Name: in vivo imaging of dauer-specific neuronal remodeling in c. elegans
Uploaded: 2014-09-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans at JoVE.com

I thank Dr. Maureen Barr, under whose supervision the dauer IL2 remodeling phenotype was initially characterized. Thanks to Dr. C. Britt Carlson for critical reading of the manuscript. Funding in the Barr lab was from the NIH (5R01DK59418) and postdoctoral fellowships from the USDA (2010-65106-20587) and the New Jersey Commission on Spinal Cord Research (CSCR12FEL004). Current funding for this work is from a University of Illinois Urbana-Champaign College of ACES FIRE grant.

1. Ham Dauer Feromon Üretimi <ol><li> OP50 E. büyütün Tek bir koloni, O / N 37 ° C &#39;de E. coli 200 rpm&#39;de LB suyu 100 ml çalkalandı. NOT: Bu göre O / N kültür önceden yapılmış ve 4 ° C&#39;de saklanabilir. </li><li> N2 C büyütün elegans, 15 - 20 OP50 E: 50 ul NGM ağarma (Tablo 1 &#39;de tarif bak) ile 6 cm Petri kapları coli bakteri kadar neredeyse 19 tükenmiş. </li><li> 1 L Erlenmeyer&#39;de S medya 5x 250 ml (Tablo 1 tarifi görün) Marka 19 şişeleri. NOT: Bu çözüm önceden yapılabilir. </li><li> OP50 E. kültürünü büyütün E. coli &#39;de OP50 1 ml LB suyu aşılayarak O 4 L / K coli E. coli ve 16 saat boyunca 37 ° C&#39;de çalkalanarak. </li><li> , (S bazal çözeltisi (Tablo 1 &#39;de tarif bak) ve Aşama 1.3&#39; de hazırlanan media, 4: 1 L&#39;lik Erlenmeyer kaplanna her birinin içine, 4-5 plakalarından buraya nematod 1 ml levhalar (adım 1.2) için 4- nematodları yıkayın 5 plakalarıHer şişe için) 19,. </li><li> 10 dakika boyunca 650 x g&#39;de aşama 1.4 OP50 santrifüj ve supernatant çıkarın. G taban çözeltisi 10 ml her bir bakteri pelletini. Nematodların her şişeye yeniden süspansiyon haline getirildi bakteri eşit miktarda aktarın. </li><li> Çözelti, yiyecek tükenmesi gösteren temizlemek için başlayana kadar 5 gün - (- 25 ° C&#39;de 20) ve 100 - 4 150 rpm&#39;de oda sıcaklığında bir orbital çalkalayıcı üzerinde şişeler yerleştirin. </li><li> Gıda bitince, OP50 E. başka bir O / N kültür büyümek LB suyu 4x 1 L E. coli. 10 dakika boyunca 650 x g&#39;de santrifüj ve bakteri, nematodlar ile media şişelere her bir şişeye bir pelet ekleyin. Gıda daha bitene kadar ilave 3-4 gün boyunca, Aşama 1.7 gibi orbital çalkalayıcıya S ortam şişeler dönün. </li><li> Her bir şişeden bir çözelti ~ 1 ml lik bir alın ve her biri 1 ml&#39;lik bir 1 ul alt-numûne alma ve nematodların sayısını sayarak nematod konsantrasyonu tahmin ediyoruz. NOT:75,000 nematodlar / mL - nematod popülasyonu 50,000 olmalıdır. Bu konsantrasyonda nematod çoğunluğu dauers bulunmaktadır. </li><li> Kirlenmiş şişeleri atın. NOT: Kirlilik sık adımı 1.9 sırasında görülen hyphe&#39;nin olarak tezahür eder. </li><li> 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca 4000 x g&#39;de santrifüje nematodlar. Nematod pelet atın ve süpernatant saklayın. Alternatif olarak, düşük potens feromon yapmak için bu hayvanları kullanarak tartışma bakın. </li><li> # 1 Whatman filtre kağıdı ile süpernatantı Filtresi. NOT: Bir termos bu süreci hızlandırmak olacaktır. </li><li> Ayrıca 0.45 mikron steril vakumlu filtrasyon üniteleri ile süpernatant süzün. Not: Filtrat, 4 ° C&#39;de O / N ya da muhafaza 1,14 devam edilebilir. </li><li> Bir karıştırma çubuğu ile bir 2 L&#39;lik bir kap için filtrat ekleyin. Bir ısıtma karıştırma plakası üzerinde bir çeker ocak içinde yerleştirin. Karıştırılarak bir taşım kaynatın ve yaklaşık 200 ml buharlaşır. 500 ml&#39;lik bir behere çözeltisini. Yaklaşık 50 ml le kadar kaynar Devamft. NOT: çözüm taşmak için mümkün olduğu gibi Bakım bu adım sırasında alınmalıdır. Son 50 ml&#39;lik rengi koyu kahverengi. Pişirme işlemi sırasında herhangi bir zamanda, ısı kapatılabilir ve süzülen madde, oda sıcaklığında ya da 4 ° C &#39;de O / N saklanır. </li><li> G soğuması ve x 1000 de 5 dakika süreyle santrifüj. 100 ml&#39;lik bir beher içine dökün ve süpernatant pelet atılır. </li><li> Kahverengi bir kabuk yüzer aşağı kaynatın. Ateşten alın ve bir spatula ile kabuk kırmaya. Kabuk karşılamak için yeterli 200 derece etanol ekleyin. Parafilm ile beher örtün ve oda sıcaklığında O / N bekletin. Temiz bir beher içine dökün ve etanol tarafına yerleştirin. Kabuk kapağı taze etanol ekleyin. O / N Extractions 3 kez tekrarlayın. Ekstraktları havuzda toplayın. </li><li> Etanol ekstraktları için bir vakum pompası kullanılır. Bir vakum pompası mevcut değilse, bir çeker ocak içinde, bir taraftan karıştırılırken 50 ° C&#39;ye kadar temiz bir cam deney ve sıcak etanol ile özü ekleyin. NOT: etanol l yapışkan bir kalıntı buharlaştırılarak sonraIght kahverengi kalmalıdır. Isıtma kullanıldığı takdirde, çok uzun süre bakım ısıtılarak çözelti yakmak için özen gösterilmesi gerekmektedir. </li><li> Damıtılmış steril su içinde 10 ml bir tortu çözülür. Filtre 1 ml alikotlar içinde -20 ° C&#39;de bir 0.22 um şırınga filtre ve mağaza bu solüsyon sterilize edin. Not: 1 ml su esas sıvı nematod kültürünün her 100 ml için en eritilmesi için kullanılır. Sıvı kültür şişelerinden bir kirlenme nedeniyle göz ardı edilir, örneğin, daha sonra bir tortu çözmek için kullanılan su miktarını ayarlayın. </li></ol> Feromon Doz Tepki 2. belirlenmesi <ol><li> Peptonu olmadan Noble agar NGM ortamı 6x 5 ml yaparak Dauer feromon hazırlanmakta ve 50 ug / ml streptomisin sülfat ug ve dayanıklı feromon bir dizi ile takviye edilmiştir. 