G - المتراكمة في التيلومير المثقبية البروسية

إدخال الجين بالضربة القاضية مباشرة في مرحلة Amastigote من التريبانوسوما كروزي باستخدام نظام CRISPR/Cas9

التلاعب الجيني في

باستخدام البروتينات الفلورية لرصد ديناميات Glycosome في المثقبيات الأفريقي

في المختبر فحص المخدرات ضد جميع مراحل دورة حياة المثقبيات الكروزية باستخدام الطفيليات التي تعبر عن β-galactosidase

تلألؤ بيولوجي التصوير لكشف العدوى المرحلة المتأخرة من داء المثقبيات الأفريقي

الكشف عن

تنقية مثقبيات خارج الخلية، بما في ذلك البلدان الأفريقية، من الدم بشاردة-مبادلات (ديثيلامينوثيل-السليلوز أعمدة)

قياس التغيرات الديناميكية في درجة الحموضة الجليكوزومية في المثقبيات الحية بروسي

قياس التغيرات الديناميكية في درجة الحموضة الجليكوزومية في المثقبيات الحية بروسي