I thank Dr. Maureen Barr, under whose supervision the dauer IL2 remodeling phenotype was initially characterized. Thanks to Dr. C. Britt Carlson for critical reading of the manuscript. Funding in the Barr lab was from the NIH (5R01DK59418) and postdoctoral fellowships from the USDA (2010-65106-20587) and the New Jersey Commission on Spinal Cord Research (CSCR12FEL004). Current funding for this work is from a University of Illinois Urbana-Champaign College of ACES FIRE grant.

1. الخام داور إنتاج فرمون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو OP50 E. القولونية من مستعمرة يا واحد / N عند 37 درجة مئوية في حين تهتز في 100 مل من مرق LB عند 200 دورة في الدقيقة. ملاحظة: يمكن إجراء هذا O / N ثقافة مسبقا وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو N2 C. ايليجانس في يونيو 15-20 سم أطباق بتري مع NGM أجار (انظر الوصفة في الجدول 1) المصنف مع 50 ميكرولتر من OP50 E. حتى البكتيريا القولونية يتم استنفاد ما يقرب من 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 5X 250 مل من وسائل الإعلام S (انظر الوصفة في الجدول 1) في 1 L قوارير مخروطي 19. ملاحظة: يمكن إجراء هذا الحل مقدما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو ثقافة OP50 E. القولونية في 4 لتر ​​من مرق LB O / N، فحقن مع 1 مل من OP50 في E. القولونية وتهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الديدان الخيطية من لوحات (الخطوة 1.2) مع 1 مل من محلول S القاعدية (انظر الوصفة في الجدول 1) والديدان الخيطية نقل 4-5 لوحات في كل من 4 1 L قوارير مخروطي مع وسائل الإعلام S أعدت في الخطوة 1.3 (4- 5 لوحاتلكل قارورة) 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي OP50 من الخطوة 1.4 في 650 x ج لمدة 10 دقيقة وإزالة طاف. و resuspend كل بيليه الجرثومي في 10 مل من محلول S القاعدية. نقل كميات متساوية من البكتيريا معلق على كل قارورة من الديدان الخيطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قوارير على شاكر المداري في درجة حرارة الغرفة (20 - 25 ° C) و100-150 دورة في الدقيقة لمدة 4 - 5 ايام حتى يبدأ الحل لمسح، مما يشير إلى استنزاف المواد الغذائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم استنفاد المواد الغذائية، وتنمو ثقافة O / N آخر من OP50 E. القولونية في 4X 1 لتر من مرق LB. أجهزة الطرد المركزي البكتيريا في 650 x ج لمدة 10 دقيقة وإضافة بيليه من قارورة واحدة إلى كل من قوارير S سائل الاعلام مع الديدان الخيطية. العودة القوارير S سائل الإعلام إلى شاكر المداري، كما في الخطوة 1.7، ل3-4 أيام إضافية حتى يتم استنفاد الطعام مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نلقي ~ 1 مل قسامة من حل من كل قارورة وتقدير تركيز النيماتودا التي كتبها الفرعية أخذ العينات 1 ميكرولتر من كل 1 مل قسامة وتعول عدد من الديدان الخيطية. ملاحظة:يجب أن يكون السكان الخيطية 50،000 - 75،000 الديدان الخيطية / مل. في هذه تركيز غالبية الديدان الخيطية هي dauers. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل أي قوارير الملوثة. ملاحظة: يظهر التلوث في كثير من الأحيان كما خيوط فطرية ينظر خلال خطوة 1.