4, 19 (Tablo 1 &#39;de tarife bakınız), bir 13x100 mm Karışım bileşenleri cam kültürü tüp, bir Bunsen beki taşmak, ve daha sonra 3 cm Petri kaplarına dökün. </li><li> Am tartılıricrocentrifuge tüpü. E. göre O / N kültürün 1 ml ekleyin mikrosantrifüj tüp içinde ~ 17.000 x g&#39;de tüp ve santrifüj coli OP50. Yüzer sökün. Yine tüp tartılır ve bakteryel tanelerin ağırlığını belirler. % 4&#39;lük bir konsantrasyon için M9 tampon (Tablo 1 &#39;de tarif bakınız) pelletini (a / h). Her bir kısım feromon plaka 4 merkezinin üzerine bakteri süspansiyonundan 10 ul. Mağaza plakaları O / N, oda sıcaklığında. </li><li> Feromon plakalar 4 üzerine yetişkinliğe molt sonra 10-15 gebe N2 vahşi tip çift cinsiyetli bir gün seçin. 4 saat için 3 - 25 ° C&#39;de plakalar saklayın. </li><li> Yetişkin çift cinsiyetli tüm koparmak. Her plaka için bıraktıkları yumurta sayısını kaydedin. Parafilm ile sızdırmaz şekilde kapatılır ve plakaları, 3 gün 17 boyunca 25 ° C&#39;de geri döner. </li><li> Dauers yüzdesini Sayısı (Şekil 2). Not: her iki yöntem için, dikkat edilmelidir ki dauers (ve daha az bir exÇadır olmayan dauers) duvarlara tırmanmaya ve Petri yemekler kapağın üzerine olacaktır. Bu nematod için yemeğin tüm yüzeyini incelemek için bu nedenle önemlidir. </li><li> Bir doz-tepki eğrisi için verilerin Fit ve Şekil 3&#39;te gösterildiği gibi (dauers meydana getirmek üzere hayvanların% 90 uyarılması için yeterli bir feromon) feromonun EC90 konsantrasyonu tahmin Not:. Normal olarak, AK 90 tahmin etmek için bir lojistik regresyon modeli kullanmak ama farklı istatistiksel yazılım paketi benzer tahminler üretmek alternatif yöntemleri olabilir. </li></ol> Dauer IL2 Nöronlar 3. Canlı Görüntüleme <ol><li> Adım 2.6 belirlenen AT 90 değerini kullanarak protokolü 2 gibi Dauer feromon tabak hazırlayın. </li><li> Entegre IL2 muhabiri transgenini taşıyan bir suş (myIs13 [P klp-6 :: GFP], myIs14 [P klp-6 :: GFP], myIs16 [P protokol 2&#39;de yöntemleri kullanarak dauers Uyarmaktadır <em&gt; KLP-6 :: tdTomato] veya qIs56 [P ara-2 :: GFP]) 12, 20, 21 Not: eq. Is56 kullanılırsa, GFP ifade içine birkaç saat kadar IL2Qs görünür olmayacak Dauer dökücü ve ilk biçimlenme bazı olaylar görünür olmayacaktır. P ara-2 :: GFP transgenden flüoresan sinyal P KLP-6 floresan muhabir daha Dauer sırasında IL2s sonuçta parlak iken, ayrıca, p-Gecikmeli 2 :: GFP Transgen kası zayıf biçimde ifade eden ince IL2 dalları maskeleyebilir. </li><li> Yumurtlama izlenerek, ergin hermafrodit bireyler çıkarmak Parafilm ile sızdırmaz plakalar 25 ° C de 17 34 saat boyunca inkübe edilir. NOT: Dauer molt için zaman uzunluğu bireyler arasında biraz değişir. Dauer molt başlangıcından itibaren 5 hr (39 - - dendrit arborization en hızlı dönemdir 4 başlıyor 44saat sonrası yumurtlama 25 ° C) 12,. </li><li> Görüntüleme bir gün önce, EC90 konsantrasyonunda Dauer feromonu ile M9 tampon% 10 ihtiva eden bir çözelti (ağ / hac) agaroz oluşturur. Agaroz kısım yaklaşık 100 ul bir mikroskop lamı üzerine ve hızlı bir şekilde, ancak, hafifçe düz bir yüzey oluşturmak için agaroz üzerine başka bir slayt yerleştirin. Agaroz katılaşmış sonra bir nem odasına (ıslak kağıt havlu ile pipet kutusu), saran sargısına ve mağaza slaytlar sarın. </li><li> 34 saat kuluçka döneminden sonra, yutak pompalamayı durdurdu nematod için feromon plakaları inceleyin. Ayrı slaytlar bir sürgünün sadece bir yüzü üzerinde agaroz sahip bileşimleri içerir. % 10 agaroz pad ve 0.1 mikron polistiren boncuklar 22 1 μ l üzerine bir veya daha fazla nematod seçin. Not: iyi senkronize nüfusu ile plaka üzerinde nematodların çoğunluğu L2D gelen Dauer için molt giren edilecektir. Ancak, i arasında değişimi olabilirndividuals. Bu hayvanlar Dauer molt içinde olmuştur süre (örneğin temsili sonuçlar bakınız) miktarını tahmin etmek için ek özellikler (stoma tıkanıklığı, boğaz yeniden şekillenme) dikkat etmek önemlidir. </li><li> Nematod yönünü (sol / sağ, dorsal / ventral) belirleyin. Mümkün olan en düşük floresan ile 100x büyütmede her 15 dakika bir IL2Q dendritin Z-yığın görüntüleri yakalayabilir veya belirli bir deney için gerektiği gibi. (Yutak pompalama başlar) nematod L2D manikür ayrılmış kadar görüntü yakalamayı devam edin ve hayvan Dauer kurtarır eğer hareketsizlik imkansız ya. Aktif görüntüleme zamanlarda, bir nemlilik bölmesi içinde slayt yerleştirin. NOT: Bir motorlu sahne ve diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik bir epifluorescent mikroskop kullanıyoruz. </li></ol>

