SD was supported by a Sir Henry Wellcome Fellowship [092201/Z/10/Z]. This work was funded by Wellcome Trust grants [WT066839MA][104627/Z/14/Z][108445/Z/15/Z] to Professor Keith Gull. We would like to thank Professor Keith Gull for helpful conversations and insights.

1. 96-جيدا طويل التمهيدي PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تجميد 96-جيدا PCR برودة في الثلاجة -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب 10 مل، وإعداد ميكس ماجستير A: 2100 ميكرولتر ده 2 O، و 105 ميكرولتر PCR الصف DMSO، 105 ميكرولتر 10 ملي dNTPs و 105 ميكرولتر pPOT قالب (25 نانوغرام / ميكرولتر) 9، عن حجم ما مجموعه 2،415 ميكرولتر لكل لوحة . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قسامة 23 ميكرولتر في كل بئر من لوحة 96-جيدا PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 ميكرولتر من 100 ميكرومتر المجمعة الاشعال لكل محملة جيدا باستخدام P20 12 قناة متعددة ماصة. ختم مع فيلم، ومكان لوحة على برودة PCR قبل المبردة والسماح لتجميد مدة لا تقل عن 20 دقيقة في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب 10 مل، وإعداد ميكس ماجستير ب: 2048 ميكرولتر ده 2 O، 525 ميكرولتر العازلة 10X، 52.5 البلمرة ميكرولتر لإجمالي حجم 2626 ميكرولتر لكل لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحة وPCR برودة من الفريزر -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع لوحة لا تزال على برودة PCR، إضافة 25 ميكرولتر ميكس ماجستير B على رأس جمدتن ميكس ماجستير ولحجم رد الفعل ما مجموعه 50 ميكرولتر. هذا هو الوقت الحرج، ويجب أن تكتمل قبل ميكس A يمكن أن ذوبان الجليد. ختم لوحة مع الفيلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين cycler الحرارية على النحو التالي: 94 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، ثم 30 دورات من 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 65 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة تليها فترة التمديد النهائي من 72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل لوحة PCR بعد أن بلغ كتلة 94 درجة مئوية. </li></ol> 2. التحقق من صحة 96-جيدا طويل التمهيدي PCR <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يلقي كبيرة 1٪ (ث / ت) هلام الاغاروز في تريس خلات EDTA (تاي) العازلة على التوالي مع أمشاط 4 × 28-جيدا لإعطاء جل مع 4 صفوف من الآبار. محاذاة أسنان بديلة للمشط مع نصائح من 12 قناة متعددة ماصة. بعناية غمر جل في تاي العازلة على التوالي بعد أن يتم تحميل الممرات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 1 كيلو بايت سلم الحمض النووي في شارع 1 و 28 بئر من كل صف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام P20 12 قناة ماصة الأقنية، ونقل 2 ميكرولتر من دير المنتج PCRectly إلى كل حارة من هلام (الشكل 1A). القيام بذلك بسرعة للحد من إمكانية تلوث amplicons. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل منتجات PCR من الصف ألف من لوحة PCR في الممرات الوتر من الصف 1st من هلام (A1 - حارة 3، A2 - حارة 5 ...... A11 - حارة 23، A12 - حارة 25) وتحميل المنتجات PCR من الصف B من لوحة PCR في الممرات حتى مرقمة من الصف الحادي 1 من هلام (B1 - حارة 4، A2 - حارة 6 ...... B11 - حارة 24، B12 - حارة 26). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل منتجات PCR من الصف C و D من لوحة PCR باستخدام نفس النمط كما هو موضح أعلاه، مع صف C في الممرات مرقمة والصف D الغريب في الممرات زوجية. يستمر هذا النمط التحميل حتى يتم تحميل كل بئر من لوحة PCR على هلام. ليس مطلوبا عازلة الحمض النووي التحميل لتحميل هذا الجل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجل في خزان تشغيل وملء خزان مع تاي العازلة تشغيل حتى يتم المغمورة هلام. تشغيل في 100 فولت لمدة 30 دقيقة وتصور باستخدام الأشعة فوق البنفسجية نقل transilluminator. انظر الشكل 1B لهلام سبيل المثال. ملاحظة: منتجات PCR يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لعدة أسابيع قبل ترنسفكأيشن </li></ol> 3. ترنسفكأيشن 96-جيدا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام T. البروسية procyclic خط الخلية شكل SMOXP9 10 لهذا الإجراء وتنمو في SDM-79 وسائل الإعلام التي تحتوي على 10٪ FCS 10. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام 1 × 10 7 خلايا لكل ترنسفكأيشن (ما مجموعه 1.1 × 10 9 خلايا) عندما وضع علامات على محطة N من البروتين و 2 × 10 7 خلايا لكل ترنسفكأيشن (ما مجموعه 2.2 × 10 9 خلايا) عندما وضع علامات على محطة C من البروتين. الحفاظ على الخلايا في منتصف سجل (1.2 × 10 6 -1 × 10 7 خلية / مل) لعدة أيام قبل ترنسفكأيشن وحصاد الخلايا لترنسفكأيشن في مناطق ذات كثافة من 5-8 × 10 6 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح للمنتجات PCR المجمدة لترنسفكأيشن لذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد الخلايا باستخدام هيمocytometer أو مكافحة الخلايا التلقائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه العدد المطلوب من الخلايا في أنابيب متعددة 50 مل في 800 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد طاف الطرد المركزي تجاهل وresuspend الخلايا في 10 مل cytomix المعدلة (0.8 ملي EGTA، 24 ملي بوكل، 0.15 ملي CaCl 2 و 10 ملي فوسفات البوتاسيوم العازلة pH7.6، 25 ملي HEPES-كوه pH7.6، 2.6 ملي MgCl 2، 0.5٪ (ث / ت) الجلوكوز، 100 ميكروغرام / مل BSA، 1 ملم هيبوزانتين، 144 ملي السكروز) في أنبوب. نقل عن حلول الخلية إلى أنبوب واحد وتدور مرة أخرى في 800 x ج لمدة 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الطرد المركزي، وتجاهل طاف و resuspend الخلايا في 23 مل من cytomix تعديل لتركيز النهائي من 5 × 10 7 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حين أن الخلايا هي الغزل، إضافة 1 مل من SDM-79 وسائل الإعلام إلى كل بئر من لوحات زراعة الأنسجة 4 × 24 أيضا. تسمية لوحات م ورسم حلقة حول جيدا A1 على كل لوحة في علامة دائمة للمساعدة في توجيه لوحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط معالج لوحة لelectroporator. على electroporaتعيين وحدة تور الجهد إلى 1500 V، وطول النبض إلى 100 μsec وعدد النبضات إلى 12 والفترة النبض إلى 500 مللي ثانية. على معالج لوحة، وتعيين عدد النبض إلى 1. وهذا يضمن أن هذا electroporator سيتم تطبيق نبضة واحدة على كل من 12 عمودا من لوحة Electroporation لل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام P200 12 قناة ماصة الأقنية، ونقل ردود الفعل PCR من لوحة PCR إلى لوحات Electroporation للتصرف 96-جيدا، والفجوة 4 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تم نسج الخلايا ومعلق على التركيز النهائي 5 × 10 7 خلية / مل (الخطوة 3.7)، ونقل إلى خزان كاشف. ماصة 200 ميكرولتر من محلول خلية في كل بئر من لوحة Electroporation للاستخدام P200 12 قناة متعددة ماصة، مع مزيج من المنتجات PCR من قبل pipetting. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الأنسجة إزالة أي قطرات من الجزء العلوي من لوحة لتجنب قصيرة الدوائر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق هذا الفيلم ختم المقدمة في التعبئة والتغليف لوحة إلى الجزء العلوي من لوحة Electroporation لل، ونقاط البيعitioning عليه وذلك لترك فتحات للأقطاب التي تم اكتشافها في الجزء العلوي والسفلي من كل عمود. تجنب تغطي النقاط التي أثيرت تستخدم لتوجيه الفيلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل لوحة Electroporation للفي معالج لوحة وإغلاق الغطاء. اضغط على &quot;نبض&quot; على وحدة electroporator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد Electroporation لل، بسرعة نقل الخلايا من لوحة Electroporation لل96-جيدا لوحات زراعة الأنسجة 4 × 24-جيدا. لنقل الخلايا، واستخدام P200 12 قناة متعددة ماصة مع كل طرف الآخر مفقود من هذا القبيل أن 6 نصائح المتبقية تصطف مع 6 صفوف في لوحة زراعة الأنسجة 24-جيدا. نقل الخلايا electroporated في لوحات electroporations 96-جيدا في نمط محدد مسبقا إلى لوحات زراعة الأنسجة 24-جيدا (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد نصائح ماصة P200 - لكل 96-جيدا ترنسفكأيشن إعداد 2 صناديق من 96 نصائح مع كل عمود آخر إزالتها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الآبار A1 / A3 / A5 / A7 / A9 / A11 على لوحة Electroporation لل96-جيدا للوحة صف ألف من لوحات زراعة الأنسجة 24-جيدا، B1 / B3 / B5 / B7 / B9 / B11 في صف وB، C1 / C3 / C5 / C7 / C9 / C11 في صف وC وD1 / D3 / D5 / D7 / D9 / D11 في صف وD. بعد نقل كل مجموعة من 6 آبار من لوحة 96-جيدا لوحة 24-جيدا، ثم يتم غسلها الآبار في لوحة 96-جيدا مع وسائل الإعلام من الآبار المقابلة في 24- جيد ثم يتم نقلها لوحة وغسل العودة إلى بئر في 24 لوحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> آبار نقل E1 / E3 / E5 / E7 / E9 / E11 على لوحة Electroporation لل96-جيدا ل24-جيدا لوحة B الصف A، F1 / F3 / F5 / F7 / F9 / F11 في صف وB، G1 / G3 / G5 / G7 / G9 / G11 في صف وC و H1 / H3 / H5 / H7 / H9 / H11 في صف وD. بعد نقل كل مجموعة من 6 آبار من لوحة 96-جيدا لوحة 24-جيدا، والآبار في ال 96 ثم تغسل لوحة -well مع وسائل الإعلام من الآبار المقابلة في 24 لوحة جيدا ويغسل ثم يتم نقلها إلى بئر في 24 لوحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> آبار نقل A2 / A4 / A6 / A8 / A10 / A12 على لوحة Electroporation لل96-جيدا ل24-جيدا لوحة C الصف A، B2 / B4 / B6 / B8 / B10 / B12 في صف وB، C2 / C4 / C6 / C8 / C10 / C12 في صف وC و D2 / D4 / D6 / D8 / D10 / D12 في صف وD. بعد نقل كل مجموعة من 6 آبار من 96 لوحة -well إلى 24 لوحة جيدا، ثم يتم غسلها الآبار في لوحة 96-جيدا مع وسائل الإعلام من الآبار المقابلة في 24 لوحة جيدا ويغسل ثم يتم نقلها إلى بئر في 24 لوحة جيدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> آبار نقل E2 / E4 / E6 / E8 / E10 / E12 على لوحة Electroporation لل96-جيدا ل24-جيدا لوحة D الصف A، F2 / F4 / F6 / F8 / F10 / F12 في صف وB، G2 / G4 / G6 / G8 / G10 / G12 في صف وC و H2 / H4 / H6 / H8 / H10 / H12 في صف وD. بعد نقل كل مجموعة من 6 آبار من لوحة 96-جيدا لوحة 24-جيدا، والآبار في ال 96 ثم تغسل لوحة -well مع وسائل الإعلام من الآبار المقابلة في 24 لوحة جيدا ويغسل ثم يتم نقلها إلى بئر في 24 لوحة جيدا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام النقيض من المرحلة المجهر المقلوب، فحص 1 جيدا من كل عمود للتحقق من الخلايا. سوف يكون هناك خليط من الخلايا الحية والميتة معكمية كبيرة من الحطام الخلية. الخلايا الحية يمكن تمييزها عن الخلايا الميتة لأنها سوف يكون مشرقا تحت المجهر مرحلة التباين وسوف تتحرك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لوحات 24-جيدا في ذلك، مربع من البلاستيك نظيفة مع غطاء التي تشكل ختم ضيق. وضع مربع في 28 درجة مئوية الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بين 6-8 ساعة في وقت لاحق، إضافة 1 مل من SDM-79 مع 10٪ FCS تحتوي على المضادات الحيوية الانتقائية 2X إلى كل بئر. في تجربتنا، وخطوط الخلايا حيث يتم وضع علامة على الجينات على محطة N مقاومة لتركيزات أعلى من المخدرات انتقائية. لذلك، وذلك باستخدام blasticidin على سبيل المثال، وضع علامات على محطة N يتطلب تركيز النهائي من 20 ميكروغرام / مل blasticidin ووضع علامات على C محطة يتطلب تركيز النهائي من 10 ميكروغرام / مل blasticidin. ملاحظة: خطوط الخلايا المعدلة وراثيا تصبح مرئية 9-10 أيام بعد ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرور ما لا يقل عن مرتين في المخدرات الطازجة وسائل الإعلام قبل التحليل. ويبين الشكل 2B النتائج من نموذجية حوالة 96-جيداction لوضع علامات على 96 البروتينات المختلفة على محطة N. تقييم كل بئر من قبل النقيض من المرحلة المجهر لتحديد ما إذا كان يحتوي على الخلايا السليمة، ومقاومة المخدرات. بئر صحي يحتوي في الغالب (&lt;95٪) خلايا نشطة للغاية التي هي مشرق في المجهر عقد المرحلة. مطلوب تحليلها لاحقا بواسطة المجهر epifluorescence أو لطخة غربية لتحديد ما إذا كان البروتين تم وضع علامة عليها بنجاح. </li></ol>

