يسمح لنا ATAC-seq بتحديد حالة مناطق الكروماتين المفتوحة في الجينوم ، والتي غالبا ما تتغير في حالات المرض مقارنة بالحالة الطبيعية. إدخال عدد أقل من الخلايا ، بروتوكول مبسط لهضم Tn5 ، يليه عزل الحمض النووي المجزأ وإعداد المكتبة عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ووقت تجريبي أقصر يجعلها تقنية أكثر فائدة. يمكن أن تلقي مقارنة المشهد اللاجيني المتغير بواسطة ATAC-seq بين الحالات الطبيعية والمرضية الضوء على العناصر التنظيمية للكروماتين المرتبطة بالمرض وتكون مفيدة لتصميم استراتيجيات علاجية جديدة.
هذه التقنية سهلة التنفيذ ، لأنها لا تتضمن أي خطوات تجريبية حرجة. للحصول على نتائج ATAC-seq ناجحة ، لا يتطلب الأمر سوى خطوتين من خطوات التوحيد. للبدء ، انقل 25 ميكرولترا من معلق خلوي يحتوي على مليون خلية لكل ملليلتر في PBS إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.7 ملليلتر وأجهزة طرد مركزي عند 500 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
تخلص بعناية من المادة الطافية ، وأضف 25 ميكرولتر من محلول التحلل. أعد تعليق الخلايا عن طريق السحب برفق لأعلى ولأسفل ، واحتضانها على الثلج لمدة خمس دقائق. جهاز طرد مركزي عند 500 جم لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية ، وتخلص بعناية من المادة الطافية.
أعد تعليق الحبيبات على الفور في 25 ميكرولتر من خليط تفاعل Tn5 ، واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. امزج المحلول كل 10 دقائق. أضف خمسة ميكرولترات من أسيتات الصوديوم 3 مولار و 125 ميكرولتر من العازلة PB إلى محلول الحمض النووي الموسوم Tn5.
تخلط جيدا. بعد ذلك ، ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع سعة 2 ملليلتر ، وقم بتطبيق العينة على عمود الدوران. جهاز طرد مركزي عند 17،900 جم لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من التدفق.
أضف المخزن المؤقت PE إلى العمود ، وقم بتدوير العمود. ضع عمود الدوران مرة أخرى في نفس أنبوب التجميع ، وقم بالطرد المركزي لمدة خمس دقائق لتجفيف الغشاء تماما. تخلص من التدفق ، وضع عمود الدوران في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.7 ملليلتر.
قم بإخراج شظايا الحمض النووي باستخدام 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت EB ، واترك العمود يقف لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم أجهزة الطرد المركزي في 17،900 G لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة لاستخلاص الحمض النووي. قم بإعداد تفاعل PCR في أنابيب PCR سعة 200 ميكرولتر ، وقم بإجراء الجزء الأول من برنامج تضخيم PCR.
للحصول على QPCR في الوقت الفعلي ، قم بإعداد خليط تفاعل PCR بإضافة خمسة ميكرولتر من منتج PCR ، و 0.75 ميكرولتر من 1،000 مرة من SYBR Gold المخفف ، وخمسة ميكرولتر من 2X PCR Master Mix و 3.75 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز. حدد العدد المطلوب من دورات PCR الإضافية باستخدام معلمات التشغيل. بمجرد تحديد رقم الدورة ، قم بإعداد PCRs مع الدورات الإضافية المحسوبة مسبقا.
إلى منتجات PCR المضخمة ، أضف 150 ميكرولتر من الخرز ، واحتضانها لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ضع الأنابيب على حامل مغناطيسي لمدة خمس دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية بعناية. اغسل الخرز ب 200 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80٪ ، وقم بإزالة المادة الطافية.
قم بإزالة الإيثانول تماما ، وجفف العينات في الهواء لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أخيرا ، أعد التعليق باستخدام 50 ميكرولترا من المخزن المؤقت للشطف. ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي ، ثم انقل الشطف إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.7 ملليلتر.
تظهر هنا مقارنة بين كفاءة تحلل الخلايا باستخدام التريبان الأزرق. تم علاج خلايا NMuMG بمخزن مؤقت منخفض التوتر ومخزن CSK وملطخة باللون الأزرق المثقب. لوحظت كفاءة تحلل الخلايا الأعلى في الخلايا المعالجة ب CSK.
تم تحضير مكتبات ATAC-seq من خلايا سرطان الثدي MDA-MB-231. بعد تضخيم PCR ، تم تحليل منتجات PCR على 0.5X TBE ، 1.5٪ هلام agarose قبل وبعد تنقية الخرز. تتم إزالة الاشعال في الغالب عن طريق تنقية الخرز الأولي.
يشار أيضا إلى أنماط نطاق الحمض النووي من 1X TAE 1٪ agarose gel الكهربائي والرحلان الكهربائي الآلي. تم استخدام SYBR Gold لتصور شظايا الحمض النووي الموضحة هنا. يتم تقديم مسار متصفح الجينوم الذي يوضح موضع ERS1 هنا.
تظهر تغطية الجينوم لبيانات ATAC-seq في خلايا T47D في هذه الصورة. تم استخدام مواد أولية من منشور سابق ، وتم تمييز المناطق المستهدفة باللون الأصفر. يظهر هنا رسم بياني شريطي يصور إثراء amplicon التمهيدي في مكتبات ATAC-seq.
تم إعداد مكتبات ATAC-seq بواسطة المخزن المؤقت منخفض التوتر أو المخزن المؤقت CSK. تظهر الصورة التمثيلية تصور متصفح الجينوم لتحسين ATAC-seq. أظهرت بيانات ATAC-seq من حالة إدخال 25،000 خلية أعلى إثراء للشظايا الخالية من النيوكليوسوم ، في حين أن حالة إدخال 100،000 خلية قدمت أعلى الحمض النووي أحادي النوكليوسوم.
يتم عرض مسارات متصفح الجينوم التي تعرض بيانات ATAC-seq من أرقام خلايا مختلفة هنا. تم تصوير تحليل التعليقات التوضيحية لذروة HOMER في هذه الصورة التمثيلية. صنف هوميروس كل قمة على أنها قمة قريبة أو بعيدة عن المروج.
يعد عدد اختيار مدخلات الخلية لمخزن تحلل الخلية وتركيز إنزيم Tn5 المعتمد على نوع الخلية أهم معلمة يجب توحيدها. يستخدم Tn5 المنصهر مع البروتين A في تقنية القطع والتك على نطاق واسع لتحديد موقع ربط الحمض النووي للبروتين محل الاهتمام باستخدام الأجسام المضادة الخاصة بهذا البروتين محل الاهتمام.