<ol>
	<li>West-Eberhard, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Developmental Plasticity and Evolution. , (2003).</li><li>Cassada, R. C., Russell, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dauerlarva,+a+post-embryonic+developmental+variant+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The dauerlarva, a post-embryonic developmental variant of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 46, 326-342 (1975).</li><li>Riddle, D. L., Albert, P. S., Riddle , D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> C. elegans II. , 739-768 (1998).</li><li>Golden, J. W., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Caenorhabditis+elegans+dauer+larva:+developmental+effects+of+pheromone,+food,+and+temperature.">The Caenorhabditis elegans dauer larva: developmental effects of pheromone, food, and temperature.</a> Dev. Biol. 102, 368-378 (1984).</li><li>Riddle, D. L., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Nematode C. elegans. , 393-412 (1988).</li><li>Fielenbach, N., Antebi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+dauer+formation+and+the+molecular+basis+of+plasticity.">C. elegans dauer formation and the molecular basis of plasticity.</a> Genes Dev. 22, 2149-2165 (2008).</li><li>Hu, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , 1-19 (2007).</li><li>Golden, J. W., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+influences+larval+development+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">A pheromone influences larval development in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 218, 578-580 (1982).</li><li>Butcher, R. A., Fujita, M., Schroeder, F. C., Clardy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+pheromones+that+control+dauer+development+in+Caenorhabditis+elegans.">Small-molecule pheromones that control dauer development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature Chemical Biology. 3, 420-422 (2007).</li><li>Jeong, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+structure+and+biological+activity+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer-inducing+pheromone.">Chemical structure and biological activity of the Caenorhabditis elegans dauer-inducing pheromone.</a> Nature. 433, 541-545 (2005).</li><li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans.">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454, 1115-1118 (2008).</li><li>Schroeder, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dauer-Specific+dendrite+arborization+in+C.+regulated+by+KPC-1/Furin.">Dauer-Specific dendrite arborization in C. regulated by KPC-1/Furin.</a> Curr. Biol. 16, 1527-1535 (2013).</li><li>Procko, C., Lu, Y., Shaham, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia+delimit+shape+changes+of+sensory+neuron+receptive+endings+in+C.+elegans.">Glia delimit shape changes of sensory neuron receptive endings in C. elegans.</a> Development. 138, 1371-1381 (2011).</li><li>Albert, P. S., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+alterations+in+sensory+neuroanatomy+of+the+Caenorhabditis+elegans+dauer+larva.">Developmental alterations in sensory neuroanatomy of the Caenorhabditis elegans dauer larva.</a> J. Comp. Neurol. 219, 461-481 (1983).</li><li>Vowels, J. J., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+chemosensory+control+of+dauer+formation+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic analysis of chemosensory control of dauer formation in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 130, 105-123 (1992).</li><li>Vowels, J. J., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+chemosensory+defects+in+daf-11+and+daf-21+mutants+of+Caenorhabditis+elegans.">Multiple chemosensory defects in daf-11 and daf-21 mutants of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 138, 303-316 (1994).</li><li>Ailion, M., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dauer+formation+induced+by+high+temperatures+in+Caenorhabditis+elegans.">Dauer formation induced by high temperatures in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 156, 1047-1067 (2000).</li><li>Neal, S. J., Kim, K., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pheromone Signaling. , 273-283 (2013).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Ouellet, J., Li, S., Roy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signalling+is+required+for+both+dauer+maintenance+and+recovery+in+C.+elegans.">Notch signalling is required for both dauer maintenance and recovery in C. elegans.</a> Development. 135, 2583-2592 (2008).</li><li>Blelloch, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gon-1+gene+is+required+for+gonadal+morphogenesis+in+Caenorhabditis+elegans.">The gon-1 gene is required for gonadal morphogenesis in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 216, 382-393 (1999).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 107, (2012).</li><li>Nelson, F. K., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+study+of+the+Caenorhabditis+elegans+secretory-excretory+system+using+laser+microsurgery.">Functional study of the Caenorhabditis elegans secretory-excretory system using laser microsurgery.</a> J. Exp. Zool. 231, 45-56 (1984).</li><li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-embryonic+cell+lineages+of+the+nematode,+Caenorhabditis+elegans.">Post-embryonic cell lineages of the nematode, Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 56, 110-156 (1977).</li><li>Singh, R., Sulston, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+moulting+in+Caenorhabditis+elegans.">Some observations on moulting in Caenorhabditis elegans.</a> Nematologica. 24, 63-71 (1978).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Dauer özgü nöroplastik Dauer ve diğer ilişkili morfolojik değişikliklerin bir inceleme kontrol edilebilir ve her iki genetik mutasyon (örneğin, DAF,-C mutantları) vasıtasıyla veya feromon vahşi tip hayvanların maruz bırakılarak dauers güvenilir oluşturulmasını gerektirir. Dauers ikna etmek için bir genetik mutasyon kullanımı uygun olsa da, bu sonuçlar yanıltabilecek. Bu nedenle Daf-c mutasyonlar ile toplanan veriler daha sonra Dauer feromon maruz Dauer sahne girmek için uyarı...

