يمكن لهذه الطريقة المساعدة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم المناعة ، مثل كيفية تنشيط خلايا الدم البيضاء ، وكيف تتطور الحساسية لحساسية المواد المسببة للحساسية الفردية؟ الميزة الرئيسية لهذا النموذج الماوس الحساسية قوية وقابلة للاستنساخ هو أنه يمكن استخدام عدد أقل من الفئران لتحقيق تباين أقل مع السكان التجريبية. تتطلب العلاجات المناعية الجديدة للتحكم في الاستجابات المناعية نماذج ماوس قوية كوسيلة أولية للاختبار في فعالية الجسم الحي.
وهكذا، تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية نحو العلاج المناعي الحساسية. على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في الحساسية، ويمكن أيضا أن تطبق على أنظمة أخرى، مثل autoimmunity التي الاستجابات الأجسام المضادة غير المرغوب فيها تلعب دورا رئيسيا في المرض. عموما، سوف الأفراد الجدد لهذا الأسلوب النضال بسبب نقص الخبرة في العمل مع الجسيمات النانوية الدهنية أو عدم الخبرة مع التقنيات المطلوبة في عمل الماوس.
تبدأ بإضافة 2.5 ما يعادل الضرس من الصلصال غيري وظيفية إلى البروتين ووضع رد فعل على شاكر متذبذب في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة تقريبا. بعد حضانة لمدة ساعة واحدة مع SPDP ، تم إزالة البروتين على عمود مُعد في خلات الصوديوم 100 ملليمولار ، وجمع الكسور. تحديد امتصاص 280 نانومتر، وتجمع الكسور العليا.
غسل العمود في برنامج تلفزيوني، وإضافة 25 ملليمولار dithiothreitol، أو DTT، إلى كسور البروتين المجمعة لمدة خمس إلى 10 دقائق الحضانة. ثم، قياس امتصاص 280 و 343 نانومتر من البروتين للسماح بحساب نسبة الربط على أساس الضرس من البروتين و linker. بعد ذلك، قم بتشغيل الكسور المجمعة من العمود المغسول بـ PBS، وقم بجمع الكسور لقياس تجمع الكسر 280-nanometer والكسر العلوي كما هو موضح.
أضف الحجم المناسب من 100x DSPE-PEG2000-Maleimide إلى البروتين لتحقيق 1x، 10 أضعاف التركيز النهائي المولر الزائد مع دوامة لطيف. ثم، تشغيل رد فعل بين عشية وضحاها تحت النيتروجين في قارورة مستديرة القاع مختومة. في اليوم التالي، قم بتشغيل البروتين فوق عمود حبة هلام ديكستران المترابطة، وتخزين الكسور النهائية المجمعة من البروتين المرتبط بالدهون عند أربع درجات مئوية حتى استخدامها.
مرة واحدة وقد تم حساب المبلغ الصحيح من كل الدهون، والجمع بين كل من الدهون في أنبوب اختبار الزجاج بوروسيليكات 12 ملليلتر، واستخدام حقنة ثلاثة ملليلتر وأنابيب لتفجير بعناية الكلوروفورم قبالة مع النيتروجين. ثم، lyophilize الحل مع 100 ميكرولترات من DMSO بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي، إضافة ملليلتر واحد من البروتين المرتبط بالدهون إلى أنبوب الدهون 12 ملليلتر، و sonicate الحل ثلاث إلى أربع مرات لمدة 30 إلى 60 ثانية لكل صوتنة في حمام الماء سونيكيشن مع ما لا يقل عن خمس دقائق تقع بين sonications.
بعد صوتنة الماضي، تحميل العينة في واحدة من الحقن البثق وضعت في الطارد، ووضع حقنة الطارد في الطرف الآخر من الطارد. سوف تملأ الحقنة الفارغة كما هو مقذوف الدهون من خلال غشاء البولي 0.8 ميكرومتر. وضع الطارد تجميعها بالكامل في كتلة التدفئة، والاكتئاب بلطف المكبس لإفراغ الحقنة.
بعد البثق الأخير، نقل liposomes في قارورة نظيفة، وبثق الدهون من خلال البولي 0.2 و 0.1 ميكرومتر الأغشية كما أظهرت للتو. ثم، تخزين liposomes في أربع درجات مئوية. لرصد استجابة الخلية ب لتنشيط ليبوسومات الهلوسة المضادة، resuspend 1.5 مرات 10 إلى الطحال السابع في تدفق الكالسيوم تحميل العازلة، وإضافة 1.5-ميكرومولار الهندو-1 إلى الخلايا، عكس الحل في الأنبوب عدة مرات لخلط.
بعد حضانة حمام مائي لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، محمية من الضوء، أضف خمسة أضعاف حجم احتياطي تحميل تدفق الكالسيوم، وطاردة مركزية الخلايا المسماة من الهند إلى 1. بالنسبة لخلية B، تصبغ الخلايا مع الأجسام المضادة CD5 و B220 المضادة في 0.5 ملليلتر من العازلة التحميل في أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة، وحمايتها من الضوء. في نهاية الحضانة، وغسل الخلايا في تدفق الكالسيوم الطازجة تحميل العازلة، وإعادة تعليق بيليه في واحد إلى مرتين 10 مرات إلى الخلايا السابعة لكل ملليلتر من تدفق الكالسيوم الطازجة تشغيل العازلة للتخزين على الجليد، وحمايتها من الضوء حتى التحليل.
بعد ذلك، أضف 0.5 ملليلتر من الخلايا إلى أنبوب متوج، خمسة ملليلتر، مستدير القاع، البوليسترين، وتدفئة الخلايا إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي. بعد ثلاث إلى خمس دقائق، قم بنقل الأنبوب إلى غرفة مُكلّفة بالماء بـ37 درجة مئوية متصلة بحمام مائي يعاد تدويره، ثم قم بتشغيل الأنبوب في سترة الماء على مقياس التدفق. بعد جمع 5، 000 إلى 10، 000 الأحداث في الثانية الواحدة، والسماح للخلايا لاستقرار لمدة 15 إلى 30 ثانية، وإعادة التهيئة الحصول على البيانات، وجمع البيانات لمدة 10 ثانية على الأقل لإنشاء قراءة خلفية.
عند علامة 10 ثوانٍ، قم بإزالة الأنبوب بسرعة من مقياس التدفق، وأضف التركيز التجريبي المناسب للليبوسومات الخافتة. ثم، نبض دوامة الخلايا، وقراءة الأنبوب على مقياس الخلايا لمدة ثلاث إلى خمس دقائق إضافية. لتوعية الحيوانات، وتقديم 200 ميكرولتر من مستخلص الفول السوداني التي تحتوي على سم الكوليرا عن طريق الزلاجة عن طريق الفم إلى كل أربعة إلى خمسة أسابيع من العمر BALB / c الإناث المتلقي الماوس مرة واحدة في الأسبوع لمدة ثلاثة أسابيع و 300 ميكرولترات من مستخلص الفول السوداني المخفف في الأسبوع الرابع.
في اليوم 28 ، قم بإعداد مستخلص الفول السوداني إلى تركيز نهائي قدره ملليغرام واحد لكل ملليلتر في PBS ، واستخدم ميزان حرارة المستقيم لقياس درجة حرارة الجسم الأساسية لكل تم تحسسه. عندما تم قياس جميع درجات الحرارة ، وإدارة 200 ميكرولترات من استخراج الفول السوداني لكل المتلقي عن طريق الحقن داخل الصفتون ، وقياس درجة حرارة الجسم مع ميزان الحرارة المستقيم كل 15 دقيقة لمدة ساعة واحدة بعد الحقن. انخفاض في درجة حرارة الجسم يشير إلى حساسية من الفول السوداني.
بعد عزل الطحال من الفئران ذات حساسية الفول السوداني ، استخدم حقنة الأنسولين ذات المليلتر الواحدة المجهزة بإبرة قياس 27 ، 5/8 بوصة لحقن عن طريق الوريد 1.5 مرة 10 إلى السابعة من الطحال التحسسية المستخرجة في عروق الذيل للحيوانات الساذجة وغير المُشعة. بعد يوم واحد من نقل بالتبني، حقن عن طريق الوريد 200 ميكرولترات من ليبوسومات مضادة للحساسية 2 آرا h في الوريد الذيل لكل فأر بالب / ج التي تلقت الطحال الحساسية. بعد أسبوعين من حقن الليبوسومات، قم بتعزيز الفئران بـ i.p.
حقن آرا القابل للذوبان ح 2، تليها 200 ميكرولتر آرا ح 2 التحدي في اليوم 61. ثم، قياس درجات حرارة الجسم مع مسبار المستقيم كل 15 دقيقة كما هو موضح. يمكن إثبات الاقتران البروتين من خلال تشغيل هلام تقليل تظهر زيادة في الوزن الجزيئي مقارنة مع البروتين غير المُعَد.
لتقييم تدفق الكالسيوم الدهني المُضاد على الدهون ب-الخلية B- محفز، قم بباب الخلايا المفردة الحية للسماح باختيار خلايا B-CD5-سالبة B الإيجابية B220. ويمكن بعد ذلك تحليل نسبة البنفسجي الهندي-1 مقابل الفلور الأزرق الهندو-1 مع مرور الوقت لتقييم كمية تنشيط الخلايا ب الناجمة عن الليبوسومات. يشير القياس الكمي لـ Ara h 2-specific IgE و IgG1 في مصل الفئران التي تتحسس استخراج الفول السوداني من قبل ELISA إلى أن الفئران ذات الحساسية الممنوحة التي يتم تعزيزها مع Ara h 2 Exhibit قابل للقياس Ara h 2-specific IgE و IgG1 في مصلهم.
درجات حرارة الجسم المسجلة خلال التحدي آرا ح 2 تكشف عن أن الفئران حساسية تظهر انخفاض درجات حرارة الجسم في أعقاب التحدي، في حين أن درجات حرارة الجسم في الفئران الساذجة لا تزال متسقة. أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر أن تتتبع بعناية كمية البروتين المرتبط بالدهون التي يتم دمجها في الدهون، حيث أن الكثير من البروتين يمكن أن يجعل البثق صعبًا. بعد هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تتبع وفرز الخلايا B و T الخاصة بالحساسية للإجابة على أسئلة إضافية حول كيفية استجابة هذه الخلايا المسببة للحساسية للعلاجات.
هذه التقنية سوف تمهد الطريق للباحثين في مجال الحساسية لاستكشاف العلاجات المناعية الجديدة التي تكافح مرض الحساسية باستخدام هذا النموذج الماوس. لا تنس أن العمل مع سموم الكوليرا يمكن أن يكون خطيراً وأن المبادئ التوجيهية لاستخدامه يجب أن تتبع وفقاً لمعايير السلامة البيولوجية المؤسسية المحلية.
