تستخدم هذه الطريقة D-peptide DPA ، المسمى بالغاليوم 68. يتيح جهاز التتبع الراديوي Gallium-68 لتسمية DPA تصورا في الوقت الفعلي لتعبير PDL-1 في الجسم كله بطريقة غير جراحية. يمنح استخدام D-peptide المقتفي الراديوي مقاومة مفرطة للتحلل البروتيني ويطيل عمر النصف الأيضي بشكل ملحوظ.
على وجه الخصوص ، يمكن تطبيق هذه التقنية لتقييم الأمراض المختلفة ، التي تخضع لاكتشاف أهداف محددة وتطوير متتبعات الراديو مع حركية المكالمات الهاتفية الجيدة. يمكن أيضا تطبيق هذه التقنية لعلاج الأورام الإيجابية PDL-1 أثناء وضع علامات DPA مع النيوكليوتيدات المشعة الأخرى ، مثل Lutetium-177 و Actinium-225. سيكون وو جيانغ ، باحث من مختبري ، يوضح الإجراء الخاص بي.
لوضع العلامات الإشعاعية على مضاد الببتيد d-dodecapeptide ، أو DPA ، ماصة خمسة ميكرولترات من مخزن المخزون المحضر الذي يحتوي على DPA في حاوية بولي بروبيلين سعة 1.5 ملليلتر مع غطاء لولبي وإضافة 400 ميكرولتر من 68 ثلاثي كلوريد الغاليوم إلى الحاوية. دوامة الخليط لمدة خمس ثوان. قم بقياس الأس الهيدروجيني للخليط باستخدام شرائط اختبار الأس الهيدروجيني واضبط الأس الهيدروجيني إلى 4 إلى 4.5 باستخدام 0.1 مولار هيدروكسيد الصوديوم.
احتضان الحل في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس إلى 10 دقائق. ثم باتباع الشروط المذكورة في النص ، قم بإخضاع خليط التفاعل لراديو HPLC لتحليل عائد الملصقات الراديوية. لاختبار استقرار التتبع في PBS ، أضف 10 ميكرولترات من DPA المسمى Gallium-68 في محلول أسيتات الصوديوم إلى 990 ميكرولتر من PBS.
احتضان الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واثنين وأربع ساعات ، مع تحريض طفيف. اجمع 200 ميكرولتر من المحلول في كل نقطة زمنية محددة وقم بتحليلها بواسطة راديو HPLC. لاختبار استقرار التتبع في مصل الفأر ، أضف 10 ميكرولتر من DPA المسمى Gallium-68 في محلول أسيتات الصوديوم إلى 90 ميكرولتر من مصل الفأر الطازج واحتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واثنين وأربع ساعات مع تحريض طفيف.
ثم اجمع 20 ميكرولترا من المحلول في كل نقطة زمنية مذكورة وأضف 100 ميكرولتر من خليط ماء الأسيتو النتريل إلى القسمة المجمعة. أجهزة الطرد المركزي الخليط في 5،000 غرام لمدة 10 دقائق في 25 درجة مئوية. تحليل طاف باستخدام HPLC الراديو.
استزرع خلايا U-87 MG في 12 لوحة بئر حتى يتم الوصول إلى التقاء 80٪. ثم قم بإزالة الوسط وغسل الخلايا ب 0.5 مل من برنامج تلفزيوني. تمييع DPA المسمى Gallium-68 في وسط جديد إلى تركيز 74 كيلو بيكريل لكل ملليلتر.
ثم أضف 0.5 ملليلتر من المخزن المؤقت المخفف Gallium-68 المسمى DPA إلى كل بئر. احتضان الخلايا مع Gallium-68 المسمى DPA عند 37 درجة مئوية لمدة 10 و 30 و 40 و 120 دقيقة. بعد الحضانة ، نضح الوسط باستخدام ماصة وغسل الخلايا مع 0.5 ملليلتر من برنامج تلفزيوني ثلاث مرات.
بعد ذلك ، أضف 300 ميكرولتر من محلول هيدروكسيد الصوديوم 0.5 المولي لكل بئر لتحلل الخلايا. بعد 30 ثانية ، اجمع الخلايا اللزجة المحللة في أنابيب 1.5 ملليلتر. اغسل اللوحة بإضافة 0.4 ملليلتر من PBS لكل بئر مرتين ، وجمع محلول الغسيل في أنابيب 1.5 ملليلتر المذكورة.
ابدأ تشغيل الكمبيوتر المدمج في عداد جاما التلقائي وضع الأنابيب في الرف المدمج. بعد تحميل جميع العينات على الناقل ، اضغط على زر البدء. يتم حساب النتائج في البرنامج الداخلي ، بينما تسجل القراءات عدد الاضمحلال المرتبط في الدقيقة ، أو CPM ، لكل أنبوب.
اجمع خلايا U-87 MG باتباع البروتوكول المذكور في النص واستنشاق الخلايا في حقنة 0.5 ملليلتر. بعد ذلك ، خذ الفئران العارية BALB / c وحقن الخلايا تحت الجلد ، مع الحفاظ على عدد ورمين لكل فأر. راقب نمو الورم بعد الحقن حتى يصبح حجم الورم من 100 إلى 300 ملم مكعب.
لإجراء التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني، قم بحقن المقتفيات عن طريق الوريد من خلال قسطرة وريد الذيل المثبتة مسبقا. قم بإنشاء سير عمل مسح ضوئي في كمبيوتر مضيف باستخدام البرنامج المرجعي ، متبوعا بإنشاء مجلد دراسة وتعيين بروتوكول الاستحواذ وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. إجراء عمليات مسح ديناميكية على كل ماوس لمدة 60 دقيقة في وضع قائمة 3D.
بعد ذلك ، حدد بروتوكول الرسم البياني وبروتوكول إعادة البناء ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. استخدم مرشح Hanning مع قطع Nyquist من 0.5 دورة لكل بكسل لإعادة بناء الصور الديناميكية PET لمدة 25 إلى 30 دقيقة ، ومن 55 إلى 60 دقيقة من خلال الإسقاط الخلفي المصفى. قم بإنشاء إسقاط أقصى كثافة ، أو صور MIP ، لجميع الفئران.
إدارة Gallium-68 المسمى DPA إلى U-87 MG التي تحمل BALB / c الفئران العارية من خلال حقن الوريد الذيل. بعد القتل الرحيم ، تشريح جدار الصدر للحيوان وفتح القلب. باستخدام حقنة سعة ملليلتر واحد ، اسحب الدم واضغط على الدم من المحقنة إلى أنبوب مقايسة مناعية راديوية ، أو RIA ، بقطر 13 ملم لعداد جاما.
استئصال الأعضاء والأورام الرئيسية ووضعها في أنابيب RIA مماثلة لعداد جاما. وزن جميع الأجهزة الرئيسية المذكورة في النص. قم بقياس النشاط الإشعاعي داخل الأعضاء التي تم جمعها باستخدام عداد جاما تلقائي وتصحيح القيم.
احسب النسبة المئوية للجرعة المحقونة لكل جرام من الأنسجة الرطبة. أظهر DPA المسمى Gallium-68 شوائب كيميائية عالية الإشعاع. كان مستقرا للغاية في كل من PBS ومصل الفأر ، ولم يظهر أي تحلل بالغاليوم 68 أو تحلل مائي للببتيد بعد الحضانة لمدة أربع ساعات.
تم العثور على ما يقرب من 60 ٪ من خلايا U-87 MG مبرمجة على ليجند الموت واحد ، أو PDL-1 إيجابي عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وأكد تلطيخ المناعي تعبيرا قويا عن PDL-1 في خلايا U-87 MG. أظهرت خلايا U-87 MG امتصاصا يعتمد على الوقت ل DPA المسمى بالغاليوم 68 ، والذي انخفض بشكل كبير عند استخدام مثبط PDL-1 ، BMS-202 ، كعامل مانع. كان تقارب الارتباط المقدر ل BMS-202 43.8 نانومول لكل لتر عندما تم استخدام DPA المسمى Gallium-68 كمنافس.
كشفت صور التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني لكامل الجسم عن تراكم DPA عالي المسمى بالغاليوم 68 في الورم بعد 30 و 60 دقيقة من الحقن. أظهرت تجربة موازية القليل من تراكم DPA المسمى بالغاليوم 68 في أورام Bon-1 ذات السيطرة السلبية في 60 دقيقة بعد الحقن. علاوة على ذلك ، كشف التلوين المناعي الكيميائي أن خلايا U-87 MG قدمت تعبيرا كبيرا عن PDL-1 ، ولكن ليس ورم Bon-1.
أظهر تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين مورفولوجيا خلوية مماثلة بين نسيجي الورم. أظهرت دراسة التوزيع الحيوي خارج الجسم الحي إزالة سريعة للنشاط الإشعاعي والدم في معظم الأعضاء التي تم تحليلها ، بما في ذلك القلب والكبد والرئة والعضلات. تراكمت الكلى أكبر قدر من النشاط الإشعاعي ، في حين أظهر الورم ثاني أعلى امتصاص للتتبع في جميع النقاط الزمنية.
إن اختلاف بنية الببتيد D باستخدام طريقة فعالة لوضع العلامات على DPA باستخدام Gallium-68 هي الخطوة الأكثر أهمية. مهدت هذه التقنية الطريق لاستغلال اختبار التصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني كمستحضرات صيدلانية إشعاعية فعالة لإدارة أنواع السرطان المختلفة ، سواء كمتتبعات للتصوير المقطعي بالإصدار البوزيتروني أو عوامل التشخيص الإشعاعي.