<ol>
	<li>Kelly, S., Reed, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genomics+in+Trypanosoma+brucei:+a+collection+of+vectors+for+the+expression+of+tagged+proteins+from+endogenous+and+ectopic+gene+loci.">Functional genomics in Trypanosoma brucei: a collection of vectors for the expression of tagged proteins from endogenous and ectopic gene loci.</a> Mol Biochem Parasitol. 154 (1), 103-109 (2007).</li><li>Wirtz, L. E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tightly+regulated+inducible+expression+system+for+conditional+gene+knock-outs+and+dominant-negative+genetics+in+Trypanosoma+brucei.">A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 99 (1), 89-101 (1999).</li><li>Shi, H., Djikeng, A., Mark, T., Wirtz, L. E., Tschudi, C., Ullu, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+interference+in+Trypanosoma+brucei+by+heritable+and+inducible+double-stranded+RNA.">Genetic interference in Trypanosoma brucei by heritable and inducible double-stranded RNA.</a> RNA. 6 (7), 1069-1076 (2000).</li><li>Alsford, S., Turner, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+phenotyping+using+parallel+sequencing+of+RNA+interference+targets+in+the+African+trypanosome.">High-throughput phenotyping using parallel sequencing of RNA interference targets in the African trypanosome.</a> Genome Res. 21 (6), 915-924 (2011).</li><li>Alsford, S., Eckert, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+decoding+of+antitrypanosomal+drug+efficacy+and+resistance.">High-throughput decoding of antitrypanosomal drug efficacy and resistance.</a> Nature. 482 (7384), 232-236 (2012).</li><li>Mony, B. M., MacGregor, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+dissection+of+the+quorum+sensing+signalling+pathway+in+Trypanosoma+brucei.">Genome-wide dissection of the quorum sensing signalling pathway in Trypanosoma brucei.</a> Nature. 505 (7485), 681-685 (2014).</li><li>Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., S&#233;raphin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration+:+Abstract+Nature+Biotechnology.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration : Abstract Nature Biotechnology.</a> Nature Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li><li>Los, G. V., Encell, L. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HaloTag:+A+Novel+Protein+Labeling+Technology+for+Cell+Imaging+and+Protein+Analysis.">HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis.</a> ACS Chem Biol. 3 (6), 373-382 (2008).</li><li>Dean, S., Sunter, J. D., Wheeler, R. J., Hodkinson, I., Gluenz, E., Gull, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+toolkit+enabling+efficient,+scalable+and+reproducible+gene+tagging+in+trypanosomatids.">A toolkit enabling efficient, scalable and reproducible gene tagging in trypanosomatids.</a> Open biol. 5 (1), 140197 (2015).</li><li>Poon, S. K., Peacock, L., Gibson, W., Gull, K., Kelly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+modular+and+optimized+single+marker+system+for+generating+Trypanosoma+brucei+cell+lines+expressing+T7+RNA+polymerase+and+the+tetracycline+repressor.">A modular and optimized single marker system for generating Trypanosoma brucei cell lines expressing T7 RNA polymerase and the tetracycline repressor.</a> Open biol. 2 (2), 110037 (2012).</li><li>Lam, S. S., Martell, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling.">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nature meth. 12 (1), 51-54 (2014).</li><li>Shu, X., Lev-Ram, V., Deerinck, T. J., Qi, Y., Ramko, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+encoded+tag+for+correlated+light+and+electron+microscopy+of+intact+cells,+tissues,+and+organisms.">A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues, and organisms.</a> PLoS biology. , (2011).</li><li>Schimanski, B., Nguyen, T. N., G&#252;nzl, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+tandem+affinity+purification+of+trypanosome+protein+complexes+based+on+a+novel+epitope+combination.">Highly efficient tandem affinity purification of trypanosome protein complexes based on a novel epitope combination.</a> Eukaryotic Cell. , (2005).</li><li>Burkard, G., Fragoso, C. M., Roditi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+stable+transformation+of+bloodstream+forms+of+Trypanosoma+brucei.">Highly efficient stable transformation of bloodstream forms of Trypanosoma brucei.</a> Mol Biochem Parasitol. 153 (2), 220-223 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

