Name: in vivo imaging of dauer-specific neuronal remodeling in c. elegans
Uploaded: 2014-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans at JoVE.com

I thank Dr. Maureen Barr, under whose supervision the dauer IL2 remodeling phenotype was initially characterized. Thanks to Dr. C. Britt Carlson for critical reading of the manuscript. Funding in the Barr lab was from the NIH (5R01DK59418) and postdoctoral fellowships from the USDA (2010-65106-20587) and the New Jersey Commission on Spinal Cord Research (CSCR12FEL004). Current funding for this work is from a University of Illinois Urbana-Champaign College of ACES FIRE grant.

1. الخام داور إنتاج فرمون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو OP50 E. القولونية من مستعمرة يا واحد / N عند 37 درجة مئوية في حين تهتز في 100 مل من مرق LB عند 200 دورة في الدقيقة. ملاحظة: يمكن إجراء هذا O / N ثقافة مسبقا وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو N2 C. ايليجانس في يونيو 15-20 سم أطباق بتري مع NGM أجار (انظر الوصفة في الجدول 1) المصنف مع 50 ميكرولتر من OP50 E. حتى البكتيريا القولونية يتم استنفاد ما يقرب من 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 5X 250 مل من وسائل الإعلام S (انظر الوصفة في الجدول 1) في 1 L قوارير مخروطي 19. ملاحظة: يمكن إجراء هذا الحل مقدما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو ثقافة OP50 E. القولونية في 4 لتر ​​من مرق LB O / N، فحقن مع 1 مل من OP50 في E. القولونية وتهتز عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الديدان الخيطية من لوحات (الخطوة 1.2) مع 1 مل من محلول S القاعدية (انظر الوصفة في الجدول 1) والديدان الخيطية نقل 4-5 لوحات في كل من 4 1 L قوارير مخروطي مع وسائل الإعلام S أعدت في الخطوة 1.3 (4- 5 لوحاتلكل قارورة) 19. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي OP50 من الخطوة 1.4 في 650 x ج لمدة 10 دقيقة وإزالة طاف. و resuspend كل بيليه الجرثومي في 10 مل من محلول S القاعدية. نقل كميات متساوية من البكتيريا معلق على كل قارورة من الديدان الخيطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قوارير على شاكر المداري في درجة حرارة الغرفة (20 - 25 ° C) و100-150 دورة في الدقيقة لمدة 4 - 5 ايام حتى يبدأ الحل لمسح، مما يشير إلى استنزاف المواد الغذائية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم استنفاد المواد الغذائية، وتنمو ثقافة O / N آخر من OP50 E. القولونية في 4X 1 لتر من مرق LB. أجهزة الطرد المركزي البكتيريا في 650 x ج لمدة 10 دقيقة وإضافة بيليه من قارورة واحدة إلى كل من قوارير S سائل الاعلام مع الديدان الخيطية. العودة القوارير S سائل الإعلام إلى شاكر المداري، كما في الخطوة 1.7، ل3-4 أيام إضافية حتى يتم استنفاد الطعام مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نلقي ~ 1 مل قسامة من حل من كل قارورة وتقدير تركيز النيماتودا التي كتبها الفرعية أخذ العينات 1 ميكرولتر من كل 1 مل قسامة وتعول عدد من الديدان الخيطية. ملاحظة:يجب أن يكون السكان الخيطية 50،000 - 75،000 الديدان الخيطية / مل. في هذه تركيز غالبية الديدان الخيطية هي dauers. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل أي قوارير الملوثة. ملاحظة: يظهر التلوث في كثير من الأحيان كما خيوط فطرية ينظر خلال خطوة 1.9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الديدان الخيطية الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل بيليه الخيطية والاحتفاظ طاف. بدلا من ذلك، انظر مناقشة لاستخدام هذه الحيوانات لجعل فرمون منخفضة رجولية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصفية طاف من خلال رقم 1 هتما التصفية. ملاحظة: سوف قارورة فراغ تعجيل هذه العملية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعلاوة على ذلك تصفية طاف من خلال 0.45 ميكرون وحدات الترشيح الفراغ العقيم. ملاحظة: رشح يمكن أن تظل O / N عند 4 درجات مئوية أو المضي إلى 1.14. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الراشح إلى دورق 2 لتر مع بقضيب. وضع في غطاء الدخان على لوحة التدفئة ضجة. تقديمهم ليغلي مع التحريك وتتبخر إلى حوالي 200 مل. نقل الحل إلى كوب 500 مل. تواصل المغلي حتى ما يقرب من 50 مل هي جنيهقدم ملاحظة: يجب توخي الحذر خلال هذه الخطوة لأنه من الممكن حل الغليان. لون النهائية 50 مل هو البني الداكن. في أي وقت أثناء عملية الطبخ، ويمكن أن تحول الحرارة قبالة والراشح تخزين O / N في RT أو 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السماح لتبرد وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1،000 ز س. صب طاف في 100 مل كوب وتجاهل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغلي طاف وصولا الى القشرة البني. إزالة من الحرارة وتفريق القشرة مع ملعقة. إضافة الإيثانول 200 دليلا كافيا لتغطية القشرة. تغطية الكأس مع parafilm والسماح لها الجلوس O / N في RT. تخلصي من الايثانول في كوب نظيف ووضع إلى الجانب. إضافة الإيثانول النقي لتغطية القشرة. تكرار الاستخراج O / N 3 مرات. تجميع مقتطفات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مضخة فراغ لتجفيف مستخلصات الايثانول. إذا مضخة فراغ غير متوفرة، إضافة إلى استخراج الإيثانول دورق نظيفة ودافئة إلى 50 درجة مئوية مع التحريك في غطاء الدخان. ملاحظة: عندما تبخرت الايثانول بقايا لزجة من لترينبغي أن تظل آيت اللون البني. إذا تم استخدام التدفئة، وينبغي الحرص على عدم حرق حل عن طريق التسخين لفترة طويلة جدا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل بقايا في 10 مل من الماء المعقم المقطر. فلتر تعقيم هذا الحل مع فلتر حقنة 0.22 ميكرون وتخزينها في -20 درجة مئوية في 1 مل مأخوذة. ملاحظة: 1 مل من الماء يستخدم لإذابة بقايا لكل 100 مل من ثقافة الخيطية السائلة الأصلية. على سبيل المثال، إذا تم تجاهل واحد من قوارير ثقافة السائلة بسبب التلوث، ثم ضبط كمية المياه المستخدمة لإذابة بقايا. </li></ol> 2. تحديد الجرعة فرمون الاستجابة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد داور فرمون بجعل 6X 5 مل من NGM مع وسائل الإعلام نوبل أجار، دون ببتون، وتستكمل مع 50 ميكروغرام / مل كبريتات الستربتومايسين ومجموعة من داور فرمون (انظر الوصفة في الجدول رقم 1) 4، 19. اخلطي المكونات في 13x100 ملم الزجاج أنبوب الثقافة، وتغلي على موقد بنسن، ثم تصب في أطباق بتري 3 سم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزن صباحاأنبوب icrocentrifuge. إضافة 1 مل من O / N ثقافة E. القولونية OP50 إلى أنبوب وأجهزة الطرد المركزي في ~ 17،000 x ج في أنبوب microcentrifuge. إزالة كافة طاف. وزن الأنبوب مرة أخرى وتحديد وزن بيليه البكتيرية. resuspend الكرية مع M9 عازلة (انظر الوصفة في الجدول 1) لتركيز النهائي من 4٪ (ث / ت). قسامة 10 ميكرولتر من تعليق البكتيرية على مركز كل لوحة فرمون 4. مخزن لوحات O / N في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار 10-15 حبلي N2 من النوع البري المنحرفين بعد يوم واحد تساقط في مرحلة البلوغ على لوحات فرمون 4. تخزين لوحات عند 25 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سلخ كل من المنحرفين الكبار. تسجيل عدد البيض الذي تضعه على كل لوحة. ختم لوحات مع parafilm والعودة إلى 25 درجة مئوية لمدة 3 أيام 17. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عد نسبة dauers (الشكل 2). ملاحظة: بالنسبة لكلتا الطريقتين من المهم أن نلاحظ أن dauers (وإلى أقل السابقوخيمة غير dauers) يتسلق الجدران وعلى غطاء من أطباق بتري. ولذلك فمن المهم أن تدرس جميع الأسطح الطبق لالديدان الخيطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب البيانات إلى منحنى الاستجابة للجرعة وتقدير تركيز EC 90 من فرمون (فرمون كافية لإحداث 90٪ من الحيوانات لتشكيل dauers) كما هو مبين في الشكل (3) ملاحظة: نحن عادة استخدام نموذج الانحدار اللوجستي لتقدير EC 90 ، ولكن حزم البرامج الإحصائية المختلفة قد يكون لها طرق البديلة التي تنتج تقديرات مماثلة. </li></ol> 3. تصوير لايف من داور IL2 الخلايا العصبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لوحات داور فرمون كما في بروتوكول 2 باستخدام القيمة EC 90 تحديدها في الخطوة 2.6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمل dauers باستخدام الأساليب في بروتوكول 2 مع سلالة تحمل متكامل IL2 مراسل التحوير (myIs13 [P-6 ​​KLP :: GFP]، myIs14 [P-6 ​​KLP :: GFP]، myIs16 [P <eم&gt; KLP-6 :: tdTomato] أو qIs56 [P-2 :: تأخر GFP]) 12، 20، 21 ملاحظة: إذا تم استخدام ف Is56، والتعبير عن GFP لا تكون مرئية في IL2Qs حتى عدة ساعات في تساقط داور وبعض الأحداث إعادة الأولية لا تكون مرئية. بالإضافة إلى ذلك، في حين أن إشارة الفلورسنت من تأخر P-2 :: GFP التحوير هي أكثر إشراقا في نهاية المطاف في IL2s خلال داور من KLP P-6 صحفيين الفلورسنت، وP :: يعبر عن التأخر-2 التحوير GFP أيضا ضعيفة في عضلات الرأس التي يمكن أن تحجب فروع IL2 غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد وضع البيض، وإزالة المنحرفين الكبار، وختم لوحات مع parafilm واحتضان لمدة 34 ساعة عند 25 ° C 17. ملاحظة: طول الوقت لتساقط داور يختلف قليلا بين الأفراد. في معظم فترة سريعة من التغصنات تشجر تبدأ 4-5 ساعة بعد بداية تساقط داور (39-44آخر ساعة عند 25 درجة مئوية) 12 وضع البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم من التصوير، وتشكل حلا من 10٪ (ث / ت) الاغاروز في المخزن M9 مع داور فرمون في تركيز EC 90. قسامة حوالي 100 ميكرولتر من الاغاروز على شريحة المجهر وبسرعة، ولكن بلطف، ووضع شريحة أخرى على رأس لخلق سطح مسطح الاغاروز. بعد أن عززت agarose، والتفاف الشرائح في التفاف ساران وتخزينها في غرفة الرطوبة (ماصة مربع تلميح مع مناشف ورقية مبللة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة الحضانة 34 ساعة، وفحص لوحات فرمون عن الديدان الخيطية التي توقفت عن ضخ البلعوم. شرائح منفصلة بحيث سطح واحد فقط من شريحة واحدة لديه الاغاروز على ذلك. اختيار واحد أو أكثر من الديدان الخيطية على لوحة agarose 10٪ و 1 μ لتر من 0.1 ميكرون الخرز البوليسترين 22. ملاحظة: ويبلغ عدد سكانها متزامنة جيدا، وغالبية الديدان الخيطية على لوحة سوف تدخل في تساقط من L2d إلى داور. ومع ذلك، قد يكون هناك تباين بين طndividuals. ولذا فمن المهم أن نلاحظ الميزات الإضافية (انسداد أسنان، البلعوم إعادة عرض) لتقدير مقدار الوقت كانت الحيوانات داخل تساقط داور (انظر نتائج ممثلة على سبيل المثال). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد اتجاه (يسار / يمين، الظهرية / بطني) من الديدان الخيطية. التقاط الصور Z-كومة من التغصنات IL2Q في التكبير 100X بأقل كثافة مضان ممكن كل 15 دقيقة أو حسب الحاجة للتجربة محددة. مواصلة التقاط الصور حتى فصل الخيطية من إهاب L2d والشلل مستحيل أو إذا يتعافى الحيوان من داور (البلعوم يبدأ ضخ). عندما لا التصوير بنشاط، ضع الشريحة في غرفة الرطوبة. ملاحظة: نحن نستخدم مجهر المجهر epifluorescent مع الآلية تدخل مرحلة والتفضيلية النقيض (DIC) البصريات. </li></ol>