Gelişimsel ve davranışsal plastisite fenatipik plastisite, olumsuz çevre koşullarına adaptasyonları için önemlidir ve evrim 1 itici bir güç olarak kabul edilir. C. elegans sık geliştirme ve nörobiyoloji çalışmalar için kullanılan bir model organizmadır. İdeal koşullar altında, C. elegans yetişkin üreme aşamasına başlamadan önce dört larva aşamalardan geçerek gelişir. Ancak, düşük gıda kullanılabilirlik ve yüksek nüfus yoğunluğu, C koşulları altında elegans gelişimsel anahtarı geçmesi ve uzun ömürlü ve stres dayanıklı Dauer evre 2 içine girebilirsiniz. Dauers olasılıkla bu stres direnci aracılık olmayan dauers birkaç morfolojik ve davranışsal farklılıklar gösterecektir. Dauer girişi düzenleyen çevre kuyrukları ve genetik yollar yoğun oldu, 5, 4, 3 6, 7 nitelendirdiler. Ancak, bireysel fenotipik değişiklikleri kontrol eden moleküler mekanizmalar d meydana olduğunurada Dauer oluşumu daha az iyi anlaşılmaktadır. Dauer özgü fenotiplerinin incelenmesi Dauer hayvanların üretimini gerektirir. Bu üç şekilde yapılabilir: 1) C bir açlıktan kültüründen Çekme elegans, 2) Dauer oluşum bünye (Daf-c) mutantlar, arıtılmış feromon sayesinde Dauer oluşumu 3) ndüksiyonunun kullanımı. Bir C ile standart bir NGM plaka ikinci dauers almak için nispeten basit onun bakteriyel gıda arzını tükenmiş elegans nüfus. Elimizde olanlar, standart bir NGM plaka orjinal 3 gün büyümeye bırakıldı ve daha sonra 3 ile aşılanmış Escherichia coli OP50, 50 ul ile tohumlanmış - 4 ergin hermafrodit bireyler bir hafta içinde gıda kaynağı dışarı atmasını sağlar ve birkaç bin üretecek 25 ° C&#39;de tutuldu İlave bir 3 gün içinde dauers (çok sayıda açlıktan olmayan dauers ek olarak). Bununla birlikte, bu yöntem, d içine molt sırasında meydana gelen incelenmesi işlemleri için tatmin edici değildirauer. Bu Dauer girmektedir tipik bir açlıktan plaka üzerinde bir kaç bin hayvan belirlemek zordur. Ayrıca, hasret plaka kullanımı senkronizasyonu için hiçbir imkanı sunuyor. DAF-C mutantlarının kullanımı senkronizasyon ve dauers güvenilir oluşturulmasına izin verir. Ancak, belirli bir Daf-c mutasyonu tek başına veya ek mutasyonlar ile birlikte diğer Dauer özgü fenotipleri etkilemez garantisi yoktur. Bir Dauer feromon varlığı ilk Cassada ve Russell tarafından ima ve daha sonra Altın ve Riddle tarafından gösterilmiştir. Dauer feromon yana kimyasal olarak 9, 10 8, 2 karakterize edilmiştir. Arıtılmış feromon farklı şekillerde 9, bir ham özü Dauer feromon 11. Kullanımlar sağlar hem hareketsel hem de gelişim süreçleri düzenleyen ascarosides karmaşık bir harmanından oluşur doğal tipte bir arka senkronize dauers güvenilir kontrol indüksiyonu. </p&gt; Sinir sistemi ve ilişkili glial hücreler Dauer larva oluşumu 12, 13, 14 sırasında biçimlenme geçmesi. Bu değişikliklerin bazıları, Dauer 13, 14 sırasında glia hücrelerinin yeniden olarak, geri döndürülemez. Ancak, başka biçimlenme olayları olumlu bir dönüş üzerine geri dönüşümlüdür çevre koşulları. Dendrit arborization, multidendritic nöronlar ve akson 12 biçimlenme tek dendritik bir anahtarı: Örneğin, dört IL2Q nöronların bir dizi dahil Dauer oluşumu sırasında hızlı ve geri dönüşümlü nöronal biçimlenme tabi. Buradaki yöntemler, bir model organizmada strese bağlı nöroplastisitesi güvenilir bir in vivo görüntüleme için izin verir. Üretim ve ham Dauer feromon testleri için sunulan yöntemler, daha önce çeşitli kaynaklardan 4, 8, 15, 16, 17, 18 tarif edilen ve derlenmektedir.

