يساعد البروتوكول الطلاب على تحديد العدوى الفردية بوضوح وإجراء الفحص بسهولة ، مما يجعله أكثر كفاءة لتحديد العيار الفيروسي. يتضمن هذا البروتوكول إجراء تثبيت وتلطيخ بسيط ينتج عنه نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على دقة وفعالية العلاجات المضادة للفيروسات ضد الأمراض.
العقبات الأكثر صعوبة في بروتوكول الترقيم هذا هي عدد الخلايا لألواح البذر ، مع التأكد من أن الخلايا لا تكتظ أو تجف أو تتعرض للخدش طوال العملية. وقد يجد المرء أيضا صعوبة في الطبيعة الدقيقة العامة لهذا البروتوكول. ومع ذلك ، فإن الممارسة هي مساهم رئيسي في نجاح هذه التجربة.
للبدء ، أكمل تخفيف العينة في إضافة الفيروس إلى الخلايا في جلسة مختبر واحدة. تمييع كل عينة فيروس يتم تجميعها في PBS بشكل متسلسل. عادة ما تستخدم تخفيفات 10 أضعاف للتتبع الأكثر دقة.
احتفظ بجميع التخفيفات الفيروسية على الجليد حتى تصبح جاهزة لإضافة عينات الفيروسات المخففة هذه إلى الخلايا. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا من بئر أو بئرين باستخدام ماصة. أضف بعناية عينة الفيروس المخفف قطرة إلى كل طبقة أحادية من الخلايا بقطرة من خلال جانب كل بئر.
كرر العملية لكل بئر أو بئرين حتى تمتلئ اللوحة بأكملها بعينات الفيروس التي يتم لوحاتها. هز بلطف اللوحة بأكملها باليد. ثم احتضن اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح بامتزاز الفيروس.
بعد كل 10 دقائق ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة ، وهزها بلطف مرة أخرى لنشر الفيروس بالتساوي عبر كل بئر ، ثم ضعه مرة أخرى في الحاضنة. لتقليل إمكانية حساب اللقاح غير الممتص عن غير قصد ، قم بإزالة عينة الفيروس من الآبار باستخدام طرف ماصة سعة 1000 ميكرولتر وتخلص من العينة في كوب نفايات. ضع 2.5 ملليلتر من تراكب ميثيل سليلوز على اللوحة ، وضعه مرة أخرى في الحاضنة.
قم بتطهير كوب النفايات، عادة مع إضافة المبيض أو اليودوفور أو فيروسيد مماثل، قبل إزالته من خزانة السلامة الأحيائية. بعد الحضانة لمدة يومين ، قم بإزالة تراكب ميثيل سليلوز من بئر أو بئرين في وقت واحد باستخدام ماصة ، وضعه في وعاء نفايات. أضف ما يقرب من ملليلترين من 1٪ من البنفسج البلوري في 50٪ من الإيثانول إلى كل بئر.
احتضن الطبق مع جميع الآبار المملوءة بالبقعة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. في هذه المرحلة ، قم بتطهير كأس النفايات كما هو موضح سابقا. اغسل الأطباق بقوة بماء الصنبور حتى يصبح الجريان السطحي واضحا.
تأكد من وجود اختلافات تقارب 10 أضعاف في عدد اللويحات عبر كل سلسلة تخفيف. يصور الشكل انخفاضا بمقدار 10 أضعاف في عدد اللويحات حيث انخفض العدد القابل للعد من اللويحات في نطاق 10 إلى ناقص أربعة لجميع النسخ المتماثلة الثلاثة. الصور الثلاث الأولى في الشكل تصور لوحات في 10 إلى ناقص ثلاثة تخفيف.
ومع ذلك ، يعرض الصف السفلي النتائج عندما لا يتم إجراء فحص البلاك بشكل جيد. هناك عدد قليل جدا من اللويحات المرئية من أي تخفيف في المناطق المرئية حول الجزء العلوي حيث رفعت خلايا Vero بالكامل من الركيزة. وبالمثل ، يوضح هذا الشكل مشاكل في جفاف الخلايا أو سوء التعامل معها أثناء فحص اللويحات.
ومع ذلك ، فإن هذا الرقم يظهر بشكل نقدي ضعف بذر خلايا فيرو. يظهر كل بئر بقع أرجوانية داكنة ، مما يدل على أن الخلايا لا تنتشر بشكل جيد عبر البئر وتتراكم فوق بعضها البعض في مجموعات. للحصول على أفضل النتائج ، تأكد من انتشار الفيروس بشكل موحد عبر اللوحة لتجنب تكتل اللويحات تعتبر اختبارات اللويحات أكثر فعالية من الطرق الكمية الأخرى لأنها تحسب فقط الفيروس الحي.
وبهذه الطريقة، يمكن إثبات فعالية حقيقية مضادة للفيروسات. بالإضافة إلى ذلك ، سمحت لنا هذه التقنية بتحديد الوجود الفيروسي على البؤر واستكشاف فعالية توصيل الأدوية من الأجهزة الطبية الجديدة في قطاعنا لأبحاث فيروس الهربس.