<ol>
	<li>West-Eberhard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Developmental Plasticity and Evolution. , (2003).</li><li>Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dauerlarva,+a+post-embryonic+developmental+variant+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 46, 326-342 (1975).</li><li>Riddle, D. L., Albert, P. S., Riddle , D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans II. , 739-768 (1998).</li><li>Golden, J. W., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+dauer+larva:+developmental+effects+of+pheromone,+food,+and+temperature.">The Caenorhabditis elegans dauer larva: developmental effects of pheromone, food, and temperature.</a> Dev. Biol. 102, 368-378 (1984).</li><li>Riddle, D. L., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Nematode C. elegans. , 393-412 (1988).</li><li>Fielenbach, N., Antebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+dauer+formation+and+the+molecular+basis+of+plasticity.">C. elegans dauer formation and the molecular basis of plasticity.</a> Genes Dev. 22, 2149-2165 (2008).</li><li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , 1-19 (2007).</li><li>Golden, J. W., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218, 578-580 (1982).</li><li>Butcher, R. A., Fujita, M., Schroeder, F. C., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+pheromones+that+control+dauer+development+in+Caenorhabditis+elegans.">Small-molecule pheromones that control dauer development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Chemical Biology. 3, 420-422 (2007).</li><li>Jeong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+structure+and+biological+activity+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer-inducing+pheromone.">Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone.</a> Nature. 433, 541-545 (2005).</li><li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans.">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454, 1115-1118 (2008).</li><li>Schroeder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dauer-Specific+dendrite+arborization+in+C.+regulated+by+KPC-1/Furin.">Dauer-Specific dendrite arborization in C. regulated by KPC-1/Furin.</a> Curr. Biol. 16, 1527-1535 (2013).</li><li>Procko, C., Lu, Y., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+delimit+shape+changes+of+sensory+neuron+receptive+endings+in+C.+elegans.">Glia delimit shape changes of sensory neuron receptive endings in C. elegans.</a> Development. 138, 1371-1381 (2011).</li><li>Albert, P. S., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+alterations+in+sensory+neuroanatomy+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer+larva.">Developmental alterations in sensory neuroanatomy of the Caenorhabditis elegans dauer larva.</a> J. Comp. Neurol. 219, 461-481 (1983).</li><li>Vowels, J. J., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+chemosensory+control+of+dauer+formation+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic analysis of chemosensory control of dauer formation in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 130, 105-123 (1992).</li><li>Vowels, J. J., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+chemosensory+defects+in+daf-11+and+daf-21+mutants+of+Caenorhabditis+elegans.">Multiple chemosensory defects in daf-11 and daf-21 mutants of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 138, 303-316 (1994).</li><li>Ailion, M., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dauer+formation+induced+by+high+temperatures+in+Caenorhabditis+elegans.">Dauer formation induced by high temperatures in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 156, 1047-1067 (2000).</li><li>Neal, S. J., Kim, K., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pheromone Signaling. , 273-283 (2013).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Ouellet, J., Li, S., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+is+required+for+both+dauer+maintenance+and+recovery+in+C.+elegans.">Notch signalling is required for both dauer maintenance and recovery in C. elegans.</a> Development. 135, 2583-2592 (2008).</li><li>Blelloch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gon-1+gene+is+required+for+gonadal+morphogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">The gon-1 gene is required for gonadal morphogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 216, 382-393 (1999).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, (2012).</li><li>Nelson, F. K., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+study+of+the+Caenorhabditis+elegans+secretory-excretory+system+using+laser+microsurgery.">Functional study of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system using laser microsurgery.</a> J. Exp. Zool. 231, 45-56 (1984).</li><li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode,+Caenorhabditis+elegans.">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li><li>Singh, R., Sulston, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+moulting+in+Caenorhabditis+elegans.">Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans.</a> Nematologica. 24, 63-71 (1978).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

دراسة المرونة العصبية داور محددة وغيرها من التغيرات المورفولوجية المرتبطة داور يتطلب التحكم وتشكيل موثوق بها من dauers إما عن طريق طفرة جينية (أي داف المسوخ ج) أو عن طريق التعرض البرية من نوع الحيوانات لفرمون. في حين أن استخدام طفرة جينية للحث dauers مريحة، قد ارب...

اللدونة المظهري، بما في ذلك اللدونة التنموية والسلوكية، مهم لعمليات التكيف مع الظروف البيئية المعاكسة وتعتبر قوة دافعة في التطور 1. C. ايليجانس هو كائن نموذج كثيرا ما تستخدم للدراسات في التنمية وبيولوجيا الأعصاب. في ظل ظروف مثالية، C. ايليجانس يتطور من خلال أربع مراحل اليرقات قبل دخول المرحلة الإنجابية الكبار. ومع ذلك، في ظل ظروف انخفاض توافر الغذاء والكثافة السكانية العالية، C. ايليجانس يمكن أن يخضع لعملية التحول التنموي والدخول في معمرة ومقاومة للإجهاد مرحلة داور 2. عرض Dauers العديد من الاختلافات الشكلية والسلوكية من غير dauers، والتي من المرجح توسط هذه المقاومة الإجهاد. كانت العظة البيئية والوراثية التي تنظم مسارات دخول داور وصف على نطاق واسع 3، 4، 5، 6، 7، إلا أن الآليات الجزيئية التي تتحكم في التغيرات المظهرية الفردية التي تحدث دأقل مفهومة جيدا تشكيل داور خلال شهر. دراسة الظواهر داور محددة يتطلب إنتاج الحيوانات داور. ويمكن تحقيق ذلك من خلال ثلاث طرق: 1) اختيار من ثقافة محرومة من C. ايليجانس، 2) استخدام داور تشكيل التأسيسية (داف ج) المسوخ، 3) تحريض تشكيل داور من خلال فرمون تنقيته. أنها بسيطة نسبيا لاختيار dauers من لوحة NGM القياسية مع C. السكان ايليجانس أن استنفد البكتيرية الإمدادات الغذائية لها. في أيدينا، وهي لوحة NGM القياسية المصنفة أصلا مع 50 ميكرولتر من OP50 القولونية، سمح لتنمو لمدة 3 أيام، وبعد ذلك تلقيح مع 3 - 4 المنحرفين الكبار أبقى عند 25 درجة مئوية واستنفاد الإمدادات الغذائية في غضون أسبوع وإنتاج عدة آلاف dauers في غضون 3 أيام إضافية (بالإضافة إلى العديد من تجويع غير dauers). ومع ذلك، وهذه الطريقة غير مرضية لعمليات فحص تحدث أثناء تساقط في دأوير. فإنه من الصعب تحديد أي من عدة آلاف من الحيوانات على لوحة تجويع نموذجية ندخل داور. وعلاوة على ذلك استخدام لوحة تجويع، لا يقدم أي إمكانية للتزامن. استخدام داف ج المسوخ يسمح لمزامنة والجيل موثوق بها من dauers. ومع ذلك، ليس هناك ما يضمن أن سوف معينة داف ج طفرة لا تؤثر الظواهر الأخرى داور الخاصة وحدها أو بالاشتراك مع الطفرات إضافية. وقد ضمنا وجود فرمون داور أول من Cassada وراسل وأظهرت في وقت لاحق من قبل الذهبي وريدل. فرمون داور منذ ذلك الحين اتسمت كيميائيا 2، 8، 9، 10. يتكون فرمون تنقيته من مزيج معقد من ascarosides، التي تنظم في أشكال مختلفة سواء العمليات السلوكية والتنموية 9 و 11. استخدام استخراج فرمون داور الخام يسمح لل الحث موثوق رقابة من dauers متزامنة في الخلفية من النوع البري. </P&gt; الجهاز العصبي والخلايا الدبقية المرتبطة الخضوع لإعادة تشكيل داور خلال 12 و 13 و 14 يرقة. بعض هذه التغيرات لا رجعة فيها، مثل إعادة الخلايا الدبقية خلال داور 13 و 14، ولكن غيرها من الأحداث هي إعادة عرض عكسها على العودة إلى مواتية الظروف البيئية. على سبيل المثال، مجموعة من أربعة الخلايا العصبية IL2Q الخضوع لإعادة الخلايا العصبية السريع وعكسها خلال تشكيل داور بما في ذلك: تشجر تغصناته، والتحول من واحد إلى شجيري الخلايا العصبية محوار multidendritic وإعادة 12. الطرق تسمح هذه الوثيقة لموثوق التصوير في الجسم الحي من التوتر الناجم المرونة العصبية في كائن نموذج. الأساليب المقدمة للإنتاج واختبار داور فرمون الخام موصوفة سابقا وتجميعها من عدة مصادر 4، 8، 15، 16، 17، 18.

