نشكر أعضاء المختبر Wobus للتعليقات والاقتراحات الهامة. وقد تم تمويل العمل في مختبر CEW من بدء الأموال من جامعة ميشيغان، منحة التطوير الوظيفي من مركز NIH / NIAID إقليمي للتميز في الدفاع والحيوية الناشئة بحوث الأمراض المعدية (RCE) برنامج، منطقة V &#39;العظمى البحيرات &#39;RCE (NIH 1-U54 جائزة-AI-057153) وNIH R01 AI080611. MBG-H. بتمويل من المناعة التجريبية (NIH T32 A1007413-16) والآليات الجزيئية الميكروبية في إمراض (NIH T32 A1007528) منح تدريبية لجامعة ميتشيغان. وقد تم تمويل JBC بواسطة دي دي Coordenação Aperfeiçoamento Pessoal فخمة NIVEL دي (CAPES)، برازيليا، البرازيل.

<ol>
	<li>Wobus, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+Norovirus+in+cell+culture+reveals+a+tropism+for+dendritic+cells+and+macrophages.">Replication of Norovirus in cell culture reveals a tropism for dendritic cells and macrophages.</a> PLoS Biol. 2, e432 (2004).</li><li>Wobus, C. E., Thackray, L. B., Virgin, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+norovirus:+a+model+system+to+study+norovirus+biology+and+pathogenesis.">Murine norovirus: a model system to study norovirus biology and pathogenesis.</a> Journal of virology. 80, 5104-5112 (2006).</li><li>Condit, R. C., Knipe, D. M., Howley, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+2.">Ch. 2.</a> Fields Virology. 1, 25-58 (2007).</li><li>Thackray, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+noroviruses+comprising+a+single+genogroup+exhibit+biological+diversity+despite+limited+sequence+divergence.">Murine noroviruses comprising a single genogroup exhibit biological diversity despite limited sequence divergence.</a> Journal of virology. 81, 10460-10473 (2007).</li><li>Reed, L. J., Muench, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+estimating+50%+endpoints.">A simple method for estimating 50% endpoints.</a> American Journal of Hygiene. 27, 493-497 (1932).</li><li>Chachu, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+is+critical+for+the+clearance+of+murine+norovirus+infection.">Antibody is critical for the clearance of murine norovirus infection.</a> Journal of virology. 82, 6610-6617 (2008).</li><li>Barron, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+of+murine+norovirus+strains+isolated+from+asymptomatic+mice+of+different+genetic+backgrounds+within+a+single+U.S.+research+institute.">Diversity of murine norovirus strains isolated from asymptomatic mice of different genetic backgrounds within a single U.S. research institute.</a> PLoS ONE. 6, e21435 (2011).</li><li>Cox, C., Cao, S., Lu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+detection+and+study+of+murine+norovirus-1+using+a+more+efficient+microglial+cell+line.">Enhanced detection and study of murine norovirus-1 using a more efficient microglial cell line.</a> Virology journal. 6, 196 (2009).</li><li>Cooper, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plaque+assay+of+animal+viruses.">The plaque assay of animal viruses.</a> Adv. Virus Res. 8, 319-378 (1961).</li><li>Hyde, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+norovirus+replication+is+associated+with+virus-induced+vesicle+clusters+originating+from+membranes+derived+from+the+secretory+pathway.">Mouse norovirus replication is associated with virus-induced vesicle clusters originating from membranes derived from the secretory pathway.</a> Journal of virology. 83, 9709-9719 (2009).</li><li>Simmonds, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatic+and+functional+analysis+of+RNA+secondary+structure+elements+among+different+genera+of+human+and+animal+caliciviruses.">Bioinformatic and functional analysis of RNA secondary structure elements among different genera of human and animal caliciviruses.</a> Nucleic acids research. 36, 2530-2546 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