<table><tbody><tr><td>N2 &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt; Bristol strain</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PT2660 myIs13[P&lt;sub&gt;klp-6&lt;/sub&gt;::gfp] III</td><td>Upon request from Schroeder lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PT2762 myIs14[P&lt;sub&gt;klp-6&lt;/sub&gt;::gfp] V</td><td>Upon request from Schroeder lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JK2868 qIs56[P&lt;sub&gt;lag-2&lt;/sub&gt;::gfp] V</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OP50 E. coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Tritech Research</td><td>60 mm T3308, 35 mm T3501</td><td></td></tr><tr><td>NGM agar</td><td>Various</td><td></td><td>3 g NaCl, 17 g agar, 2.5 g peptone in 975 ml H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O autoclaved cooled to 55&amp;deg;C followed by 1 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol, 25 ml of 1 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; buffer (pH 6.0), 1 ml of 1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 1 ml of 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>S Media</td><td>Various</td><td></td><td>S media consists of S basal solution (1.46 g NaCl, 0.25g K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 1.5 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.25 ml of 5 mg/ml cholesterol in ethanol and H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 250 ml. Autoclaved.) To the S basal solution add 2.5 ml of potassium citrate pH 6.0 (2 g citric acid monohydrate, 29.4 g tri-potassium citrate monohydrate&lt;sub&gt;, &lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 100 ml, autoclaved), 2.5 ml of Trace Metals Solution (1.86 g disodium EDTA, 0.69 g FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;bull;7 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.2 g MnCl2&amp;bull;4 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.29 g ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;bull;7 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, 0.025 g CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;&amp;bull;5 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 L. Autoclaved and stored in the dark), 0.75 ml of 1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, and 0.75 ml of 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.</td></tr><tr><td>Dauer pheromone plates for dose-response assay</td><td>Various</td><td></td><td>Mix 0.085 g Noble agar, 0.5 ml of 0.513 M NaCl and 5 &amp;micro;l of 5 mg/ml cholesterol dissolved in ethanol in each of 6x 15 ml culture tubes. Add sufficient crude pheromone to each tube to create a range of concentrations. Add H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to bring the volume to 4.725 ml.&amp;nbsp; Boil over a Bunsen burner until the agar is dissolved and then cool to 55 &amp;deg;C. Add 125 &amp;micro;l 1 M KPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; buffer (pH 6.0), 50 &amp;micro;l 0.1 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 50 &amp;micro;l 0.1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; and 50 &amp;micro;l of 5 mg/ml streptomycin sulfate to each tube.&amp;nbsp; Pour the contents of each tube into a 35 mm diameter Petri dish. Let the agar solidify at room temperature overnight (if longer, store in enclosed container to prevent excessive drying).</td></tr><tr><td>Microsphere beads 0.1 micron</td><td>Polysciences Inc.</td><td>00876-15</td><td></td></tr><tr><td>M9 buffer</td><td>Various</td><td></td><td>Mix 3 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 6 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 liter. Sterilize by autoclaving</td></tr></tbody></table>