<table><tbody><tr><td>N2 &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; Bristol strain</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PT2660 myIs13[P&lt;sub&gt;klp-6&lt;/sub&gt;::gfp] III</td><td>Upon request from Schroeder lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PT2762 myIs14[P&lt;sub&gt;klp-6&lt;/sub&gt;::gfp] V</td><td>Upon request from Schroeder lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JK2868 qIs56[P&lt;sub&gt;lag-2&lt;/sub&gt;::gfp] V</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Tritech Research</td><td>60 mm T3308, 35 mm T3501</td><td></td></tr><tr><td>NGM agar</td><td>Various</td><td></td><td>3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O autoclaved cooled to 55&amp;deg;C followed by 1 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 ml of 1 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; buffer (pH 6.0), 1 ml of 1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 ml of 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>S Media</td><td>Various</td><td></td><td>S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.5 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 250 ml. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 ml of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate&lt;sub&gt;, &lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 100 ml, autoclaved), 2.5 ml of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;bull;7 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.2 g MnCl2&amp;bull;4 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.29 g ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;bull;7 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.025 g CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;bull;5 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 L. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 ml of 1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, and 0.75 ml of 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.</td></tr><tr><td>Dauer pheromone plates for dose-response assay</td><td>Various</td><td></td><td>Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 ml of 0.513 M NaCl and 5 &amp;micro;l of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 ml culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to bring the volume to 4.725 ml.&amp;nbsp; Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 &amp;deg;C. Add 125 &amp;micro;l 1 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; buffer (pH 6.0), 50 &amp;micro;l 0.1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 50 &amp;micro;l 0.1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; and 50 &amp;micro;l of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.&amp;nbsp; Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).</td></tr><tr><td>Microsphere beads 0.1 micron</td><td>Polysciences Inc.</td><td>00876-15</td><td></td></tr><tr><td>M9 buffer</td><td>Various</td><td></td><td>Mix 3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 liter. Sterilize by autoclaving</td></tr></tbody></table>

in vivo imaging of dauer-specific neuronal remodeling in c. elegans

آليات السيطرة على الإجهاد الناجم عن المظهرية اللدونة في الحيوانات كثيرا ما تكون معقدة وصعبة للدراسة في الجسم الحي. والمثال الكلاسيكي من التوتر الناجم اللدونة هي المرحلة داور من C. ايليجانس. Dauers هي مرحلة اليرقات التنموية البديلة تشكلت في ظل ظروف تركيزات منخفضة من المواد الغذائية البكتيرية وتركيزات عالية من فرمون داور. عرض Dauers اللدونة التنموية والسلوكية واسعة النطاق. على سبيل المثال، مجموعة من أربعة رباعي الداخلية-شفوي (IL2Q) الخلايا العصبية تخضع لإعادة عكسها واسعة خلال تشكيل داور. الاستفادة من دخول مسارات بيئية تنظيم داور معروفة، وهي طريقة المحددة سابقا لإنتاج النفط الخام داور من فرمون على نطاق واسع الثقافات الخيطية السائلة ويتجلى. مع هذا الأسلوب، وهو تركيز 50،000 - 75،000 الديدان الخيطية / مل من ثقافة السائل كافية لإنتاج قوية للغاية داور الخام فرمون. رجولية فرمون الخام هي DETErmined من قبل الأحيائي الاستجابة للجرعة. وأخيرا، يتم وصف الأساليب المستخدمة لفي الجسم الحي الوقت الفاصل بين التصوير من خلال تشكيل IL2Qs داور.

إنتاج النفط الخام النتائج داور فرمون في السائل الأصفر (الشكل 1) في آن معا الحرارة ومستقرة البارد. يتم تخزين aliquots من فرمون الخام عند -20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى دون أي خسارة واضحة في النشاط. بعد إنتاج فرمون، واحد الأحيائي الاستجابة للجرعة كافية لتقدير تقريبي...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans at JoVE.com

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

في فيفو التصوير من داور محددة العصبية في إعادة عرض C. ايليجانس

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

in-vivo-imaging-of-dauer-specific-neuronal-remodeling-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

11.2K Views.  University of Illinois Urbana-Champaign. Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant ‘dauer’ juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer. 

