يقدم بروتوكولنا أداة محسنة لدراسة قلب سمك الحمار الوحشي في الجسم الحي ويصف تقنيات شل الحركة جنبا إلى جنب مع خط أنابيب الحصول على البيانات وتحليلها للتصوير القلبي. حمار وحشي هو نظام نموذج القلب مع إمكانات كبيرة لتطبيقات مثل شاشة المخدرات. البروتوكول الذي يتيح التصوير اللطيف في ظل الظروف الفسيولوجية أمر بالغ الأهمية عند دراسة أمراض القلب.
يركز سير العمل المعروض هنا على تصوير القلب الجنيني لسمك الحمار الوحشي ، ولكن يمكن تطبيق نسخة معدلة على عينات وتجارب أخرى مختلفة ، بما في ذلك الحبار والدودة والهيدرا. ابدأ بجمع الأجنة التي تم الحصول عليها من تربية الخطوط المعدلة وراثيا المطلوبة. الحفاظ على الأجنة في 28 درجة مئوية في طبق بيتري مليئة E3 متوسطة السمك.
استخدام إبرة زجاجية تحمل محمولة على micromanipulator ومتصلة حاقن بيكو لحقن 30 picograms من ألفا bungarotoxin مرنا في صفار واحد أو اثنين من الأجنة مرحلة الخلية لشل حركة الأسماك. احتفظ بالبيض عند 28 درجة مئوية في طبق بيتري مملوء ب E3 medium، ونقل البيض كل 24 ساعة إلى طبق جديد يحتوي على متوسط E3 طازج حتى التصوير. لمنع تكوين الصباغ، إذا كانت خلفية حمار وحشي ليست ألبينو، نقل الأسماك في 25 ساعة بعد الإخصاب إلى طبق جديد يحتوي على E3 المتوسطة مع 0.2 ملليمول التيروزيناسي مثبط 1-فينيل 2-ثيويريا، المعروف أيضا باسم PTU.
لتصويب أنبوب بروبيلين الإيثيلين المفلور ضع الأنبوب في أنابيب آمنة من الزجاج أو الصلب مع القطر الداخلي الصحيح لتناسب أنابيب البوليمر والتوكلاف عند 180 درجة مئوية لمدة ساعتين. بمجرد وصول الأنابيب إلى درجة حرارة الغرفة، قم بإزالة أنبوب البوليمر المستقيم. لتنظيف الأنبوب، استخدم حقنة 50 ملليمترا لغسل الأنبوب مرتين مع ضرس واحد من هيدروكسيد الصوديوم.
قطع الأنبوب إلى حجم أنبوب الطرد المركزي 50 ملليلتر، ضع في أنبوب الطرد المركزي مليئة 0.5 الضرس من هيدروكسيد الصوديوم والموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق. قم بغسل أنبوب بروبيلين الإيثيلين المفلور بالماء المقطر المزدوج، يليه الإيثانول بنسبة 70٪. أنابيب نقل أنبوب الطرد المركزي الطازجة الواردة 70٪ الإيثانول و ultrasonicate لمدة 10 دقائق.
بعد ultrasonication، دافق أنبوب للمرة الأخيرة مع الماء المقطر مزدوجة، وتخزينها في أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على الماء المقطر مزدوجة. بعد حل agarose نقطة انصهار منخفضة في E3 المتوسطة صب agarose الذائبة في طبق بيتري الزجاج أو البلاستيك لجعل معطف 1-2 ملليمتر. بمجرد أن يتم ترسيخ الآغروز ، صب بلطف المتوسط E3 على رأس أجار لمنع التجفيف.
ختم لوحة مع فيلم البارافين وتخزينها في أربع درجات مئوية. إذابة حل الأسهم من tricaine وإضافة 0.02٪ tricaine إلى المتوسط E3 دون الميثيل الأزرق لاستخدامها كوسيط تضمين. استخدام ماصة الزجاج المتاح لنقل الأسماك إلى وسيط تضمين.
تحقق من أن الأسماك قد توقفت عن الحركة والقلب ينبض بسرعة مماثلة بالمقارنة مع السيطرة. قطع أنبوب بروبيلين الإيثيلين المفلور إلى الطول المثالي مع شفرة حلاقة. إعداد حقنة مع قنية نهاية حادة.