طريقة الفحص لوحة MNV-1 المقدمة هنا هو وسيلة لقياس الجسيمات المعدية MNV. وذلك باتباع الخطوات الفحص موضح في الشكل 3، يمكن للمرء الحصول على التتر الفيروسية استنساخه. الحد من الكشف عن الفحص يعتمد على التخفيف بدءا المستخدمة. عندما بدءا من التخفيف من العينة 1:10 كما هو موضح أعلاه، والحد من الكشف عن لوحة الفحص هو 10 PFU (أي، 1 لوحة مرئية في التخفيف -1 10). لأن كل لوحة تمثل فيروس واحد، ويمكن أيضا أن الفحص البلاك تستخدم في تنقية السكان نسيلي من MNV عن طريق التقاط لوحات معزولة والترويج لها كما هو موضح سابقا 1. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم لوحة التنقيات لفصل السكان عن فيروس فرد من السكان الفيروس المختلط. وجود قيود من استخدام لوحة فحص للكشف عن الإصابة MNV هو أن ليس كل سلالات MNV تشكل لويحات 4. ومع ذلك، قد يكون من الممكن التغلب على inabiliTY بعض سلالات MNV، معزولة عن الحيوانات، لتشكل لويحات من الركض متسلسل هذه الفيروسات في زراعة الأنسجة 7. بديلا لوحة الفحص هو قياس الجسيمات المعدية عن طريق تقنية 50 TCID 3 و 4. هذا الاختبار الكمي كمية الفيروس اللازمة لإنتاج CPE في 50٪ من تلقيح خلايا الأنسجة بعد التخفيفات نقطة النهاية ويأخذ 1 أسبوع لإكمال لMNV 4. بالإضافة إلى كونه أبطأ من فحص اللوحة، وفحص 50 TCID هي أيضا ليست حساسة (حد الكشف = 200 TCID 50 / مل) نتيجة لسمية عينات الأنسجة إلى خلايا 264،7 RAW 4. على الرغم من أن وصفت الخطوات الحاسمة في إطار بروتوكول طوال البروتوكول، القسم التالي ملخصا لتسهيل حل المشاكل. الخطوة الأكثر أهمية في البروتوكول هو ضمان أن تبقى الخلايا RAW 264،7 قابلة للحياة في جميع أنحاء مقايسة لدعم تكاثر الفيروس. يمكن هذايمكن رصدها في كل مرحلة من مراحل الفحص عبر المجهر الضوئي. ويكفل بقاء الخلية بطريقتين. أولا، ينبغي الحرص على عدم السماح لتجف الخلايا أثناء التعامل مع لوحات. وهكذا، يتم تلقيح لوحات في وقت واحد، هز خلال الفترة العدوى، ويجب أن تبقى مغلقة كلما أنها لا يجري التعامل معها. ثانيا، ينبغي أن حلول أضاف على خلايا تكون معايرتها إلى ~ 37 ° C. وعلاوة على ذلك، من المهم جدا للمحافظة على الصحة العامة للخلايا 264،7 RAW للحفاظ عليها في وسائل الإعلام التي تحتوي على مصل منخفضة الذيفان الداخلي (&lt;10 EU / مل)، مما يحد من تفعيل الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، لاحظنا ارتفاع معدل فشل الفحص عند استخدام لوحة الخلايا من مرور 30 ​​أو أعلى. ورغم أن هذا سوف تختلف من مختبر إلى المرجح المختبر، من المهم أن تشمل السيطرة الايجابية (على سبيل المثال، مع عينة فيروسية المعروفة عيار) لضمان التتر استنساخه، خاصة عند استخدام الممر أعلى RAW 264،7 الخلايا. للحد من استخدام الخلايا أعلى المرور، فإنه من المستحسن أن تجميد قارورة من أوائل باساجنرال الكتريك الخلايا من الخلايا عند استلام 264،7 RAW وبدء ثقافة جديدة من قوارير المجمدة في كثير من الأحيان. والبدء من جديد مع مرور منخفض مزارع الخلايا يكون من المفيد أيضا عندما تظهر خصائص الخلايا تغييرها، مثل عدم الالتزام، والتغيرات في شكل الخلية (على سبيل المثال من جولة إلى طويل ضعيف وانتشرت)، أو عندما تم الكشف عن تلوث