Video: In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

ميكروفلويديك أجهزة بسيطة لل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من<em&gt; C. ايليجانس</em&gt;،<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; واسماك الزرد

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Bioengineering

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

في فيفو الكالسيوم التصوير في c. الهيئة عضلات الجدار الجسم

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Biochemistry

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Microchambers الاغاروز لفترة طويلة التصوير الكالسيوم من<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

التصوير C. ايليجانس الأجنة باستخدام مجهر Epifluorescent وبرمجيات المصدر المفتوح

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biology

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

شريحة موائع دقيقة بسيطة للنمو على المدى الطويل وتصوير Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

في الجسم الحي تقييم ديناميات Microtubule والتوجه في Caenorhabditis elegans الخلايا العصبية

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Quantifying Levels of Dopaminergic Neuron Morphological Alteration and Degeneration in Caenorhabditis elegans

Dopamine neuron loss is involved in the pathology of Parkinson&#39;s Disease (PD), a highly prevalent neurodegenerative disorder affecting over 10 million people worldwide. Since many details about PD etiology remain unknown, studies investigating genetic and environmental contributors to PD are needed to discover methods of prevention, management, and treatment. Proper characterization of dopaminergic neuronal loss may be relevant not only to PD research, but to other increasingly prevalent neurodegenerative disorders.
There are established genetic and chemical models of dopaminergic neurodegeneration in the Caenorhabditis elegans model system, with easy visualization of neurobiology supported by the nematodes&#39; transparency and invariant neuronal architecture. In particular, hermaphroditic C. elegans&#39; dopaminergic neuron morphological changes can be visualized using strains with fluorescent reporters driven by cell-specific promotors such as the dat-1 dopamine transporter gene, which is expressed exclusively in their eight dopaminergic neurons.
With the capabilities of this model system and the appropriate technology, many laboratories have studied dopaminergic neurodegeneration. However, there is little consistency in the way the data is analyzed and much of the present literature uses binary scoring analyses that capture the presence of degeneration but not the full details of the progression of neuron loss. Here, we introduce a universal scoring system to assess morphological changes and degeneration in C. elegans&#39; cephalic neuron dendrites. This seven-point scale allows for analysis across a full range of dendrite morphology, ranging from healthy neurons to complete dendrite loss, and considering morphological details including kinks, branching, blebs, and breaks. With this scoring system, researchers can quantify subtle age-related changes as well as more dramatic chemical-induced changes. Finally, we provide a practice set of images with commentary that can be used to train, calibrate, and assess the scoring consistency of researchers new to this method. This should improve within- and between- laboratory consistency, increasing rigor and reproducibility.

Quantifying Levels of Dopaminergic Neuron Morphological Alteration and Degeneration in Caenorhabditis elegans

In this article, we showcase how to use a seven-point scoring system to consistently quantify changes to dopaminergic neuron dendrite morphology in C. elegans. This system is intended for analyses of dopaminergic neurodegeneration assays utilizing genetic, chemical, and age-based models of neurodegenerative disorders.

تحديد مستويات الدوبامين الخلايا العصبية التغيير المورفولوجي وانحطاط في Caenorhabditis elegans

Dopamine neuron loss is involved in the pathology of Parkinson&#39;s Disease (PD), a highly prevalent neurodegenerative disorder affecting over 10 million ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

التصوير تحت الخلوي للتعامل مع الكالسيوم العصبي في الجسم الحي

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

في فيفو التصوير من داور محددة العصبية في إعادة عرض C. ايليجانس

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ميكروفلويديك أجهزة بسيطة لل

في فيفو الكالسيوم التصوير في c. الهيئة عضلات الجدار الجسم

الكالسيوم في الجسم الحي التصوير الخلايا العصبية في C. ايليجانس

Microchambers الاغاروز لفترة طويلة التصوير الكالسيوم من

التصوير C. ايليجانس الأجنة باستخدام مجهر Epifluorescent وبرمجيات المصدر المفتوح

شريحة موائع دقيقة بسيطة للنمو على المدى الطويل وتصوير Caenorhabditis elegans

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

في الجسم الحي تقييم ديناميات Microtubule والتوجه في Caenorhabditis elegans الخلايا العصبية

تحديد مستويات الدوبامين الخلايا العصبية التغيير المورفولوجي وانحطاط في Caenorhabditis elegans

التصوير تحت الخلوي للتعامل مع الكالسيوم العصبي في الجسم الحي