وقد وفرت تحسينات كبيرة في حساسية البروتينات وطرق transcriptomics في 5-10 سنوات الماضية بيانات قيمة عن الآلاف من الجينات ومنتجاتها. ومع ذلك، فإن أدوات للتصدي لها وظيفة هذه البروتينات لا تواكب. وضع علامات على بروتين يسهل العديد من التجارب لتحديد وظيفتها. على سبيل المثال، وهو بروتين يمكن أن تنصهر لبروتين فلوري في مجموعة متنوعة من الألوان المختلفة لتسهيل توطين وشارك في توطين الدراسات. الكلمات وضعت لالمجهر الإلكتروني، مثل APEX2 أو miniSOG 11،12، تسمح توطين التركيبية للبروتين الكلمات الدلالية. الكلمات الدلالية لالكيمياء الحيوية، مثل علامة TAP، وProtC-TEV-ProtA (PTP) علامة 7،13 تسمح تنقية المجمعات المرتبطة البروتين لتحديد الشركاء ملزمة أو في فحوصات البيوكيميائية في المختبر. الخطوات المحددة التي تعتبر بالغة الأهمية لنجاح protocرأ هي: إدماج DMSO في مزيج PCR ماستر 1، تجميد PCR ميكس ماجستير 1 قبل إضافة ميكس ماستر 2، واستخدام البلمرة التجاري في ميكس ماجستير 2 وتعديل المخزن المؤقت cytomix Electroporation لل. في تجربتنا، فمن الضروري استخدام ضعف عدد الخلايا للC تعداء محطة العلامات بالنسبة للN تعداء محطة العلامات من أجل تحقيق نسبة مماثلة من الآبار إيجابية. لذلك، يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات كما هو موضح. ومن المرجح فقط أن تكون ناجحة عندما transfecting والحشرات procyclic شكل المثقية هذه التقنية. أشكال مجرى الدم لديهم أقل كفاءة ترنسفكأيشن 14، وعلاوة على ذلك فهي عرضة للوفاة خلال اختيار نظرا لسمية التي تعتمد على كثافة أن لا علاقة للدواء انتقائية. وبالتالي، يمثل بروتوكول لدينا السابق أفضل التقنيات الحالية لوضع علامات على شكل المثقبيات مجرى الدم 9. ومن المرجح أيضا أن العابرةوكفاءة الخمج (العدوى) تختلف يعتمد على عزل المثقية محددة. وكان محسن هذا البروتوكول باستخدام 927 SMOX أشكال procyclic - سلالات أخرى قد تتطلب التحسين إضافية. التدابير التي قد تزيد من احتمال النجاح وتشمل: زيادة كمية PCR amplicon، وزيادة عدد الخلايا المدرجة في ترنسفكأيشن. ونحن نقدم وسيلة حيث مئات من البروتينات يمكن الموسومة بشكل متواز. وهذا سيسهل دراسات واسعة النطاق على توطين والتفاعل، واستكمال قواعد البيانات الكبيرة القائمة وتوفير معلومات لا تقدر بثمن للمجتمع. هي قوالب التمهيدي متوفرة عند الطلب وقائمة قوالب البلازميدات هو متاح من: http://www.sdeanresearch.com/