ملء الحقنة بالهواء، ثم جبل الأنبوب على الإبرة وطرد بلطف من أي المياه المتبقية عن طريق إفراغ الحقنة. بعد ذلك، ملء أنبوب بروبيلين الإيثيلين المفلورة التي شنت على حقنة مع وسائل الإعلام. أدخل جنينا في الأنبوب، مع إبقاء رأس السمكة قريبا من نهاية الأنبوب، وتجنب تكوين الفقاعات.
باستخدام شفرة حلاقة، وقطع بعناية أنبوب على حافة قنية نهاية حادة، أو إبرة. بعد التخلص من أي سائل على الجزء العلوي من طبق أجار المغلفة، يغرق الأنبوب مباشرة في أجار. تدوير الأنبوب وأخذه إلى الخروج للافراج عن المكونات من سرير agarose.
تحقق من وجود المكونات أجار في نهاية الأنبوب. للتصوير على المدى الطويل، وقطع ثلاثة إلى خمسة ثقوب في الأنبوب في كل اتجاه الكاردينال، ما لا يقل عن خمسة ملليمترات فوق نهاية السمك عن طريق وضع شفرة حلاقة عمودي على محور الأنبوب وإجراء شق في أنبوب في 30 درجة حتى الوصول إلى وسائل الإعلام المتصاعدة. ثم، وجعل شق الثاني في 180 درجة لخلق حفرة ولفة الأنبوب لتصور التخفيضات بوضوح.
نقل الجنين المركب إلى أنبوب 1.5 ملليلتر من جهاز الطرد المركزي الدقيق الذي يحتوي على وسائط تضمين حتى يصبح جاهزا للصورة. قم بتركيب الأنبوب في حامل العينة وملأ غرفة التصوير بوسائط مضمنة. ضع حامل العينة على المسرح مع العينة التي تغمس في الغرفة.
تحقق من صحة الأسماك المضمنة عن طريق تقييم معدل ضربات القلب بصريا، وإذا كان نبض القلب بطيئا جدا تجاهل العينة. دائما استخدام نفس الموضع عينة للتصوير استنساخها وتدوير الأسماك بحيث كلتا العينين في المستوى البؤري. ثم، تدوير الأسماك ما يقرب من 20 إلى 30 درجة عكس عقارب الساعة لمدة 48 ساعة بعد التصوير الإخصاب.
عندما تتكيف الأسماك مع قوة الليزر، حدد جانب الإضاءة الذي يعطي أفضل جودة للصورة. في كل طائرة Z، سجل أربع إلى خمس دقات قلب بمعدل 300 إطار في الثانية، أو أكثر. لتسجيل القلب النابض تحريك العينة خطوة بخطوة من خلال ورقة الضوء واستخدام تباعد Z من 1 إلى 2 ميكرومتر لتغطية عمق القلب بأكمله.
تحميل الملف 4D في برنامج تقديم 3D لاستكشاف البيانات وتوليد أفلام من قلب حمار وحشي المقدمة. في 48 ساعة بعد الإخصاب خضع القلب للتو حلقات ولها غرفتين، البطين والأذين، ولكن لم تتطور الصمامات. هياكل القلب المختلفة مثل البطين، قناة البطين، الأذين، المسالك التدفق، وتدفق يمكن تمييزها بسهولة.
وأشارت البيانات إلى النبض الدقيق وكشفت عن تفاعلات معقدة بين طبقتي خلايا القلب، عضلة القلب، وطبقة عضلة خلية واحدة تتقلص وقوة توليد، والتشغاف، وهي طبقة خلية واحدة تربط القلب ب الأوعية الدموية. الأهم هو التحقق دائما من صحة العينة ودقات القلب متسقة تحت مجسمة. في حين أن التقنيات التقليدية غالبا ما تؤثر على شكل القلب أو وظيفته، فإن أساليبنا تقدم لنا بيانات ديناميكية غير مضطربة للقلب النابض تساعدنا على فهم أساسيات القلب الجنيني المبكر.