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الديدان الخيطية الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل بيليه الخيطية والاحتفاظ طاف. بدلا من ذلك، انظر مناقشة لاستخدام هذه الحيوانات لجعل فرمون منخفضة رجولية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية طاف من خلال رقم 1 هتما التصفية. ملاحظة: سوف قارورة فراغ تعجيل هذه العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعلاوة على ذلك تصفية طاف من خلال 0.45 ميكرون وحدات الترشيح الفراغ العقيم. ملاحظة: رشح يمكن أن تظل O / N عند 4 درجات مئوية أو المضي إلى 1.14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الراشح إلى دورق 2 لتر مع بقضيب. وضع في غطاء الدخان على لوحة التدفئة ضجة. تقديمهم ليغلي مع التحريك وتتبخر إلى حوالي 200 مل. نقل الحل إلى كوب 500 مل. تواصل المغلي حتى ما يقرب من 50 مل هي جنيهقدم ملاحظة: يجب توخي الحذر خلال هذه الخطوة لأنه من الممكن حل الغليان. لون النهائية 50 مل هو البني الداكن. في أي وقت أثناء عملية الطبخ، ويمكن أن تحول الحرارة قبالة والراشح تخزين O / N في RT أو 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لتبرد وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1،000 ز س. صب طاف في 100 مل كوب وتجاهل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغلي طاف وصولا الى القشرة البني. إزالة من الحرارة وتفريق القشرة مع ملعقة. إضافة الإيثانول 200 دليلا كافيا لتغطية القشرة. تغطية الكأس مع parafilm والسماح لها الجلوس O / N في RT. تخلصي من الايثانول في كوب نظيف ووضع إلى الجانب. إضافة الإيثانول النقي لتغطية القشرة. تكرار الاستخراج O / N 3 مرات. تجميع مقتطفات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مضخة فراغ لتجفيف مستخلصات الايثانول. إذا مضخة فراغ غير متوفرة، إضافة إلى استخراج الإيثانول دورق نظيفة ودافئة إلى 50 درجة مئوية مع التحريك في غطاء الدخان. ملاحظة: عندما تبخرت الايثانول بقايا لزجة من لترينبغي أن تظل آيت اللون البني. إذا تم استخدام التدفئة، وينبغي الحرص على عدم حرق حل عن طريق التسخين لفترة طويلة جدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل بقايا في 10 مل من الماء المعقم المقطر. فلتر تعقيم هذا الحل مع فلتر حقنة 0.22 ميكرون وتخزينها في -20 درجة مئوية في 1 مل مأخوذة. ملاحظة: 1 مل من الماء يستخدم لإذابة بقايا لكل 100 مل من ثقافة الخيطية السائلة الأصلية. على سبيل المثال، إذا تم تجاهل واحد من قوارير ثقافة السائلة بسبب التلوث، ثم ضبط كمية المياه المستخدمة لإذابة بقايا. </li></ol> 2. تحديد الجرعة فرمون الاستجابة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد داور فرمون بجعل 6X 5 مل من NGM مع وسائل الإعلام نوبل أجار، دون ببتون، وتستكمل مع 50 ميكروغرام / مل كبريتات الستربتومايسين ومجموعة من داور فرمون (انظر الوصفة في الجدول رقم 1) 4، 19. اخلطي المكونات في 13x100 ملم الزجاج أنبوب الثقافة، وتغلي على موقد بنسن، ثم تصب في أطباق بتري 3 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن صباحاأنبوب icrocentrifuge. إضافة 1 مل من O / N ثقافة E. القولونية OP50 إلى أنبوب وأجهزة الطرد المركزي في ~ 17،000 x ج في أنبوب microcentrifuge. إزالة كافة طاف. وزن الأنبوب مرة أخرى وتحديد وزن بيليه البكتيرية. resuspend الكرية مع M9 عازلة (انظر الوصفة في الجدول 1) لتركيز النهائي من 4٪ (ث / ت). قسامة 10 ميكرولتر من تعليق البكتيرية على مركز كل لوحة فرمون 4. مخزن لوحات O / N في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار 10-15 حبلي N2 من النوع البري المنحرفين بعد يوم واحد تساقط في مرحلة البلوغ على لوحات فرمون 4. تخزين لوحات عند 25 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سلخ كل من المنحرفين الكبار. تسجيل عدد البيض الذي تضعه على كل لوحة. ختم لوحات مع parafilm والعودة إلى 25 درجة مئوية لمدة 3 أيام 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد نسبة dauers (الشكل 2). ملاحظة: بالنسبة لكلتا