in vivo imaging of dauer-specific neuronal remodeling in c. elegans

Hayvanlarda stres ile indüklenen fenotipik esneklik kontrol mekanizmaları incelemek için in vivo olarak çoğunlukla kompleks ve zordur. Stres ile indüklenen plastisite klasik bir örneği, C Dauer aşamasıdır elegans. Dauers bakteriyel gıda ve Dauer feromon yüksek konsantrasyonlarının düşük konsantrasyonlarda koşulları altında oluşan alternatif bir gelişim larva bulunmaktadır. Dauers kapsamlı gelişimsel ve davranışsal plastisite gösterir. Örneğin, dört iç dudak kadran bir dizi (IL2Q) nöronları Dauer oluşumu sırasında Reverzibl remodeling tabi tutulur. Büyük ölçekli sıvı nematod kültürlerinden ham Dauer feromonunun üretimi için iyi bilinen çevre yollarını düzenlemeye Dauer girişi, önceden belirlenmiş bir yöntem kullanılarak gösterilmiştir. Bu yöntemle, 50,000 &#39;lik bir konsantrasyon - sıvı kültürü 75,000 nematod / ml bir yüksek ölçüde kuvvetli ham Dauer feromon üretmek için yeterlidir. Ham feromon gücü olan deteBir doz-tepki biyo-tahlil ile rmined. Son olarak, Dauer oluşumu sırasında IL2Qs in vivo zaman atlamalı görüntüleme için kullanılan yöntemler tarif edilmiştir.

Isı, soğuk ve stabil olarak sarı bir sıvı ham Dauer feromon sonuçları (Şekil 1) üretimi. Ham feromon alikotlar aktivitesinde belirgin bir kayıp olmadan, süresiz olarak -20 ° C&#39;de saklanır. Feromonun üretiminin ardından, tekli bir doz-yanıt potens biyolojik tayin, kaba bir tahmin için yeterlidir. 3 kez ve her deneyde bir ortalamasını alın - Bununla birlikte, çoğu deneyleri için bu biyo-analizi tekrar 2 için gereklidir. Iki feromon biyoanalizlere Temsilcisi sonuçları ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans at JoVE.com

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

C. Dauer-spesifik nöronal Yaptırma Vivo Görüntülemede elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

in-vivo-imaging-of-dauer-specific-neuronal-remodeling-in-c-elegans

Research

JoVE Journal

Neuroscience

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

11.2K Görüntüleme.  University of Illinois Urbana-Champaign. Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant ‘dauer’ juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer. 

Video: In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are available for microfluidic devices using soft lithography techniques 1-3. Microfluidic devices have been used for sub-cellular imaging 4,5, in vivo laser microsurgery 2,6 and cellular imaging 4,7. In vivo imaging requires immobilization of organisms. This has been achieved using suction 5,8, tapered channels 6,7,9, deformable membranes 2-4,10, suction with additional cooling 5, anesthetic gas 11, temperature sensitive gels 12, cyanoacrylate glue 13 and anesthetics such as levamisole 14,15. Commonly used anesthetics influence synaptic transmission 16,17 and are known to have detrimental effects on sub-cellular neuronal transport 4. In this study we demonstrate a membrane based poly-dimethyl-siloxane (PDMS) device that allows anesthetic free immobilization of intact genetic model organisms such as Caenorhabditis elegans (C. elegans), Drosophila larvae and zebrafish larvae. These model organisms are suitable for in vivo studies in microfluidic devices because of their small diameters and optically transparent or translucent bodies. Body diameters range from ~10 &mu;m to ~800 &mu;m for early larval stages of C. elegans and zebrafish larvae and require microfluidic devices of different sizes to achieve complete immobilization for high resolution time-lapse imaging. These organisms are immobilized using pressure applied by compressed nitrogen gas through a liquid column and imaged using an inverted microscope. Animals released from the trap return to normal locomotion within 10 min.
We demonstrate four applications of time-lapse imaging in C. elegans namely, imaging mitochondrial transport in neurons, pre-synaptic vesicle transport in a transport-defective mutant, glutamate receptor transport and Q neuroblast cell division. Data obtained from such movies show that microfluidic immobilization is a useful and accurate means of acquiring in vivo data of cellular and sub-cellular events when compared to anesthetized animals (Figure 1J and 3C-F 4).
Device dimensions were altered to allow time-lapse imaging of different stages of C. elegans, first instar Drosophila larvae and zebrafish larvae. Transport of vesicles marked with synaptotagmin tagged with GFP (syt.eGFP) in sensory neurons shows directed motion of synaptic vesicle markers expressed in cholinergic sensory neurons in intact first instar Drosophila larvae. A similar device has been used to carry out time-lapse imaging of heartbeat in ~30 hr post fertilization (hpf) zebrafish larvae. These data show that the simple devices we have developed can be applied to a variety of model systems to study several cell biological and developmental phenomena in vivo.

Simple Microfluidic Devices for in vivo Imaging of C. elegans, Drosophila and Zebrafish

A simple microfluidic device has been developed to perform anesthetic free in vivo imaging of C. elegans, intact Drosophila larvae and zebrafish larvae. The device utilizes a deformable PDMS membrane to immobilize these model organisms in order to perform time lapse imaging of numerous processes such as heart beat, cell division and sub-cellular neuronal transport. We demonstrate the use of this device and show examples of different types of data collected from different model systems.