المثقبية البروسية هو طفيلي المسبب trypanosomasis افريقيا البشرية وناغانا في الماشية. ت. البروسية هو كائن حي مثالية لتحليل وظيفة البروتين بسبب مزيج من العوامل الوراثية ذات جودة عالية، والعديد من البروتينات ومجموعات البيانات transcriptomics والأدوات الجزيئية متطورة 1-3. وقد أدى التقدم في البروتينات والتسلسل في مجموعات كبيرة من البيانات التي تبرز يحتمل أن تكون جينات مثيرة للاهتمام 4-6. ومع ذلك، فإن العديد من الجينات لديهم الحد الأدنى من المعلومات المرتبطة بها في قواعد البيانات الموجودة. ولذلك هناك حاجة إلى طريقة الإنتاجية العالية للمساعدة توصيف وظيفي البروتين. التعبير عن بروتين الموسومة يمكن أن تعطي تعدد الرؤى إلى وظيفة البروتين و. على سبيل المثال، وهو بروتين الموسومة ب بروتين فلوري أو حاتمة يمكن أن تكون مترجمة بواسطة المجهر مضان، الذي يعطي معلومات عن مكان وجود بروتعين يمكن ممارسة التأثير البيولوجي. بدلا من ذلك، وهو بروتين ذات الكلمات الدلالية مع TAP 7، 8 HaloTag أو علامة يمكن ان يكون له تنقيته لفحوصات الكيمياء الحيوية وتحديد الشركاء تفاعلها. وضعنا مؤخرا منهجية وضع علامات قوية لT. البروسية 9. تستخدم هذه التمهيدي طويلة PCR لتوليد الحمض النووي لترنسفكأيشن ويسمح وضع علامات على العشرات من البروتينات في موازاة - تحسنا كبيرا على البروتوكولات الحالية. ونحن قد تحسنت الآن قابلية هذا البروتوكول في أشكال procyclic بأمر من حجمها. هنا، نقدم طريقة لدينا حيث أننا أداء PCR وترنسفكأيشن في لوحات 96-جيدا، مع انتعاش واختيار تحدث في 24 لوحات جيدا. كما يمكن الآن الموسومة مئات من البروتينات بشكل متواز وهذه الطريقة توفر وسيلة فعالة من حيث التكلفة وقابلا للعلامات الجينوم المثقية بأكمله.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="617">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Oligonucleotide</td>
			<td style="width:115px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">na</td>
			<td style="width:167px;">desalt only (do not use additional purification)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DMSO</td>
			<td style="width:115px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">Included with the Expand HiFi pack</td>
			<td>Must be PCR grade</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">dNTP</td>
			<td style="width:115px;">any reputable</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Expand HiFi polymerase</td>
			<td style="width:115px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">11759078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">BTX ECM830</td>
			<td style="width:115px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Electroporator</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HT-200 plate handler</td>
			<td style="width:115px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">HT-200</td>
			<td>Handles the 96-well eletroplates</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MOS 96 ELECTROPLATE 4mm</td>
			<td style="width:115px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:119px;">45-0452</td>
			<td>Electroplate for the 96-well electroporation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blasticidin S Hydrochloride</td>
			<td>Melford</td>
			<td style="width:119px;">3513-03-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hygromycin b Gold</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td style="width:119px;">ant-hg-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Phleomycin</td>
			<td style="width:115px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">P0187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">225cm TC Flask, canted neck, phenolic cap</td>
			<td style="width:115px;">Appletonwoods</td>
			<td style="width:119px;">BC006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">24 well culture plates</td>
			<td style="width:115px;">Appletonwoods</td>
			<td style="width:119px;">BC017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Eppendorf&#174; PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes</td>
			<td style="width:115px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z606634-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">96-well Multiply&#174; PCR plate with lateral skirt</td>
			<td style="width:115px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:119px;">72.1979.203</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput gene tagging in trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

في هذا ترنسفكأيشن التمثيلي، وقد صممت الاشعال باستخدام البرنامج النصي TagIt بيرل 9 و تصنيعه تجاريا. تم إجراء 96-جيدا PCR والتحقق من صحتها كما هو موضح (الشكل 1A)؛ في هذا المثال، كانت 95/96 تقارير إنجاز المشروعات الناجحة (الشكل 1B). في تجربتنا، وتكرار ردود الفعل فشلت إما مع الاشعال الأصلية أو توليفها إعادة الاشعال لا يؤدي إلى PCR ناجحة. تم نقل amplicons في لوحات Electroporation لل96-جيدا ل electroporation (الشكل 2A)، ثم نقل إلى لوحات ثقافة 24-جيدا للانتعاش والاختيار. بعد ما يكفي من الوقت للسماح التحديد إلى أن يحدث، وسجل الآبار من أجل البقاء قبل إجراء مزيد من التحليل. في هذا المثال، كانت 88/96 بئرا (92٪) إيجابية بعد اختيار 15 يوما. <iبديل ملغ = &quot;الشكل 1&quot; SRC = &quot;/ ملفات / ftp_upload / 54342 / 54342fig1.jpg&quot; /&gt; الشكل 1: التحقق من التمهيدي طويلة PCR (A) نمط لنقل المنتجات PCR من 96-جيدا لوحة PCR على هلام الاغاروز للتأكد من صحة PCR. (ب) 96-PCR جيدا هلام التحقق من صحة التمثيل لوضع علامات على 95 الجينات على محطة N، و 1 amplicon التي لا تحتوي على 5 &quot;التي تستهدف تناظر ليكون بمثابة سيطرة سلبية في ترنسفكأيشن. يتم تحميل العينات على 1٪ (ث / ت) هلام الاغاروز وحلها في 100 فولت لمدة 30 دقيقة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/54342/54342fig2.jpg" /> الشكل 2: 96-جيدا Electroporation للواختيار (A) نمط لنقل خلايا electroporated من 96 جيدا بلات Electroporation لل.ه لوحات زراعة الأنسجة 24-جيدا. (ب) رسم تخطيطي يظهر الحي / الميت التهديف نموذجي بعد 15 يوما من التحديد في 24 لوحات جيدا. يمثل اللون الأخضر على ترنسفكأيشن ناجحة، يمثل الرمادي جيدا مع الخلايا الميتة فقط. في هذا المثال، 88/96 (92٪) من الآبار الواردة الطفيليات transfected بنجاح. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54342/54342fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei at JoVE.com

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

الإنتاجية العالية جين توصيف في<em&gt; المثقبية البروسية</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

high-throughput-gene-tagging-in-trypanosoma-brucei

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

7.9K Views.  University of Oxford. Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Video: High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate for telomerase for de novo telomere DNA synthesis and is therefore important for telomere maintenance. T. brucei is a protozoan parasite that causes sleeping sickness in humans and nagana in cattle. Once infected mammalian host, T. brucei cell regularly switches its surface antigen to evade the host's immune attack. We have recently demonstrated that the T. brucei telomere structure plays an essential role in regulation of surface antigen gene expression, which is critical for T. brucei pathogenesis. However, T. brucei telomere structure has not been extensively studied due to the limitation of methods for analysis of this specialized structure. We have now successfully adopted the native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension methods for examination of the telomere G-overhang structure and an adaptor ligation method for determination of the telomere terminal nucleotide in T. brucei cells. Here, we will describe the protocols in detail and compare their different advantages and limitations.

Examination of the Telomere G-overhang Structure in Trypanosoma brucei

Telomeres are essential for chromosome stability and the telomere G-overhang structure is essential for telomerase-mediated telomere maintenance. We have recently adopted two methods for detecting the telomere G-overhang structure in Trypanosoma brucei, which are native in-gel hybridization and ligation-mediated primer extension, which will be described.

النظر في هيكل G - المتراكمة في التيلومير المثقبية البروسية</em

The telomere G-overhang structure has been identified in many eukaryotes including yeast, vertebrates, and Trypanosoma brucei. It serves as the substrate ...

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

الإنتاجية العالية لطريقة الكشف عن فيروس الإنفلونزا

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. However, it is apparent that traditional monoclonal technologies are not alone up to this task. This has led to the development of alternate methods to satisfy the demand for high quality and renewable affinity reagents to all accessible elements of the proteome. Toward this end, high throughput methods for conducting selections from phage-displayed synthetic antibody libraries have been devised for applications involving diverse antigens and optimized for rapid throughput and success. Herein, a protocol is described in detail that illustrates with video demonstration the parallel selection of Fab-phage clones from high diversity libraries against hundreds of targets using either a manual 96 channel liquid handler or automated robotics system. Using this protocol, a single user can generate hundreds of antigens, select antibodies to them in parallel and validate antibody binding within 6-8 weeks. Highlighted are: i) a viable antigen format, ii) pre-selection antigen characterization, iii) critical steps that influence the selection of specific and high affinity clones, and iv) ways of monitoring selection effectiveness and early stage antibody clone characterization. With this approach, we have obtained synthetic antibody fragments (Fabs) to many target classes including single-pass membrane receptors, secreted protein hormones, and multi-domain intracellular proteins. These fragments are readily converted to full-length antibodies and have been validated to exhibit high affinity and specificity. Further, they have been demonstrated to be functional in a variety of standard immunoassays including Western blotting, ELISA, cellular immunofluorescence, immunoprecipitation and related assays. This methodology will accelerate antibody discovery and ultimately bring us closer to realizing the goal of generating renewable, high quality antibodies to the proteome.

A method is described with visual accompaniment for conducting scalable, high throughput selections from phage-displayed combinatorial synthetic antibody libraries against hundreds of antigens simultaneously. Using this parallel approach, we have isolated antibody fragments that exhibit high affinity and specificity for diverse antigens that are functional in standard immunoassays.

تحجيم إنتاجية عالية التحديد من المكتبات الأجسام المضادة الاصطناعية-عرض فاجي

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) cycles between a tsetse vector and a mammalian host. It evades the mammalian host immune system by periodically switching the dense, variant surface glycoprotein (VSG) that covers its surface. The detection of antigenic variation in Trypanosoma brucei can be both cumbersome and labor intensive. Here, we present a method for quantifying the number of parasites that have 'switched' to express a new VSG in a given population. The parasites are first stained with an antibody against the starting VSG, and then stained with a secondary antibody attached to a magnetic bead. Parasites expressing the starting VSG are then separated from the rest of the population by running the parasites over a column attached to a magnet. Parasites expressing the dominant, starting VSG are retained on the column, while the flow-through contains parasites that express a new VSG as well as some contaminants expressing the starting VSG. This flow-through population is stained again with a fluorescently labeled antibody against the starting VSG to label contaminants, and propidium iodide (PI), which labels dead cells. A known number of absolute counting beads that are visible by flow cytometry are added to the flow-through population. The ratio of beads to number of cells collected can then be used to extrapolate the number of cells in the entire sample. Flow cytometry is used to quantify the population of switchers by counting the number of PI negative cells that do not stain positively for the starting, dominant VSG. The proportion of switchers in the population can then be calculated using the flow cytometry data.

Detection of Trypanosoma brucei Variant Surface Glycoprotein Switching by Magnetic Activated Cell Sorting and Flow Cytometry

African trypanosomes grown in vitro undergo antigenic variation at a low rate, such that populations are made up of parasites expressing a dominant variant surface glycoprotein (VSG) type and a small population of "switched" variants. This protocol describes a fast method for detecting and quantifying these populations.

الكشف عن<em&gt; المثقبية البروسية</em&gt; التبديل البديل البروتين السكري السطح بواسطة المغناطيسي خلية المنشط فرز والتدفق الخلوي

Trypanosoma brucei, a protozoan parasite that causes both Human and Animal African Trypanosomiasis (known as sleeping sickness and nagana, respectively) ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of combining reactions together. We designed and evaluated a panel based on this principle to rapidly identify the presence of common disease agents in dogs and horses with acute respiratory illness. This manuscript describes a nanoscale diagnostic PCR workflow for sample preparation, amplification, and analysis of target pathogen sequences, focusing on procedures that are different from microliter scale reactions. In the respiratory panel presented, 18 assays were each set up in triplicate, accommodating up to 48 samples per plate. A universal extraction and pre-amplification workflow was optimized for high-throughput sample preparation to accommodate multiple matrices and DNA and RNA based pathogens. Representative data are presented for one RNA target (influenza A matrix) and one DNA target (equine herpesvirus 1). The ability to quickly and accurately test for a comprehensive, syndrome-based group of pathogens is a valuable tool for improving efficiency and ergonomics of diagnostic testing and for acute respiratory disease diagnosis and management.

High-throughput testing of DNA and RNA based pathogens by nanoscale PCR is described using a syndromic canine and equine respiratory PCR panel.

كشف الإنتاجية العالية للجهاز التنفسي مسببات الأمراض في العينات الحيوانية التي كتبها النانو PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast cancers. However, a minority of cases displays a heterogeneous distribution of HER2-positive cells, which generates major clinical challenges. To date, no reliable and standardized protocols for the characterization and quantification of HER2 heterogeneous gene amplification in large cohorts have been proposed. Here, we present a high-throughput methodology to simultaneously assess the HER2 status across different topographic areas of multiple breast cancers. In particular, we illustrate the laboratory procedure to construct enhanced tissue microarrays (TMAs) incorporating a targeted mapping of the tumors. All TMA parameters have been specifically optimized for the silver in situ hybridization (SISH) of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) breast tissues. Immunohistochemical analysis of the prognostic and predictive biomarkers (i.e., ER, PR, Ki67, and HER2) should be performed using automated procedures. A customized SISH protocol has been implemented to allow a high-quality molecular analysis across multiple tissues that underwent different fixation, processing, and storage procedures. In this study, we provide a proof-of-principle that specific DNA sequences could be localized simultaneously in distinct topographic areas of multiple and heterogeneously processed breast cancers using an efficient and cost-effective method.

Heterogeneous distribution of HER2-positive cells can be observed in a subset of breast cancers and generates clinical dilemmas. Here, we introduce a reliable and cost-effective protocol to define, quantify, and compare HER2 intra-tumor genetic heterogeneity in a large series of heterogeneously processed breast cancers.

بناء منصة فرز الفائق لتقييم عدم تجانس التضخيم الجين HER2 في سرطان الثدي

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to combat multiple drug resistance. This has led to the conclusion that researchers do not only need to find new drugs, but also need to develop new ways of finding them. Amongst the most promising candidate methods are whole-organism, in vivo assays that use high-throughput, phenotypic readouts and hosts that range from Caenorhabditis elegans to Danio rerio. These hosts have several powerful advantages, including dramatic reductions in false positive hits, as compounds that are toxic to the host and/or biounavailable are typically dropped in the initial screen, prior to costly follow up.
Here we show how our assay has been used to interrogate host variation in the well-documented C. elegans&#8212;Pseudomonas aeruginosa liquid killing pathosystem. We also demonstrate several extensions of this well-worked out technique. For example, we are able to carry out high-throughput genetic screens using RNAi in 24- or 96-well plate formats to query host factors in this host-pathogen interaction. Using this assay, whole genome screens can be completed in only a few months, which can dramatically simplify the task of identifying drug targets, potentially without the need for laborious biochemical purification approaches.
We also report here a variation of our method that substitutes the gram-positive bacterium Enterococcus faecalis for the gram-negative pathogen P. aeruginosa. Much as is the case for P. aeruginosa, killing by E. faecalis is time-dependent. Unlike previous C. elegans&#8212;E. faecalis assays, our assay for E. faecalis does not require preinfection, improving its safety profile and reducing the chances of contaminating liquid-handling equipment. The assay is highly robust, showing ~95% death rates 96 h post infection.

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

Here we describe a protocol that is an adaptable, whole host, high-content screening tool that can be utilized to study host-pathogen interactions and be used for drug discovery.

الفائق، والمحتوى السامي، المستندة إلى سائل C. ايليجانس باثوسيستيم

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...

High-throughput Measurement of Plasma Membrane Resealing Efficiency in Mammalian Cells

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In response to these damages, complex molecular machineries rapidly reseal the plasma membrane to restore its barrier function and maintain cell survival. Despite 60 years of research in this field, we still lack a thorough understanding of the cell resealing machinery. With the goal of identifying cellular components that control plasma membrane resealing or drugs that can improve resealing, we have developed a fluorescence-based high-throughput assay that measures the plasma membrane resealing efficiency in mammalian cells cultured in microplates. As a model system for plasma membrane damage, cells are exposed to the bacterial pore-forming toxin listeriolysin O (LLO), which forms large 30-50 nm diameter proteinaceous pores in cholesterol-containing membranes. The use of a temperature-controlled multi-mode microplate reader allows for rapid and sensitive spectrofluorometric measurements in combination with brightfield and fluorescence microscopy imaging of living cells. Kinetic analysis of the fluorescence intensity emitted by a membrane impermeant nucleic acid-binding fluorochrome reflects the extent of membrane wounding and resealing at the cell population level, allowing for the calculation of the cell resealing efficiency. Fluorescence microscopy imaging allows for the enumeration of cells, which constitutively express a fluorescent chimera of the nuclear protein histone 2B, in each well of the microplate to account for potential variations in their number and allows for eventual identification of distinct cell populations. This high-throughput assay is a powerful tool expected to expand our understanding of membrane repair mechanisms via screening for host genes or exogenously added compounds that control plasma membrane resealing.

Here we describe a high-throughput fluorescence-based assay that measures the plasma membrane resealing efficiency through fluorometric and imaging analyses in living cells. This assay can be used for screening drugs or target genes that regulate plasma membrane resealing in mammalian cells.

قياس الإنتاجية العالية من غشاء البلازما إعادة ختم الكفاءة في خلايا الثدييات

In their physiological environment, mammalian cells are often subjected to mechanical and biochemical stresses that result in plasma membrane damage. In ...

High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune system and is not targeted by the current antiretroviral therapy (cART). Transcription and splicing have been shown to reinforce HIV-1 latency in resting CD4+ T cells. Reversal of latency by the use of latency reversal agents (LRAs) in the &#34;shock and kill&#34; approach has been studied extensively in an attempt to purge this reservoir but has thus far not shown any success in clinical trials due to the lack of development of adequate small molecules that can efficiently perturb this reservoir. The protocol presented here provides a method for reliably and efficiently assessing latency reversal agents (LRAs) on HIV transcription and splicing. This approach is based on the use of an LTR-driven dual color reporter that can simultaneously measure the effect of an LRA on transcription and splicing by flow cytometry. The protocol described here is adequate for adherent cells as well as the cells in suspension. It is useful for testing a large number of drugs in a high throughput system. The method is technically simple to implement and cost-effective. In addition, the use of flow cytometry allows the assessment of cell viability and thus drug toxicity at the same time.

A high throughput protocol for functional assessment of HIV efficient reactivation and clearance of latent proviruses is described and applied by testing the impact of interventions on HIV transcription and splicing. Representative results of the effect of latency reversing agents on LTR-driven transcription and splicing are provided.

إنتاجية عالية في تقييم المختبر من الكمون عكس الوكلاء عن فيروس نقص المناعة البشرية النسخ والربط

HIV remains incurable due to the existence of a reservoir of cells that harbors stable and latent form of the virus, which stays invisible to the immune ...

الإنتاجية العالية جين توصيف في

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

النظر في هيكل G - المتراكمة في التيلومير المثقبية البروسية