الطريقتين من المهم أن نلاحظ أن dauers (وإلى أقل السابقوخيمة غير dauers) يتسلق الجدران وعلى غطاء من أطباق بتري. ولذلك فمن المهم أن تدرس جميع الأسطح الطبق لالديدان الخيطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب البيانات إلى منحنى الاستجابة للجرعة وتقدير تركيز EC 90 من فرمون (فرمون كافية لإحداث 90٪ من الحيوانات لتشكيل dauers) كما هو مبين في الشكل (3) ملاحظة: نحن عادة استخدام نموذج الانحدار اللوجستي لتقدير EC 90 ، ولكن حزم البرامج الإحصائية المختلفة قد يكون لها طرق البديلة التي تنتج تقديرات مماثلة. </li></ol> 3. تصوير لايف من داور IL2 الخلايا العصبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحات داور فرمون كما في بروتوكول 2 باستخدام القيمة EC 90 تحديدها في الخطوة 2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمل dauers باستخدام الأساليب في بروتوكول 2 مع سلالة تحمل متكامل IL2 مراسل التحوير (myIs13 [P-6 ​​KLP :: GFP]، myIs14 [P-6 ​​KLP :: GFP]، myIs16 [P <eم&gt; KLP-6 :: tdTomato] أو qIs56 [P-2 :: تأخر GFP]) 12، 20، 21 ملاحظة: إذا تم استخدام ف Is56، والتعبير عن GFP لا تكون مرئية في IL2Qs حتى عدة ساعات في تساقط داور وبعض الأحداث إعادة الأولية لا تكون مرئية. بالإضافة إلى ذلك، في حين أن إشارة الفلورسنت من تأخر P-2 :: GFP التحوير هي أكثر إشراقا في نهاية المطاف في IL2s خلال داور من KLP P-6 صحفيين الفلورسنت، وP :: يعبر عن التأخر-2 التحوير GFP أيضا ضعيفة في عضلات الرأس التي يمكن أن تحجب فروع IL2 غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد وضع البيض، وإزالة المنحرفين الكبار، وختم لوحات مع parafilm واحتضان لمدة 34 ساعة عند 25 ° C 17. ملاحظة: طول الوقت لتساقط داور يختلف قليلا بين الأفراد. في معظم فترة سريعة من التغصنات تشجر تبدأ 4-5 ساعة بعد بداية تساقط داور (39-44آخر ساعة عند 25 درجة مئوية) 12 وضع البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم من التصوير، وتشكل حلا من 10٪ (ث / ت) الاغاروز في المخزن M9 مع داور فرمون في تركيز EC 90. قسامة حوالي 100 ميكرولتر من الاغاروز على شريحة المجهر وبسرعة، ولكن بلطف، ووضع شريحة أخرى على رأس لخلق سطح مسطح الاغاروز. بعد أن عززت agarose، والتفاف الشرائح في التفاف ساران وتخزينها في غرفة الرطوبة (ماصة مربع تلميح مع مناشف ورقية مبللة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة الحضانة 34 ساعة، وفحص لوحات فرمون عن الديدان الخيطية التي توقفت عن ضخ البلعوم. شرائح منفصلة بحيث سطح واحد فقط من شريحة واحدة لديه الاغاروز على ذلك. اختيار واحد أو أكثر من الديدان الخيطية على لوحة agarose 10٪ و 1 μ لتر من 0.1 ميكرون الخرز البوليسترين 22. ملاحظة: ويبلغ عدد سكانها متزامنة جيدا، وغالبية الديدان الخيطية على لوحة سوف تدخل في تساقط من L2d إلى داور. ومع ذلك، قد يكون هناك تباين بين طndividuals. ولذا فمن المهم أن نلاحظ الميزات الإضافية (انسداد أسنان، البلعوم إعادة عرض) لتقدير مقدار الوقت كانت الحيوانات داخل تساقط داور (انظر نتائج ممثلة على سبيل المثال). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد اتجاه (يسار / يمين، الظهرية / بطني) من الديدان الخيطية. التقاط الصور Z-كومة من التغصنات IL2Q في التكبير 100X بأقل كثافة مضان ممكن كل 15 دقيقة أو حسب الحاجة للتجربة محددة. مواصلة التقاط الصور حتى فصل الخيطية من إهاب L2d والشلل مستحيل أو إذا يتعافى الحيوان من داور (البلعوم يبدأ ضخ). عندما لا التصوير بنشاط، ضع الشريحة في غرفة الرطوبة. ملاحظة: نحن نستخدم مجهر المجهر epifluorescent مع الآلية تدخل مرحلة والتفضيلية النقيض (DIC) البصريات. </li></ol>

<ol>
	<li>West-Eberhard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Developmental Plasticity and Evolution. , (2003).</li><li>Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dauerlarva,+a+post-embryonic+developmental+variant+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 46, 326-342 (1975).</li><li>Riddle, D. L., Albert, P. S., Riddle , D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans II. , 739-768 (1998).</li><li>Golden, J. W., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+dauer+larva:+developmental+effects+of+pheromone,+food,+and+temperature.">The Caenorhabditis elegans dauer larva: developmental effects of pheromone, food, and temperature.</a> Dev. Biol. 102, 368-378 (1984).</li><li>Riddle, D. L., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Nematode C. elegans. , 393-412 (1988).</li><li>Fielenbach, N., Antebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+dauer+formation+and+the+molecular+basis+of+plasticity.">C. elegans dauer formation and the molecular basis of plasticity.</a> Genes Dev. 22, 2149-2165 (2008).</li><li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , 1-19 (2007).</li><li>Golden, J. W., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218, 578-580 (1982).</li><li>Butcher, R. A., Fujita, M., Schroeder, F. C., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+pheromones+that+control+dauer+development+in+Caenorhabditis+elegans.">Small-molecule pheromones that control dauer development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Chemical Biology. 3, 420-422 (2007).</li><li>Jeong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+structure+and+biological+activity+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer-inducing+pheromone.">Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone.</a> Nature. 433, 541-545 (2005).</li><li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans.">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454, 1115-1118 (2008).</li><li>Schroeder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dauer-Specific+dendrite+arborization+in+C.+regulated+by+KPC-1/Furin.">Dauer-Specific dendrite arborization in C. regulated by KPC-1/Furin.</a> Curr. Biol. 16, 1527-1535 (2013).</li><li>Procko, C., Lu, Y., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+delimit+shape+changes+of+sensory+neuron+receptive+endings+in+C.+elegans.">Glia delimit shape changes of sensory neuron receptive endings in C. elegans.</a> Development. 138, 1371-1381 (2011).</li><li>Albert, P. S., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+alterations+in+sensory+neuroanatomy+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer+larva.">Developmental alterations in sensory neuroanatomy of the Caenorhabditis elegans dauer larva.</a> J. Comp. Neurol. 219, 461-481 (1983).</li><li>Vowels, J. J., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+chemosensory+control+of+dauer+formation+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic analysis of chemosensory control of dauer formation in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 130, 105-123 (1992).</li><li>Vowels, J. J., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+chemosensory+defects+in+daf-11+and+daf-21+mutants+of+Caenorhabditis+elegans.">Multiple chemosensory defects in daf-11 and daf-21 mutants of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 138, 303-316 (1994).</li><li>Ailion, M., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dauer+formation+induced+by+high+temperatures+in+Caenorhabditis+elegans.">Dauer formation induced by high temperatures in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 156, 1047-1067 (2000).</li><li>Neal, S. J., Kim, K., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pheromone Signaling. , 273-283 (2013).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Ouellet, J., Li, S., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+is+required+for+both+dauer+maintenance+and+recovery+in+C.+elegans.">Notch signalling is required for both dauer maintenance and recovery in C. elegans.</a> Development. 135, 2583-2592 (2008).</li><li>Blelloch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gon-1+gene+is+required+for+gonadal+morphogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">The gon-1 gene is required for gonadal morphogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 216, 382-393 (1999).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, (2012).</li><li>Nelson, F. K., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+study+of+the+Caenorhabditis+elegans+secretory-excretory+system+using+laser+microsurgery.">Functional study of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system using laser microsurgery.</a> J. Exp. Zool. 231, 45-56 (1984).</li><li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode,+Caenorhabditis+elegans.">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li><li>Singh, R., Sulston, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+moulting+in+Caenorhabditis+elegans.">Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans.</a> Nematologica. 24, 63-71 (1978).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

دراسة المرونة العصبية داور محددة وغيرها من التغيرات المورفولوجية المرتبطة داور يتطلب التحكم وتشكيل موثوق بها من dauers إما عن طريق طفرة جينية (أي داف المسوخ ج) أو عن طريق التعرض البرية من نوع الحيوانات لفرمون. في حين أن استخدام طفرة جينية للحث dauers مريحة، قد ارب...

اللدونة المظهري، بما في ذلك اللدونة التنموية والسلوكية، مهم لعمليات التكيف مع الظروف البيئية المعاكسة وتعتبر قوة دافعة في التطور 1. C. ايليجانس هو كائن نموذج كثيرا ما تستخدم للدراسات في التنمية وبيولوجيا الأعصاب. في ظل ظروف مثالية، C. ايليجانس يتطور من خلال أربع مراحل اليرقات قبل دخول المرحلة الإنجابية الكبار. ومع ذلك، في ظل ظروف انخفاض توافر الغذاء والكثافة السكانية العالية، C. ايليجانس يمكن أن يخضع لعملية التحول التنموي والدخول في معمرة ومقاومة للإجهاد مرحلة داور 2. عرض Dauers العديد من الاختلافات الشكلية والسلوكية من غير dauers، والتي من المرجح توسط هذه المقاومة الإجهاد. كانت العظة البيئية والوراثية التي تنظم مسارات دخول داور وصف على نطاق واسع 3، 4، 5، 6، 7، إلا أن الآليات الجزيئية التي تتحكم في التغيرات المظهرية الفردية التي تحدث دأقل مفهومة جيدا تشكيل داور خلال شهر. دراسة الظواهر داور محددة يتطلب إنتاج الحيوانات داور. ويمكن تحقيق ذلك من خلال ثلاث طرق: 1) اختيار من ثقافة محرومة من C. ايليجانس، 2) استخدام داور تشكيل التأسيسية (داف ج) المسوخ، 3) تحريض تشكيل داور من خلال فرمون تنقيته. أنها بسيطة نسبيا لاختيار dauers من لوحة NGM القياسية مع C. السكان ايليجانس أن استنفد البكتيرية الإمدادات الغذائية لها. في أيدينا، وهي لوحة NGM القياسية المصنفة أصلا مع 50 ميكرولتر من OP50 القولونية، سمح لتنمو لمدة 3 أيام، وبعد ذلك تلقيح مع 3 - 4 المنحرفين الكبار أبقى عند 25 درجة مئوية واستنفاد الإمدادات الغذائية في غضون أسبوع وإنتاج عدة آلاف dauers في غضون 3 أيام إضافية (بالإضافة إلى العديد من تجويع غير dauers). ومع ذلك، وهذه الطريقة غير مرضية لعمليات فحص تحدث أثناء تساقط في دأوير. فإنه من الصعب تحديد أي من عدة آلاف من الحيوانات على لوحة تجويع نموذجية ندخل داور. وعلاوة على ذلك استخدام لوحة تجويع، لا يقدم أي إمكانية للتزامن. استخدام داف ج المسوخ يسمح لمزامنة والجيل موثوق بها من dauers. ومع ذلك، ليس هناك ما يضمن أن سوف معينة داف ج طفرة لا تؤثر الظواهر الأخرى داور الخاصة وحدها أو بالاشتراك مع الطفرات إضافية. وقد ضمنا وجود فرمون داور أول من Cassada وراسل وأظهرت في وقت لاحق من قبل الذهبي وريدل. فرمون داور منذ ذلك الحين اتسمت كيميائيا 2، 8، 9، 10. يتكون فرمون تنقيته من مزيج معقد من ascarosides، التي تنظم في أشكال مختلفة سواء العمليات السلوكية والتنموية 9 و 11. استخدام استخراج فرمون داور الخام يسمح لل الحث موثوق رقابة من dauers متزامنة في الخلفية من النوع البري. </P&gt; الجهاز العصبي والخلايا الدبقية المرتبطة الخضوع لإعادة تشكيل داور خلال 12 و 13 و 14 يرقة. بعض هذه التغيرات لا رجعة فيها، مثل إعادة الخلايا الدبقية خلال داور 13 و 14، ولكن غيرها من الأحداث هي إعادة عرض عكسها على العودة إلى مواتية الظروف البيئية. على سبيل المثال، مجموعة من أربعة الخلايا العصبية IL2Q الخضوع لإعادة الخلايا العصبية السريع وعكسها خلال تشكيل داور بما في ذلك: تشجر تغصناته، والتحول من واحد إلى شجيري الخلايا العصبية محوار multidendritic وإعادة 12. الطرق تسمح هذه الوثيقة لموثوق التصوير في الجسم الحي من التوتر الناجم المرونة العصبية في كائن نموذج. الأساليب المقدمة للإنتاج واختبار داور فرمون الخام موصوفة سابقا وتجميعها من عدة مصادر 4، 8، 15، 16، 17، 18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="873">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:259px;">N2 C. elegans Bristol strain</td>
			<td style="width:152px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PT2660 myIs13[Pklp-6::gfp] III</td>
			<td style="width:152px;">Upon request from Schroeder lab</td>
			<td></td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PT2762 myIs14[Pklp-6::gfp] V</td>
			<td style="width:152px;">Upon request from Schroeder lab</td>
			<td></td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">JK2868 qIs56[Plag-2::gfp] V</td>
			<td style="width:152px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td></td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">OP50 E. coli</td>
			<td style="width:152px;">Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td></td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri dishes</td>
			<td style="width:152px;">Tritech Research</td>
			<td>60 mm T3308, 35 mm T3501</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="132">
			<td height="132" style="height:132px;">NGM agar</td>
			<td style="width:152px;">Various</td>
			<td></td>
			<td style="width:251px;">3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 mL H2O autoclaved cooled to 55&#176;C followed by 1 mL of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 mL of 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 1 mL of 1 M CaCl2, 1 mL of 1 M MgSO4</td>
		</tr>
		<tr height="356">
			<td height="356" style="height:356px;">S Media</td>
			<td style="width:152px;">Various</td>
			<td></td>
			<td style="width:251px;">S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K2HPO4, 1.5 g KH2PO4, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H2O to 250 mL. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 mL of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate, H2O to 100 mL, autoclaved), 2.5 mL of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO4&#160;&#8226;7 H2O, 0.2 g MnCl2&#8226;4 H2O, 0.29 g ZnSO4&#160;&#8226;7 H2O, 0.025 g CuSO4&#160;&#8226;5 H2O, H2O to 1 liter. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 mL of 1 M CaCl2, and 0.75 mL of 1 M MgSO4.</td>
		</tr>
		<tr height="392">
			<td height="392" style="height:392px;width:259px;">Dauer pheromone plates for dose-response assay</td>
			<td style="width:152px;">Various</td>
			<td></td>
			<td style="width:251px;">Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 mL of 0.513 M NaCl and 5 &#181;L of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 mL culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H2O to bring the volume to 4.725 mL.&#160; Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 &#176;C. Add 125 &#181;L 1 M KPO4 buffer (pH 6.0), 50 &#181;l 0.1 M CaCl2, 50 &#181;L 0.1 M MgSO4 and 50 &#181;l of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.&#160; Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microsphere beads 0.1 micron</td>
			<td style="width:152px;">Polysciences Inc.</td>
			<td>00876-15</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="68">
			<td height="68" style="height:68px;">M9 buffer</td>
			<td style="width:152px;">Various</td>
			<td></td>
			<td style="width:251px;">Mix 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 liter. Sterilize by autoclaving</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of dauer-specific neuronal remodeling in c. elegans

آليات السيطرة على الإجهاد الناجم عن المظهرية اللدونة في الحيوانات كثيرا ما تكون معقدة وصعبة للدراسة في الجسم الحي. والمثال الكلاسيكي من التوتر الناجم اللدونة هي المرحلة داور من C. ايليجانس. Dauers هي مرحلة اليرقات التنموية البديلة تشكلت في ظل ظروف تركيزات منخفضة من المواد الغذائية البكتيرية وتركيزات عالية من فرمون داور. عرض Dauers اللدونة التنموية والسلوكية واسعة النطاق. على سبيل المثال، مجموعة من أربعة رباعي الداخلية-شفوي (IL2Q) الخلايا العصبية تخضع لإعادة عكسها واسعة خلال تشكيل داور. الاستفادة من دخول مسارات بيئية تنظيم داور معروفة، وهي طريقة المحددة سابقا لإنتاج النفط الخام داور من فرمون على نطاق واسع الثقافات الخيطية السائلة ويتجلى. مع هذا الأسلوب، وهو تركيز 50،000 - 75،000 الديدان الخيطية / مل من ثقافة السائل كافية لإنتاج قوية للغاية داور الخام فرمون. رجولية فرمون الخام هي DETErmined من قبل الأحيائي الاستجابة للجرعة. وأخيرا، يتم وصف الأساليب المستخدمة لفي الجسم الحي الوقت الفاصل بين التصوير من خلال تشكيل IL2Qs داور.

إنتاج النفط الخام النتائج داور فرمون في السائل الأصفر (الشكل 1) في آن معا الحرارة ومستقرة البارد. يتم تخزين aliquots من فرمون الخام عند -20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى دون أي خسارة واضحة في النشاط. بعد إنتاج فرمون، واحد الأحيائي الاستجابة للجرعة كافية لتقدير تقريبي...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans at JoVE.com

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

في فيفو التصوير من داور محددة العصبية في إعادة عرض C. ايليجانس

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

in-vivo-imaging-of-dauer-specific-neuronal-remodeling-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

11.1K Views.  University of Illinois Urbana-Champaign. Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant ‘dauer’ juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer. 

Video: In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

ترنسفكأيشن من خلايا الشبكية بواسطة الماوس العقدة في الجسم الحي Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

في Axotomy الليزر المجراة في C. ايليجانس

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

الآلي الكمي من الإسفار متشابك في<em&gt; C. ايليجانس</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

تسجيلات الكهربية المزدوجة للSynaptically-استجابات Astroglial والخلايا العصبية في الحصين شرائح الحاد

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

سريع الصغرى، الرحلان الشاردي من الغلوتامات وGABA: أداة مفيدة لبحث تكامل متشابك

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and medical applications. Strengths of fluorescence include its sensitivity, specificity, and compatibility with live imaging. Unfortunately, conventional forms of fluorescence microscopy suffer from one major weakness, diffraction-limited resolution in the imaging plane, which hampers studies of structures with dimensions smaller than ~250 nm. Recently, this limitation has been overcome with the introduction of super-resolution fluorescence microscopy techniques, such as photoactivated localization microscopy (PALM). Unlike its conventional counterparts, PALM can produce images with a lateral resolution of tens of nanometers. It is thus now possible to use fluorescence, with its myriad strengths, to elucidate a spectrum of previously inaccessible attributes of cellular structure and organization.
Unfortunately, PALM is not trivial to implement, and successful strategies often must be tailored to the type of system under study. In this article, we show how to implement single-color PALM studies of vesicular structures in fixed, cultured neurons. PALM is ideally suited to the study of vesicles, which have dimensions that typically range from ~50-250 nm. Key steps in our approach include labeling neurons with photoconvertible (green to red) chimeras of vesicle cargo, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a high-resolution PALM image. We also demonstrate the efficacy of our approach by presenting exceptionally well-resolved images of dense-core vesicles (DCVs) in cultured hippocampal neurons, which refute the hypothesis that extrasynaptic trafficking of DCVs is mediated largely by DCV clusters.

We describe how to implement photoactivated localization microscopy (PALM)-based studies of vesicles in fixed, cultured neurons. Key components of our protocol include labeling vesicles with photoconvertible chimeras, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a super-resolution image.

فائقة الدقة التصوير من الخلايا العصبية الحويصلات كثيفة الأساسية

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Utilizing Combined Methodologies to Define the Role of Plasma Membrane Delivery During Axon Branching and Neuronal Morphogenesis

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

الاستفادة المشتركة منهجيات لتحديد دور البلازما غشاء تسليم خلال أكسون التشعب والعصبية التشكل

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular ...

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its completely mapped nervous system and transparent anatomy, presents an ideal model for understanding real-time neural dynamics using calcium indicators. In combination with microfluidic technologies and experimental designs, calcium-imaging studies using these indicators are performed in both free-moving and trapped animals. However, most previous studies utilizing trapping devices, such as the olfactory chip described in Chronis et al., have devices designed for use in the more common hermaphrodite, as the less common male is both morphologically and structurally dissimilar. An adapted olfactory chip was designed and fabricated for increased efficiency in male neuronal imaging with using young adult animals. A turn was incorporated into the worm loading port to rotate the animals and to allow for the separation of the individual neurons within a bilateral pair in 2D imaging. Worms are exposed to a controlled flow of odorant within the microfluidic device, as described in previous hermaphrodite studies. Calcium transients are then analyzed using the open-source software ImageJ. The procedure described herein should allow for an increased amount of male-based C. elegans calcium imaging studies, deepening our understanding of the mechanisms of sex-specific neuronal signaling.

Using an Adapted Microfluidic Olfactory Chip for the Imaging of Neuronal Activity in Response to Pheromones in Male C. Elegans Head Neurons

The use of an adapted &#34;olfactory chip&#34; for the efficient calcium imaging of C. elegans males is described here. Studies of male exposure to glycerol and a pheromone are also shown.

استخدام رقاقة حاسة الشم تكييف موائع جزيئية لتصوير نشاط الخلايا العصبية في الرد على الفيرومونات في الذكور ايليجانس جيم رئيس الخلايا العصبية

The use of calcium indicators has greatly enhanced our understanding of neural dynamics and regulation. The nematode Caenorhabditis elegans, with its ...

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and neurodegenerative disease across species. Although these neurotoxic challenges have long been considered to be cell-intrinsic, considerable evidence now supports that misfolded human disease proteins originating in one neuron can appear in neighboring cells, a phenomenon proposed to promote pathology spread in human neurodegenerative disease.
C. elegans adult neurons that express aggregating proteins can extrude large (~4 &#181;m) membrane-surrounded vesicles that can include the aggregated protein, mitochondria, and lysosomes. These large vesicles are called &#8220;exophers&#8221; and are distinct from exosomes (which are about 100x smaller and have different biogenesis). Throwing out cellular debris in exophers may occur by a conserved mechanism that constitutes a fundamental, but formerly unrecognized, branch of neuronal proteostasis and mitochondrial quality control, relevant to processes by which aggregates spread in human neurodegenerative diseases.
While exophers have been mostly studied in animals that express high copy transgenic mCherry within touch neurons, these protocols are equally useful in the study of exophergenesis using fluorescently tagged organelles or other proteins of interest in various classes of neurons.
Described here are the physical features of C. elegans exophers, strategies for their detection, identification criteria, optimal timing for quantitation, and animal growth protocols that control for stresses that can modulate exopher production levels. Together, details of protocols outlined here should serve to establish a standard for quantitative analysis of exophers across laboratories. This document seeks to serve as a resource in the field for laboratories seeking to elaborate molecular mechanisms by which exophers are produced and by which exophers are reacted to by neighboring and distant cells.

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

This protocol describes approaches for detection and quantitation of large aggregate and/or organelle extrusions (~4 &#181;m) produced by C. elegans cells in the form of membrane-bound exophers. We describe strains, growth conditions, scoring criteria, timing, and microscopy considerations needed to facilitate dissection of this debris expulsion mechanism.