الميكوبلازما. نقطة أخرى المهم أن تولي اهتماما لهو التأكد من أن يتم تغيير نصائح ماصة بين العينات وخلال التخفيفات. وهذا يضمن التخفيفات المسلسل دقيقة ومنع انتقال التلوث بين العينات. خطوة واحدة في البروتوكول حيث يمكن استخدام غيض ماصة هو نفسه مرة أخرى عند إضافة التخفيفات المسلسل لنفس العينة من الآبار. في هذه الحالة، ينبغي للمرء أن يبدأ من اللقاح تضعف معظم لأقل، وماصة صعودا وهبوطا بقوة عند وضعه التخفيف جديدة. بروتوكول فحص اللوحة هي قابلة للتعديل لعدة تعديلات. واحد التي يمكن تعديلها إلا عندما رهنا لا يكفي لتحصين خلايا الآبار في تكرار لتطعيم فقط هو بئر واحد لكل التخفيف. ومع ذلك، منذ حجم اللقاح هو 0.5 مل، وعدد من اللوحات يحتاج بعد ذلك إلى أن تتضاعف بمعامل من 2 إلى PFU لتطبيع / مل. ويمكن أيضا الفحص وحة تكييفها للاستخدام مع أي خط الخلية تمسكا الأخرى التي هي قادرة على دعم تكرار MNV، ولقد وصفت هذه للخط دبقية الفئران BV-2 الخلية 8. التعديلات الأخرى التي يمكن تنفيذها هي التعديلات التي تم وصفها لبروتوكولات الفحص للبحث عن الفيروسات وضعت لوحة أخرى. في حالة MNV، وقد تم بالفعل إجراء التعديلات التالية نفذت بنجاح، واستخدام السليلوز الميثيل بدلا من البلاك البحر الاغاروز 9، وتلطيخ الخلايا مع البنفسجي الكريستال أو الميثيلين الأزرق بدلا من الأحمر محايدة 10 و 11. وعموما، يمكن بسهولة أن تتكيف هذا البروتوكول حسب الحاجة لقياس الأخرى المكونة للوحة الفيروسات أو استخدامها لأوراسكوم تليكوم القابضةإيه الفيروسات التي تسبب التهابات في الخلايا التحللي 264،7 RAW، مما يجعلها أداة مفيدة لقياس الجزيئات الفيروسية المعدية بشكل عام.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم كاشف </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td></tr><tr><td> DMEM / ارتفاع نسبة الجلوكوز </td><td> Hyclone </td><td> SH30243.02 </td></tr><tr><td> 2X MEM </td><td> Gibco </td><td> 11935 </td></tr><tr><td> 100X البنسلين والستربتوميسين </td><td> Hyclone </td><td> SV30010 </td></tr><tr><td> 10 ملي غير الأحماض الأمينية الأساسية </td><td> Hyclone </td><td> SH30238.01 </td></tr><tr><td> 1M HEPES </td><td> Hyclone </td><td> SH30237.01 </td></tr><tr><td> 200 ملي مول (100X) الجلوتامين L- </td><td> Hyclone </td><td> SH30034.01 </td></tr><tr><td> المصل البقري الجنين </td><td> Gibco، Hyclone </td><td> 10437، SH30070.02 </td></tr><tr><td> البحر البلاك الاغاروز </td><td> Lonza </td><td> 50100 </td></tr><tr><td> محايد الأحمر 0.33٪ </td><td> سيجما </td><td&gt; N2889 </td></tr><tr><td> 1X PBS </td><td> Gibco </td><td> 10010 </td></tr><tr><td> 1.0 ملم زركونيا / السيليكا الخرز </td><td> المنتجات BioSpec </td><td> 11079110z </td></tr><tr><td> الكرسي الهزاز نموذج سرعة 35 </td><td> Labnet </td><td> S2035 </td></tr><tr><td> ماجنا ايزر الصك </td><td> روش </td><td> 03358968001 </td></tr><tr><td> خط خلية الخام 264،7 </td><td> ATCC </td><td> TIB-71 </td></tr><tr><td> زراعة الأنسجة حاضنة </td><td> سانيو </td><td> MCO-18AIC </td></tr></tbody></table>