Için basit Mikroakışkan Cihazlar<em&gt; In vivo</emVe&gt; Görüntüleme<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Ve Zebra balığı

Micro fabricated fluidic devices provide an accessible micro-environment for in vivo studies on small organisms. Simple fabrication processes are ...

Biyomühendislik

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for the targeted expression of genetically encoded calcium sensors. This protocol outlines the use of these sensors for the in vivo imaging of calcium dynamics in targeted cells, specifically the body wall muscles of the worms. By utilizing the co-expression of presynaptic channelrhodopsin, stimulation of acetylcholine release from excitatory motor neurons can be induced using blue light pulses, resulting in muscle depolarization and reproducible changes in cytoplasmic calcium levels. Two worm immobilization techniques are discussed with varying levels of difficulty. Comparison of these techniques demonstrates that both approaches preserve the physiology of the neuromuscular junction and allow for the reproducible quantification of calcium transients. By pairing optogenetics and functional calcium imaging, changes in postsynaptic calcium handling and homeostasis can be evaluated in a variety of mutant backgrounds. Data presented validates both immobilization techniques and specifically examines the roles of the C. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase and the calcium-activated BK potassium channel in the body wall muscle calcium regulation.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

This method provides a way to couple optogenetics and genetically encoded calcium sensors to image baseline cytosolic calcium levels and changes in evoked calcium transients in the body wall muscles of the model organism C. elegans.

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Biyokimya

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging&#39;de elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Nörobilim

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure the activity of neurons during various behaviors. To correlate neural activity with behavior, the animal should not be immobilized but should be able to move. Many behavioral changes occur during long time scales and require recording over many hours of behavior. This also makes it necessary to culture the worms in the presence of food. How can worms be cultured and their neural activity imaged over long time scales? Agarose Microchamber Imaging (AMI) was previously developed to culture and observe small larvae and has now been adapted to study all life stages from early L1 until the adult stage of C. elegans. AMI can be performed on various life stages of C. elegans. Long-term calcium imaging is achieved without immobilizing the animals by using short externally triggered exposures combined with an electron multiplying charge-coupled device (EMCCD) camera recording. Zooming out or scanning can scale up this method to image up to 40 worms in parallel. Thus, a method is described to image behavior and neural activity over long time scales in all life stages of C. elegans.

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Imaging behavior and neural activity over long time scales without immobilization of the animal is a prerequisite to understand behavior. Agarose microfluidic chambers imaging (AMI) can be used to image neural activity and behavior for all life stages of Caenorhabditis elegans.

Uzun süreli Kalsiyum Görüntüleme için Agaroz microchambers<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Biyoloji

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the neurotransmitter glutamate, and the excessive stimulation of its postsynaptic receptors. However, information on the subsequent molecular events that culminate in the distinct neuronal swelling morphology of this type of neurodegeneration is lacking. Other aspects, such as changes in specific subcellular compartments, or the basis for the differential cellular vulnerability of distinct neuronal subtypes, remain under-explored. Furthermore, a range of factors that come into play in studies that use in vitro or ex vivo preparations might modify and distort the natural progression of this form of neurodegeneration. It is therefore important to study excitotoxic necrosis in live animals by monitoring the effects of interventions that regulate the extent of neuronal necrosis in the genetically amenable and transparent&#160;model system of the nematode Caenorhabditis elegans. This protocol describes methods of studying excitotoxic necrosis in C. elegans neurons, combining optical, genetic, and molecular analysis. To induce excitotoxic conditions in C. elegans, a&#160;knockout of a glutamate transporter gene (glt-3) is combined with a neuronal sensitizing genetic background (nuls5 [Pglr-1::G&#945;S(Q227L)]) to produce glutamate receptor hyperstimulation and neurodegeneration. Nomarski differential interference contrast (DIC), fluorescent, and confocal microscopy in live animals are methods used to quantify neurodegeneration, follow subcellular localization of fluorescently labeled proteins, and quantify mitochondrial morphology in the degenerating neurons. Neuronal Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) is used to distinctly sort at-risk neurons for cell-type specific transcriptomic analysis of neurodegeneration. A combination of live imaging and FACS methods as well as the benefits of the C. elegans model organism allow researchers to leverage this system to obtain reproducible data with a large sample size. Insights from these assays could translate to novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative diseases.

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In a C. elegans excitotoxicity model, this protocol employs in vivo imaging to analyze the regulation of necrotic neurodegeneration, the effect of genes encoding candidate mediators, and involvement of mitochondria. Cell dissociation and sorting is used to specifically obtain at-risk neurons for cell-specific transcriptomic analysis of neurodegeneration and neuroprotection mechanisms.

Excitotoxic necrosis is a leading form of neurodegeneration. This process of regulated necrosis is triggered by the synaptic accumulation of the ...

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed orientation. Here we describe methods to label, image, and analyze the microtubule dynamics and growth during the development and regeneration of touch neurons in C. elegans. Using genetically encoded fluorescent reporters of microtubule tips, we imaged the axonal microtubules. The local changes in microtubule behavior that initiates axon regeneration following axotomy can be quantified using this protocol. This assay is adaptable to other neurons and genetic backgrounds to investigate the regulation of microtubule dynamics in various cellular processes.