plaque assay for murine norovirus

نوروفيروس الفئران (MNV) هو العضو الوحيد من جنس نوروفيروس التي تنمو بكفاءة في مجال زراعة الأنسجة 1 و 2. تحلل الخلايا وتأثير الاعتلال الخلوي (CPE) لوحظ خلال MNV 1-العدوى من الخلايا الجذعية أو الفئران الضامة 1. ويمكن استخدام هذه الخاصية من MNV-1 لقياس عدد الجسيمات المعدية في عينة معينة عن طريق إجراء فحص لوحة 1. لوحة الفحص يعتمد على قدرة MNV-1 لليز الخلايا وتشكيل ثقوب في الخلايا متموجة أحادي الطبقة، والتي تسمى لويحات 3. ويمكن استخدام تقنيات متعددة للكشف عن العدوى الفيروسية في مجال زراعة الأنسجة، والأنسجة حصاد والسريرية، والعينات البيئية، ولكن ليس كل قياس عدد جزيئات معدية. (على سبيل المثال QRT-PCR) طريقة واحدة لقياس الجزيئات الفيروسية المعدية هو إجراء فحص لوحة 3 التي سيتم وصفها في التفاصيل أدناه. الاختلاف على فحص لوحة MNV هو فلوريescent مقايسة التركيز، حيث يتم immunostained MNV مستضد في الخلية monolayers 4. يمكن هذا الفحص يكون أسرع، لأن التعبير مستضد الفيروسية تسبق تشكيل اللوحة. ومن المفيد أيضا للفيروسات قادر المعايرة لتشكل لويحات. ومع ذلك، فإن الفحص يتطلب التركيز الفلورسنت موارد إضافية تتجاوز تلك من مقايسة لوحة، مثل الأجسام المضادة والمجهر لحساب التركيز تشكيل وحدة. ويمكن أيضا أن MNV المعدية عن طريق تحديد كمية زراعة الأنسجة 50٪ الجرعة المعدية (TCID 50) 3. هذا الاختبار يقيس كمية الفيروس اللازمة لإنتاج CPE في 50٪ من تلقيح خلايا الأنسجة عن طريق المعايرة نقطة النهاية 5. ومع ذلك، الحد الأقصى للكشف هو أعلى بالمقارنة مع لوحة 4 مقايسة. في هذه المقالة، ونحن تصف بروتوكول فحص اللوحة التي يمكن استخدامها بشكل فعال لتحديد عدد الجسيمات الموجودة في MNV المعدية العينات البيولوجية أو البيئية 1 و 4 و 6. هذا الأسلوب هو على درجة البكالوريوسالحوار الاقتصادى الاستراتيجى على اعداد من 10 أضعاف التخفيفات مسلسل المحتوية على عينات MNV، والتي تستخدم لتطعيم أحادي الطبقة من الخلايا الإباحية (RAW 264،7 خلايا البلاعم الفئران). يسمح الفيروس لإرفاق أحادي الطبقة الخلية لفترة معينة من الزمن ومن ثم يستنشق قبل تغطي الخلايا بمزيج من الاغاروز وسائل الإعلام والثقافة الخلية. وأجار تمكن من انتشار سلالة الفيروسية للخلايا المجاورة بينما تحد من انتشاره إلى الخلايا تقع بعيدة. وبناء على ذلك، فإن الخلايا المصابة هي lysed والثقوب النموذج في أحادي الطبقة المعروفة باسم لويحات. على انتشار فيروس كافية من لويحات تصبح مرئية تلطيخ التالية من الخلايا مع الأصباغ، مثل الأحمر محايدة، زرقة الميثيلين، أو البنفسجي الكريستال. في التخفيفات المنخفضة، كل لوحة تنبع من الجسيمات الفيروسية المعدية 1 وآله، والتي امتدت إلى الخلايا المجاورة. وهكذا، عد عدد من اللوحات يسمح احد لحساب البلاك تشكيل وحدات (PFU) الموجودة في العينة غير مخفف 3.

Watch this Scientific Journal Video about Plaque Assay for Murine Norovirus at JoVE.com

Plaque Assay for Murine Norovirus

نحن هنا وصف طريقة لتحديد جزيئات معدية من نوروفيروس الفئران (MNV)، والذي هو الوحيد الذي يعيد نوروفيروس بكفاءة في الثقافة الخلية. الفحص وحة يستفيد من tropism MNV لالضامة الفئران ويمكن تكييفها للاستخدام مع العينات البيولوجية أو البيئية التي تحتوي على MNV.

الفحص وحة لنوروفيروس الفئران

Murine norovirus (MNV) is the only member of the Norovirus genus that efficiently grows in tissue culture 1, 2. Cell lysis and cytopathic effect (CPE) are ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

54.1K Views.  University of Michigan, Ann Arbor. نحن هنا وصف طريقة لتحديد جزيئات معدية من نوروفيروس الفئران (MNV)، والذي هو الوحيد الذي يعيد نوروفيروس بكفاءة في الثقافة الخلية. الفحص وحة يستفيد من tropism MNV لالضامة الفئران ويمكن تكييفها للاستخدام مع العينات البيولوجية أو البيئية التي تحتوي على MNV.

Video: Plaque Assay for Murine Norovirus

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

الفئران نموذج تفعيل CD40 - B من الخلايا

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

تحليل التدفق الخلوي للخلايا المناعية وفي الفئران Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close person-to-person contact cannot be avoided 1, 2. During the last few years an increase in the incidence of outbreaks in hospitals has been reported, causing significant disruptions to their operational capacity as well as large economic losses. The identification of new antiviral approaches has been limited due to the inability of human noroviruses to complete a productive infection in cell culture 3. The recent isolation of a murine norovirus (MNV), closely related to human norovirus 4 but which can be propagated in cells 5 has opened new avenues for the investigation of these pathogens 6, 7. 
MNV replication results in the synthesis of new positive sense genomic and subgenomic RNA molecules, the latter of which corresponds to the last third of the viral genome (Figure 1). MNV contains four different open reading frames (ORFs), of which ORF1 occupies most of the genome and encodes seven non-structural proteins (NS1-7) released from a polyprotein precursor. ORF2 and ORF3 are contained within the subgenomic RNA region and encode the capsid proteins (VP1 and VP2, respectively) (Figure 1). Recently, we have identified that additional ORF4 overlapping ORF2 but in a different reading frame is functional and encodes for a mitochondrial localised virulence factor (VF1) 8.
Replication for positive sense RNA viruses, including noroviruses, takes place in the cytoplasm resulting in the synthesis of new uncapped RNA genomes. To promote viral translation, viruses exploit different strategies aimed at recruiting the cellular protein synthesis machinery 9-11. Interestingly, norovirus translation is driven by the multifunctional viral protein-primer VPg covalently linked to the 5' end of both genomic and subgenomic RNAs 12-14. This sophisticated mechanism of translation is likely to be a major factor in the limited efficiency of viral recovery by conventional reverse genetics approaches. 
Here we report two different strategies based on the generation of murine norovirus-1 (referred to as MNV herewith) transcripts capped at the 5' end. One of the methods involves both in vitro synthesis and capping of viral RNA, whereas the second approach entails the transcription of MNV cDNA in cells expressing T7 RNA polymerase. The availability of these reverse genetics systems for the study of MNV and a small animal model has provided an unprecedented ability to dissect the role of viral sequences in replication and pathogenesis 15-17.

Noroviruses are a major cause of gastroenteritis yet molecular techniques for their characterisation are still relatively new. Here we report two different reverse genetics approaches for the efficient recovery of murine norovirus (MNV), the only member of this genus which can be propagated in cell culture.

علم الوراثة العكسية الاسترداد بوساطة من نوروفيروس الفئران المعدية

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Isolation, Identification, and Purification of Murine Thymic Epithelial Cells

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple stages of T cell development: T cell commitment, positive selection and negative selection. However, the function of TECs in the thymus remains incompletely understood. In the article, we provide a method to isolate TEC subsets from fresh mouse thymus using a combination of mechanical disruption and enzymatic digestion. The method allows thymic stromal cells and thymocytes to be efficiently released from cell-cell and cell-extracellular matrix connections and to form a single-cell suspension. Using the isolated cells, multiparameter flow cytometry can be applied to identification and characterization of TECs and dendritic cells. Because TECs are a rare cell population in the thymus, we also describe an effective way to enrich and purify TECs by depleting thymocytes, the most abundant cell type in the thymus. Following the enrichment, cell sorting time can be decreased so that loss of cell viability can be minimized during purification of TECs. Purified cells are suitable for various downstream analyses like Real Time-PCR, Western blot and gene expression profiling. The protocol will promote research of TEC function and as well as the development of in vitro T cell reconstitution.

Here we describe an efficient method for isolation, identification, and purification of mouse thymic epithelial cells (TECs). The protocol can be utilized for studies of thymus function for normal T cell development, thymus dysfunction, and T cell reconstitution.

العزلة، تحديد الهوية، وتنقية خلايا الفئران التوتة طلائي

The thymus is a vital organ for T lymphocyte development. Of thymic stromal cells, thymic epithelial cells (TECs) are particularly crucial at multiple ...

Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of discrete plaques (infectious units and cellular dead zones) in cell culture. Here we demonstrate how to perform a basic plaque assay, and how differing overlays and techniques can affect plaque formation and production. Typically solid or semisolid overlay substrates, such as agarose or carboxymethyl cellulose, have been used to restrict viral spread, preventing indiscriminate infection through the liquid growth medium. Immobilized overlays restrict cellular infection to the immediately surrounding monolayer, allowing the formation of discrete countable foci and subsequent plaque formation. To overcome the difficulties inherent in using traditional overlays, a novel liquid overlay utilizing microcrystalline cellulose and carboxymethyl cellulose sodium has been increasingly used as a replacement in the standard plaque assay. Liquid overlay plaque assays can be readily performed in either standard 6 or 12 well plate formats as per traditional techniques and require no special equipment. Due to its liquid state and subsequent ease of application and removal, microculture plate formats may alternatively be utilized as a rapid, accurate and high throughput alternative to larger scale viral titrations. Use of a non heated viscous liquid polymer offers the opportunity to streamline work, conserves reagents, incubator space, and increases operational safety when used in traditional or high containment labs as no reagent heating or glassware are required. Liquid overlays may also prove more sensitive than traditional&#160;overlays for certain heat labile viruses.

Plaque assays are the gold standard for viral quantification, utilizing entrapping overlays on host cellular monolayers to determine viral titers. While various semisolid overlays have traditionally been used, here we demonstrate plaque techniques comparing semisolid overlays to a novel liquid microcrystalline cellulose among several families of viruses.

تحديد تركيز الفيروسي من خلال البلاك فحوصات: نظم تراكب عن طريق التقليدية والرواية

Plaque assays remain one of the most accurate methods for the direct quantification of infectious virons and antiviral substances through the counting of ...

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of 10 - 30% of adults. In immune-compromised individuals, including neonates, pregnant women, and the elderly, GBS may switch to an invasive pathogen causing sepsis, arthritis, pneumonia, and meningitis. Because GBS is a leading bacterial pathogen of neonates, current prophylaxis is comprised of late gestation screening for GBS vaginal colonization and subsequent peripartum antibiotic treatment of GBS-positive mothers. Heavy GBS vaginal burden is a risk factor for both neonatal disease and colonization. Unfortunately, little is known about the host and bacterial factors that promote or permit GBS vaginal colonization. This protocol describes a technique for establishing persistent GBS vaginal colonization using a single &#946;-estradiol pre-treatment and daily sampling to determine bacterial load. It further details methods to administer additional therapies or reagents of interest and to collect vaginal lavage fluid and reproductive tract tissues. This mouse model will further the understanding of the GBS-host interaction within the vaginal environment, which will lead to potential therapeutic targets to control maternal vaginal colonization during pregnancy and to prevent transmission to the vulnerable newborn. It will also be of interest to increase our understanding of general bacterial-host interactions in the female vaginal tract.

A Murine Model of Group B Streptococcus Vaginal Colonization

The purpose of this protocol is to imitate human group B Streptococcus (GBS) vaginal colonization in a murine model. This method may be used to investigate host immune responses and bacterial factors contributing to GBS vaginal persistence, as well as to test therapeutic strategies.

نموذج الفئران من المجموعة الثانية<em&gt; العقدية</em&gt; المهبلية الاستعمار

Streptococcus agalactiae (group B Streptococcus, GBS), is a Gram-positive, asymptomatic colonizer of the human gastrointestinal tract and vaginal tract of ...

Swab Sampling Method for the Detection of Human Norovirus on Surfaces

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the person-to-person route or indirectly through environmental surfaces or food, contaminated fomites and inanimate surfaces are important vehicles for the spread of the virus during norovirus outbreaks.
We developed and evaluated a protocol using macrofoam swabs for the detection and typing of human noroviruses from hard surfaces. Compared with fiber-tipped swabs or antistatic wipes, macrofoam swabs allow virus recovery (range 1.2-33.6%) from toilet seat surfaces of up to 700 cm2. The protocol includes steps for the extraction of the virus from the swabs and further concentration of the viral RNA using spin columns. In total, 127 (58.5%) of 217 swab samples that had been collected from surfaces in cruise ships and long-term care facilities where norovirus gastroenteritis had been reported tested positive for GII norovirus by RT-qPCR. Of these 29 (22.8%) could be successfully genotyped. In conclusion, detection of norovirus on environmental surfaces using the protocol we developed may assist in determining the level of environmental contamination during outbreaks as well as detection of virus when clinical samples are not available; it may also facilitate monitoring of effectiveness of remediation strategies.

A macrofoam based sampling methodology was developed and evaluated for the detection and quantification of norovirus on environmental hard surfaces.

مسحة طريقة أخذ العينات للكشف عن نوروفيروس الإنسان على السطوح

Human noroviruses are a leading cause of epidemic and sporadic gastroenteritis worldwide. Because most infections are either spread directly via the ...

Bronchoalveolar Lavage of Murine Lungs to Analyze Inflammatory Cell Infiltration

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain insight into an ongoing disease state.
Here, a simple and efficient method is described to perform BAL on murine lungs without the need of special tools or equipment. BAL fluid is isolated by inserting a catheter in the trachea of terminally anesthetized mice, through which a saline solution is instilled into the bronchioles. The instilled fluid is gently retracted to maximize BAL fluid retrieval and to minimize shearing forces. This technique allows the viability, function, and structure of cells within the airways and BAL fluid to be preserved.
Numerous techniques may be applied to gain further understanding of the disease state of the lung. Here, a commonly used technique for the identification and enumeration of different types of immune cells is described, where&#160;flow cytometry is combined with a select panel of fluorescently labeled cell surface-specific markers. The BAL procedure presented here can also be used to analyze infectious agents, fluid constituents, or inhaled particles within murine lungs.

The health status of the lung is reflected by the type and number of immune cells that are present in the bronchioles of the lung. We describe a bronchoalveolar lavage technique that allows the isolation and study of nonadherent cells and soluble factors from the lower respiratory tract of mice.

القصبات الغسل من الفئران الرئتين لتحليل التهاب تسلل خلية

Bronchoalveolar Lavage (BAL) is an experimental procedure that is used to examine the cellular and acellular content of the lung lumen ex vivo to gain ...

Preparation of Murine Submandibular Salivary Gland for Upright Intravital Microscopy

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, including cell biology, oncology, dentistry, and immunology. The SMG is an exocrine gland comprised of secretory epithelial cells, myofibroblasts, endothelial cells, nerves, and extracellular matrix. Dynamic cellular processes in the rat and mouse SMG have previously been imaged, mostly using inverted multi-photon microscope systems. Here, we describe a straightforward protocol for the surgical preparation and stabilization of the murine SMG in anesthetized mice for in vivo imaging with upright multi-photon microscope systems. We present representative intravital image sets of endogenous and adoptively transferred fluorescent cells, including the labeling of blood vessels or salivary ducts and second harmonic generation to visualize fibrillar collagen. In sum, our protocol allows for surgical preparation of mouse salivary glands in upright microscopy systems, which are commonly used for intravital imaging in the field of immunology.

We describe a protocol to surgically expose and stabilize the murine submandibular salivary gland for intravital imaging using upright intravital microscopy. This protocol is easily adaptable to other exocrine glands of the head and neck region of mice and other small rodents.

إعداد موريني الغدة اللعابية اللهاة تستقيم مجهرية إينترافيتال

The submandibular salivary gland (SMG) is one of the three major salivary glands, and is of interest for many different fields of biological research, ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;