In vivo Assessment of Microtubule Dynamics and Orientation in Caenorhabditis elegans Neurons

A protocol for imaging the dynamic microtubules in vivo using fluorescently labeled End binding protein has been presented. We described the methods to label, image, and analyze the dynamic microtubules in the Posterior lateral microtubule (PLM) neuron of C. elegans.

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

In neurons, microtubule orientation has been a key assessor to identify axons that have plus-end out microtubules and dendrites that generally have mixed ...

Quantifying Levels of Dopaminergic Neuron Morphological Alteration and Degeneration in Caenorhabditis elegans

Dopamine neuron loss is involved in the pathology of Parkinson&#39;s Disease (PD), a highly prevalent neurodegenerative disorder affecting over 10 million people worldwide. Since many details about PD etiology remain unknown, studies investigating genetic and environmental contributors to PD are needed to discover methods of prevention, management, and treatment. Proper characterization of dopaminergic neuronal loss may be relevant not only to PD research, but to other increasingly prevalent neurodegenerative disorders.
There are established genetic and chemical models of dopaminergic neurodegeneration in the Caenorhabditis elegans model system, with easy visualization of neurobiology supported by the nematodes&#39; transparency and invariant neuronal architecture. In particular, hermaphroditic C. elegans&#39; dopaminergic neuron morphological changes can be visualized using strains with fluorescent reporters driven by cell-specific promotors such as the dat-1 dopamine transporter gene, which is expressed exclusively in their eight dopaminergic neurons.
With the capabilities of this model system and the appropriate technology, many laboratories have studied dopaminergic neurodegeneration. However, there is little consistency in the way the data is analyzed and much of the present literature uses binary scoring analyses that capture the presence of degeneration but not the full details of the progression of neuron loss. Here, we introduce a universal scoring system to assess morphological changes and degeneration in C. elegans&#39; cephalic neuron dendrites. This seven-point scale allows for analysis across a full range of dendrite morphology, ranging from healthy neurons to complete dendrite loss, and considering morphological details including kinks, branching, blebs, and breaks. With this scoring system, researchers can quantify subtle age-related changes as well as more dramatic chemical-induced changes. Finally, we provide a practice set of images with commentary that can be used to train, calibrate, and assess the scoring consistency of researchers new to this method. This should improve within- and between- laboratory consistency, increasing rigor and reproducibility.

Quantifying Levels of Dopaminergic Neuron Morphological Alteration and Degeneration in Caenorhabditis elegans

In this article, we showcase how to use a seven-point scoring system to consistently quantify changes to dopaminergic neuron dendrite morphology in C. elegans. This system is intended for analyses of dopaminergic neurodegeneration assays utilizing genetic, chemical, and age-based models of neurodegenerative disorders.

Caenorhabditis elegans'ta Dopaminerjik Nöron Morfolojik Değişim ve Dejenerasyon Seviyelerinin Ölçülmesi

Dopamine neuron loss is involved in the pathology of Parkinson&#39;s Disease (PD), a highly prevalent neurodegenerative disorder affecting over 10 million ...

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a crucial component of intracellular signaling. The visualization of subcellular Ca2+ dynamics in vivo,&#160;where neurons can be studied in their native, intact circuitry, has proven technically challenging in complex nervous systems. The transparency and relatively simple nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans enable the cell-specific expression and in vivo visualization of fluorescent tags and indicators. Among these are fluorescent indicators that have been modified for use in the cytoplasm as well as various subcellular compartments, such as the mitochondria. This protocol enables non-ratiometric Ca2+ imaging in vivo with a subcellular resolution that permits the analysis of Ca2+ dynamics down to the level of individual dendritic spines and mitochondria. Here, two available genetically encoded indicators with different Ca2+ affinities are used to demonstrate the use of this protocol for measuring relative Ca2+ levels within the cytoplasm or mitochondrial matrix in a single pair of excitatory interneurons (AVA). Together with the genetic manipulations and longitudinal observations possible in C. elegans, this imaging protocol may be useful for answering questions regarding how Ca2+ handling regulates neuronal function and plasticity.

Subcellular Imaging of Neuronal Calcium Handling In Vivo

The current methods describe a non-ratiometric approach for high-resolution, sub-compartmental calcium imaging in vivo in Caenorhabditis elegans using readily available genetically encoded calcium indicators.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Calcium (Ca2+) imaging has been largely used to examine neuronal activity, but it is becoming increasingly clear that subcellular Ca2+ handling is a ...

C. Dauer-spesifik nöronal Yaptırma Vivo Görüntülemede elegans

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Için basit Mikroakışkan Cihazlar

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

C. vivo Nöronal Kalsiyum Imaging'de elegans

Uzun süreli Kalsiyum Görüntüleme için Agaroz microchambers

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip

Live Animal Imaging and Cell Sorting Methods for Investigating Neurodegeneration in a C. elegans Excitotoxic Necrosis Model

In vivo Caenorhabditis elegans Nöronlarında Mikrotübül Dinamiklerinin ve Oryantasyonunun Değerlendirilmesi

Caenorhabditis elegans'ta Dopaminerjik Nöron Morfolojik Değişim ve Dejenerasyon Seviyelerinin Ölçülmesi

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi