نشكر K. Deisseroth وS. جي للChR2 وSynapsin1-tdTomato يبني lentiviral على التوالي، C. تشاي لتبادل الخبرات وبروتوكول بشأن الجيل IPSC، WY يونغ للدعم الفني، وأعضاء المختبر جوه للمواد تقاسم والخبرات. وأيد هذا العمل من قبل ابوت التغذية ومركز الأكاديمية للتميز (ACE) على جائزة بحثية من شركة جلاكسو سميث كلاين (GSK) لELG، من مؤسسة أبحاث سنغافورة الوطنية في إطار برنامجها للبحوث التنافسية (جبهة الخلاص الوطني 2008 جبهة الخلاص الوطني-CRP 002-082) إلى ELG و GJA، ومعهد عالمي (WCI) برنامج المؤسسة الوطنية للبحوث كوريا (جبهة الخلاص الوطني) بتمويل من وزارة التعليم والعلوم والتكنولوجيا في كوريا (MEST) (جبهة الخلاص الوطني جرانت رقم: 2009-003 WCI) إلى GJA

<ol>
	<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+mapping+of+synaptic+connectivity+using+photostimulation+in+Channelrhodopsin-2+transgenic+mice.">High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Stroh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+stem+cell+differentiation+in+the+setting+of+automated+optogenetic+stimulation.">Tracking stem cell differentiation in the setting of automated optogenetic stimulation.</a> Stem Cells. 29 (1), 78-88 (2011).</li><li>Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, S. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+neurons+adopt+and+regulate+the+activity+of+an+established+neural+network.">Human embryonic stem cell-derived neurons adopt and regulate the activity of an established neural network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (50), 20189-20194 (2011).</li><li>Viviani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+coculture+of+neurons+and+glial+cells.">Preparation and coculture of neurons and glial cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. 32, 2.7.1-2.7.2.1 (2006).</li><li>Braun, H., G&#252;nther-Kern, A., Reymann, K., Onteniente, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+of+human+iPS-cells+in+a+rat+cortical+primary+culture.">Neuronal differentiation of human iPS-cells in a rat cortical primary culture.</a> Acta Neurobiologiae Experimentalis. 72 (30), 219-229 (2012).</li><li>Shivaraj, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taurine+induces+proliferation+of+neural+stem+cells+and+synapse+development+in+the+developing+mouse+brain.">Taurine induces proliferation of neural stem cells and synapse development in the developing mouse brain.</a> PLoS ONE. 7, e42935 (2012).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+induction+and+long-term+self-renewal+of+primitive+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells+by+small+molecule+inhibitors.">Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (20), 8299-8304 (2011).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (50), 424-429 (2011).</li><li>Packer, A. M., Roska, B., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neurons+and+photons+for+optogenetics.">Targeting neurons and photons for optogenetics.</a> Nature Neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).</li><li>Marchetto, M. C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+Syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A Model for neural development and treatment of Rett Syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li><li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits.">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 160 (2013).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

علم البصريات الوراثي يوفر الدقة الزمنية والمكانية لتفعيل السكان محددة من الخلايا العصبية (13). في تجاربنا، كانت مضاءة الحقل بأكمله من الهدف المجهر لمدة 30 ثانية إلى الصور تحفيز الخلايا العصبية القشرية الوحيدة معربا عن ChR2. وهذا ما سمح لنا لتحديد ما إذا تم تشكيل اتصالات متشابك بين مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية داخل الثقافة المشتركة. كشفت نتائجنا أن ضوئي يزيد تردد PSC في الخلايا العصبية IPSC المشتقة، والذي يدل على أن هذه الخلايا العصبية تستقبل مدخلات متشابك من الخلايا العصبية القشرية قبل المشبكي معربا عن ChR2. وهذا، بدوره، على أن الخلايا العصبية IPSC المستمدة من دمج بنجاح في الدوائر مع الخلايا العصبية القشرية. هناك العديد من الخطوات الحاسمة لتوليد هذا النظام المشترك الثقافة. من المهم للتأكد من أن الثقافات نجمية الماوس NPC المستمدة من يتمتعون بصحة جيدة، مع الحد الأدنى من موت الخلايا، قبل الشروع في الطلاءمن أنواع الخلايا الأخرى. العصبونات القشرية والشخصيات البشرية نعلق كذلك على الخلايا النجمية صحية والتسجيلات الكهربية تعتمد بشكل كبير على الظروف الثقافة. الخطوات الرئيسية الأخرى في هذا البروتوكول هي Electroporation للوالطلاء من الخلايا العصبية القشرية على الثقافات نجمية. كما عدد كبير من الخلايا تموت بعد Electroporation لل، فمن المهم التأكد من أن 6 ملايين على الأقل العصبونات القشرية وelectroporated لتصفيح على الثقافات نجمية في 24 لوحات جيدا. وقد لاحظنا أنه عندما تم electroporated أقل من 6 ملايين الخلايا، وعدد الخلايا العصبية التي البقاء على قيد الحياة لم تشكل شبكة العصبية الكثيفة، والتي أثرت التسجيلات الكهربية. وينبغي أيضا أن يكون عدد الخلايا العصبية القشرية electroporated ثابت لكل تجربة ثقافة مشتركة للسماح للمقارنة بين الدراسات المختلفة. لجميع الخطوات التي تنطوي على الهضم الأنزيمي، فمن الضروري عدم ترك الخلايا في حل الهضمي لفترة طويلة جدا لأنها قد تؤدي إلى موت الخلايا. هذايمكن استخدام نهج لفحص قدرة الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الليفية المريض محددة لتشكيل اتصالات متشابك مع الخلايا العصبية الأخرى. الخلايا العصبية المشتقة من الخلايا الليفية من المرضى الذين يعانون من اضطراب النمو العصبي ريت المكتسب (RTT) يحمل عيوب انتقال متشابك: الخلايا العصبية RTT يحمل انخفاض ملحوظ في وتيرة PSC والسعة مقارنة مع الخلايا العصبية السليمة، ويفترض نظرا لأقل اتصال متشابك 14. يسمح نظامنا شارك في ثقافة فحص آثار المخدرات على الخلايا العصبية التي تظهر العيوب الخلقية. هذا يمكن القيام بها عن طريق إضافة مركبات من الفائدة خلال زرع البذور من الشخصيات البشرية المريضة وكذلك خلال التعرض المستمر لمركبات طوال الوقت من تمايز الخلايا العصبية. في حين أن هذا النظام شارك في الثقافة يمكن أن تستخدم أيضا بوصفها نموذجا لاختبار المخدرات، وجود قيود مع هذا النهج هو أن عملية التحقيق في آثار كل مجمع مرشح يمكن أن تكون طويلة ومملة كماأنها ليست طريقة الفرز الإنتاجية العالية. بعد العلاج مع مركبات مرشح، الخلايا العصبية IPSC المشتقة يجب أن تكون مصححة بشكل فردي لتحديد الآثار المترتبة على كل مجمع على شركات الأمن الخاصة. وعلاوة على ذلك، هناك حاليا العديد من الخلايا الليفية لا المتاحة وiPSCs من المرضى. ولذلك، فإنه سوف تكون ذات فائدة في المستقبل القريب أن يكون أكثر خلايا المريض وأيضا على التكيف مع هذا البروتوكول لارتفاع الفرز الإنتاجية. على سبيل المثال، من خلال وصفها الخلايا العصبية IPSC المشتقة مع مؤشر النشاط، مثل أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا من الأيونات أو غشاء المحتملة، سيكون من الممكن زيادة معدل الإنتاجية بشكل كبير عن طريق إجراء الكهربية تستغرق وقتا طويلا، خطوة جانبية. كما أن العملية برمتها لتوليد هذا النظام شارك في الثقافة، من إعادة برمجة الخلايا الليفية إلى أداء التسجيلات الكهربية، يتطلب أكثر من 90 يوما، فمن المستحسن أن إما iPSCs الإنسان أو الشخصيات يتم توسيع، بعد إعادة برمجة والخطوات تحريض العصبية على التوالي،وcryopreserved إلى تقليص الوقت اللازم لإجراء التجارب في المستقبل. في تجاربنا، عبرنا عن ChR2 في الخلايا العصبية القشرية تحت المروج synapsin1. لأن هذا هو المروج لعموم العصبية، ونحن يفترض تم photostimulating كل من الخلايا العصبية القشرية المثبطة ومثير. إذا كان الهدف من التجارب في المستقبل هو لاستجواب تحديدا الدوائر إما المثبطة أو مثير، يمكن أن تستخدم المروجين أكثر تحديدا. بدلا من ذلك، يمكن الحصول على الخلايا العصبية القشرية من المعدلة وراثيا (أو حقن فيروس الفئران) حيث يتم استهداف ChR2 التعبير خصيصا لمجموعات سكانية فرعية محددة وراثيا من الخلايا العصبية. على سبيل المثال، أعربت الأنسجة القشرية حصاد من ماوس التي لديها لجنة المساواة العرقية recombinase في interneurons التي تحتوي على parvalbumin (interneurons PV) التي عبرت مع ماوس مع floxed ChR2 سوف تسفر عن الحالة التي تكون فيها الخلايا العصبية القشرية الوحيدة معربا عن ChR2 سيكون interneurons PV 15. استخدام هذا ChR2 معربا عن interneurons في مشاركتنا في مكعبسوف نظام lture تمكين تحديد ما إذا كانت الخلايا العصبية مصححة IPSC المشتقة هي قادرة على أن تدرج في الدائرة مع interneurons PV. واستنادا إلى دراسة سابقة 9، الخلايا العصبية القشرية ناضجة مع تداخل التشعبات بعد 14 يوما في المختبر. وهكذا، إذا لا ضوئي حصول على رد من الخلايا العصبية مصححة IPSC المشتقة، فإنه ينبغي أن تشير إلى أن الخلايا العصبية لا يملك القدرة على إجراء اتصالات متشابك مع الخلايا العصبية القشرية. والخلايا العصبية IPSC المشتقة هي قادرة على الحصول على مدخلات متشابك إما من الخلايا العصبية IPSC المشتقة الأخرى أو العصبونات القشرية. إذا استخدمت التصحيح التقليدي التسجيلات المشبك، فإنه لن يكون من الممكن التمييز حيث مدخلات متشابك قادم من. ميزة نظامنا هو أن الردود بعد المشبكي من المدخلات قبل المشبكي القشرية يمكن أثار انتقائي والتعرف. توفر الإجراءات المذكورة هنا مقاربة بسيطة لتقييم قدرة الخلايا العصبية IPSC المشتقة لدمجإلى شبكة الخلايا العصبية المحددة.

في السنوات الأخيرة، وقد أحدثت ثورة في فهمنا من الخلايا العصبية والخلايا العصبية وظيفة الدوائر بواسطة عدة أدوات optogenetic التي تتحكم في استثارة الخلايا العصبية. واحدة من هذه الأداة هي القناة الموجبة لتنشيط ضوء، channelrhodopsin-2 (ChR2): الخلايا العصبية معربا عن ChR2 إمكانات العمل النار ردا على التحفيز خفيفة 1-3. لأن الخلايا العصبية ليست حساسة عادة للضوء، وهذه القدرة الرائعة تفتح آفاقا جديدة لمكافحة الزمانية والمكانية دقيقة لنشاط السكان محددة وراثيا من الخلايا العصبية (4) ولقد تسارعت بشكل كبير من الدراسات وظيفة الدماغ. وقد تم تطبيق ChR2 لأبحاث الخلايا الجذعية لأغراض مختلفة، من رصد التنمية العصبية 5 إلى تنظيم نشاط الشبكات العصبية 6. نحن هنا تستخدم ChR2 لزيادة فائدة نظام شارك في ثقافة العصبية. تمكن أنظمة شارك في ثقافة تقييم التفاعلات بين أنواع مختلفة من الخلايا.شارك الثقافات من الخلايا العصبية والدبقية، أنواع الخلايا الرئيسية للجهاز العصبي، وتستخدم عادة للتحقيق مما يشير بين هذه أنواع مختلفة من الخلايا، وكذلك لتقييم أهمية هذه الإشارات لالاستجابات الفسيولوجية، والإكثار من الضرر ودراسة الآليات الجزيئية التي يحتمل أن تشارك في هذه إشارات 7. وكشفت دراسة سابقة أن iPSCs الإنسان تفرق بسرعة كبيرة في الخلايا العصبية في وجود ثقافة تحتوي على الخلايا العصبية الفئران القشرية الأولية، الخلايا النجمية، قليلة التغصن، والخلايا الدبقية الصغيرة 8. في هذا البروتوكول، ونحن يبرهن على وجود طريقة التي تستخدم ChR2 في نظام شارك في ثقافة لاستجواب الاتصالات المشبكية بين الخلايا العصبية والخلايا العصبية القشرية الفئران المستمدة من الخلايا الجذعية المحفزة من صنع الإنسان (iPSCs). وصفنا خطوات لتشريح وأنسجة المخ الحصاد 9 وكذلك للحفاظ على وتفرق الماوس الخلايا الاصلية العصبية (الشخصيات) في الخلايا النجمية والشخصيات البشرية كثافة العملياتس الخلايا العصبية لخلق نظام المشاركة في الثقافة. لإنشاء هذا النظام المشترك والثقافة، واستخدمنا طريقة إعادة برمجة خالية من التكامل وصفها أوكيتا وآخرون. 10 لتوليد iPSCs الإنسان. ثم تم ميز هذه iPSCs بكفاءة في اللجان التحضيرية الوطنية في ظروف محددة كيميائيا باستخدام مثبطات الصغيرة جزيء كما وصفها لي وآخرون. 11 في الثقافات المشترك، يمكن التعرف على مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية عن طريق الكشف عن ChR2 التعبير في الخلايا العصبية القشرية ووضع علامات على الخلايا العصبية IPSC المشتقة عن طريق بروتين الفلورسنت، جنبا إلى جنب ديمر الطماطم (tdTomato). الجمع بين التسجيلات الكهربية من الخلايا العصبية IPSC المستمدة مع ضوئي optogenetic من الخلايا العصبية القشرية يسمح تقييم قدرة هذين النوعين من الخلايا العصبية لتشكيل الدوائر مع بعضها البعض. على وجه التحديد، ضوئي من ChR2 معربا عن الخلايا العصبية القشرية تثير ردود متشابك في الخلايا العصبية IPSC المشتقة التي شكلت الدوائر متشابكمع شبكة الخلايا العصبية القشرية photostimulated. علينا أن نبرهن على زيادة التيارات بعد المشبكي يتم الكشف عنها بالفعل في الخلايا العصبية IPSC المشتقة في ظل هذه الظروف. هذا البروتوكول يسمح تقييم الدوائر متشابك في إطار مجموعة من الظروف التجريبية، بما في ذلك خلاصة من نماذج مختلفة المرض العصبية باستخدام iPSCs المستمدة من الخلايا الليفية من المرضى المرض.

an optogenetic approach for assessing formation of neuronal connections in a co-culture system

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

هنا، بروتوكول يصف الخطوات المتعددة التي ينطوي عليها توليد الثقافة المشتركة التي تتكون الخلايا النجمية، ويتضح الخلايا العصبية والخلايا العصبية القشرية الإنسان. تم الحصول على iPSCs الإنسان عن طريق إعادة برمجة الخلايا الليفية باستخدام episomal ناقلات 10 و محدد في النسب العصبي مع كوكتيل من مثبطات جزيء صغير، مما يجعل الشخصيات 11 التي حافظت على كثافة عالية (الشكل 1A). مطلوبة عدة خطوات لتوليد الثقافة المشتركة: التفريق بين الشخصيات الماوس إلى الخلايا النجمية، والطلاء من الفئران الخلايا العصبية القشرية معربا عن ChR2، وزرع البذور من الشخصيات الإنسان الموسومة ب tdTomato (الشكل 1B). في يوم 2 من التمايز، الدبقية ييفي الحمضية البروتين (GFAP) + الخلايا النجمية يمكن بسهولة ملاحظة في ثقافاتنا (الشكل 1C). سمح الماوس الشخصيات التفريق لمدة أسبوع على الأقل قبل الطلاء العصبونات القشرية معربا عن ChR2 على أحادي الطبقة نجمية (1D الشكل). بعد 3إلى 4 أسابيع من التمايز البشري مجلس الشعب، تم الكشف عن tdTomato + الخلايا العصبية في الثقافات (الشكل 1E). هذا النظام شارك في ثقافة يسمح كشف ثابت من التيارات بعد المشبكي من الخلايا العصبية الفردية IPSC المشتقة ردا على التحفيز الضوء (الشكل 2A). عندما يحفزه الضوء، تم إنشاؤها إمكانات العمل في الخلايا العصبية القشرية معربا عن ChR2 (الشكل 2B). IPSC المشتقة من الخلايا العصبية هي أيضا منفعل (الشكل 2C)، والتي تبين زيادة العمل المحتملين اطلاق مثل اتساع إزالة إستقطاب البقول الحالية وزيادة (الشكل 2D). وهكذا، وهذه الخلايا يحمل خصائص الخلايا العصبية الناضجة. في غياب الضوء، تلقت الخلايا العصبية IPSC المستمدة من مدخلات متشابك عفوية (الشكل 2E). تم بوساطة هذه التيارات بعد المشبكي إلى الداخل في الغالب عن طريق مستقبلات أمبا، لأن التيارات من خلال مستقبلات GABA ستكون الخارج ومستقبلات NMDA لا تحمل الحالير المحتمل عقد -70 بالسيارات. بعض من هذه المدخلات كانت على الأقل من الخلايا العصبية القشرية قبل المشبكي معربا عن ChR2، لأن التحفيز ضوء زيادة كبيرة في تواتر التيارات بعد المشبكي (الشكل 2E). يظهر مدار الساعة من هذه الزيادة في مدخلات متشابك في الشكل 2F: واستمر ضوئي من الخلايا العصبية القشرية طوال 30 ثانية ضوء فلاش طويلة. في حين تم رفع وتيرة الأمنية الخاصة عندما تم photostimulated ChR2 معربا عن الخلايا العصبية القشرية (الشكل 2G)، وكانت السعة بهم لم تتأثر (الشكل 2H). وباختصار، فإن هذه النتائج تشير إلى أن الخلايا العصبية IPSC المشتقة أظهرت خصائص الخلايا العصبية الناضجة، ويمكن أن تشكل اتصالات متشابك مع الخلايا العصبية القشرية قبل المشبكي. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig1highres.jpg" /> الشكل 1: المخططات التخطيطي لتوليد شارك في ثقافةالنظام. (A) الجدول الزمني لإعادة برمجة الخلايا الليفية الإنسان في iPSCs والحث العصبي إلى اللجان التحضيرية الوطنية. (ب) الجدول الزمني للالتمايز النهائي من الشخصيات الإنسان في الخلايا العصبية الناضجة على الخلايا العصبية ونجمية الثقافات القشرية. (C) الفأر الشخصيات تفرق بسرعة إلى GFAP + الخلايا النجمية بعد 2 أيام في المختبر. (D) بعد أسبوع واحد، كانت مطلية الخلايا العصبية القشرية معربا عن ChR2 على GFAP + الخلايا النجمية. (E) في 4 إلى 5 أسابيع بعد تمايز الشخصيات البشرية، وأجريت التسجيلات الكهربية على tdTomato + الخلايا العصبية. الحانات النطاق تمثل 100 ميكرون. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig2highres.jpg" /> الشكل 2: تحليل Optogenetic من اتصال متشابك وظيفية. وكانت (A) IPSC المشتقة من خلايا ذات الكلمات الدلالية مع tdTomato (الحمراء) شارك في تربيتها مع الخلايا العصبية القشرية معربا عن ضوء تنشيطقناة، ChR2 (الخضراء). تسجيلات من الخلايا العصبية IPSC المشتقة كشفت بعد المشبكي الحالية (PSC) الاستجابات، والتي يمكن أن تأتي إما من الخلايا العصبية القشرية أو الخلايا العصبية الأخرى IPSC مشتقة. (B) الإضاءة (الشريط الأزرق) أثار سلسلة من إمكانات العمل في الخلايا العصبية القشرية معربا عن ChR2. ( وأثار خلايا C) IPSC المشتقة عن طريق الحقن الحالي. (D) إطلاق النار مقابل منحنى الحالي للخلايا IPSC مشتقة. (E) ضوئي من الخلايا العصبية القشرية ChR2 معربا عن (الشريط الأزرق) زيادة وتيرة الأمنية الخاصة في الخلايا العصبية IPSC المشتقة . (F) الوقت بالطبع من الزيادة في وتيرة تكاليف دعم المشروعات التي تنتجها ضوئي. ويشير الشريط الأزرق وقت ضوئي. (G، H) في حين تم زيادة تواتر PSC التي كتبها ضوئي (G)، وكانت السعة PSC تتأثر (H). * يشير P &lt;0.05 مقارنة مع السيطرة اختبار t الطالب.

Watch this Scientific Journal Video about An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System at JoVE.com

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

مقاربة Optogenetic لتقييم تشكيل الوصلات العصبية في نظام المشارك الثقافة

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

an-optogenetic-approach-for-assessing-formation-neuronal-connections

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.3K Views.  Duke-NUS Graduate Medical School. A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2. 

Video: An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

الثقافة والمشارك ثقافة ماوس المبايض وحويصلات المبيض

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening. However, the development of a mass culture system would be required for using PS cells in these applications. Suspension culture is one promising culture method for the mass production of PS cells, although some issues such as controlling aggregation and limiting shear stress from the culture medium are still unsolved. In order to solve these problems, we developed a method of calcium alginate (Alg-Ca) encapsulation using a co-axial nozzle. This method can control the size of the capsules easily by co-flowing N2 gas. The controllable capsule diameter must be larger than 500 &#181;m because too high a flow rate of N2 gas causes the breakdown of droplets and thus heterogeneous-sized capsules. Moreover, a low concentration of Alg-Na and CaCl2 causes non-spherical capsules. Although an Alg-Ca capsule without a coating of Alg-PLL easily dissolves enabling the collection of cells, they can also potentially leak out from capsules lacking an Alg-PLL coating. Indeed, an alginate-PLL coating can prevent cellular leakage but is also hard to break. This technology can be used to research the stem cell niche as well as the mass production of PS cells because encapsulation can modify the micro-environment surrounding cells including the extracellular matrix and the concentration of secreted factors.

We established a method of encapsulating pluripotent stem cells (PS cells) into alginate hydrogel capsules using a co-axial nozzle. This prevents cells from aggregating excessively and limits the shear stress experienced by cells in suspension culture. The technique is applicable to the mass production of PS cells as well as research on stem cell niche.

تغليف الجينات المحفزة للخلايا الجذعية باستخدام فوهة المشارك المحوري

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore adequate kidney function after supportive treatment. However, a better understanding of how nephron cell death and repair occur on the cellular level is required to minimize cell death and to enhance the regenerative process. The zebrafish pronephros is a good model system to accomplish this goal because it contains anatomical segments that are similar to the mammalian nephron. Previously, the most common model used to study kidney injury in fish was the pharmacological gentamicin model. However, this model does not allow for precise spatiotemporal control of injury, and hence it is difficult to study cellular and molecular processes involved in kidney repair. To overcome this limitation, this work presents a method through which, in contrast to the gentamicin approach, a specific Green Fuorescent Protein (GFP)-expressing nephron segment can be photoablated using a violet laser light (405 nm). This novel model of AKI provides many advantages that other methods of epithelial injury lack. Its main advantages are the ability to &#34;dial&#34; the level of injury and the precise spatiotemporal control in the robust in vivo animal model. This new method has the potential to significantly advance the level of understanding of kidney injury and repair mechanisms.

This work presents a new in vivo model of segmental kidney injury using kidney GFP transgenic zebrafish. The model allows for the induction of the targeted ablation of kidney epithelial cells to show the cellular mechanisms of nephron injury and repair.

دقة الخلوية طريقة الاجتثاث لنمذجة إصابة الكلى الحادة في تطوير الزرد

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

A Standardized Approach for Multispecies Purification of Mammalian Male Germ Cells by Mechanical Tissue Dissociation and Flow Cytometry

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. Currently, it allows the discrimination of up to 9 murine germ cell populations with high yield and purity. This high-resolution in discrimination and purification is possible due to unique changes in chromatin structure and quantity throughout spermatogenesis. These patterns can be captured by flow cytometry of male germ cells stained with fluorescent DNA-binding dyes such as Hoechst-33342 (Hoechst). Herein is a detailed description of a recently developed protocol to isolate mammalian testicular germ cells. Briefly, single cell suspensions are generated from testicular tissue by mechanical dissociation, double stained with Hoechst and propidium iodide (PI) and processed by flow cytometry. A serial gating strategy, including the selection of live cells (PI negative) with different DNA content (Hoechst intensity), is used during FACS sorting to discriminate up to 5 germ cell types. These include, with corresponding average purities (determined by microscopy evaluation): spermatogonia (66%), primary (71%) and secondary (85%) spermatocytes, and spermatids (90%), further separated into round (93%) and elongating (87%) subpopulations. Execution of the entire workflow is straightforward, allows the isolation of 4 cell types simultaneously with the appropriate FACS machine, and can be performed in less than 2 h. As reduced processing time is crucial to preserve the physiology of ex vivo cells, this method is ideal for downstream high-throughput studies of male germ cell biology. Moreover, a standardized protocol for multispecies purification of mammalian germ cells eliminates methodological sources of variables and allows a single set of reagents to be used for different animal models.

This work describes the standardization of a method to obtain purified germ cell populations from testicular tissue of different mammalian species. It is a straightforward protocol that combines mechanical testis dissociation, staining with Hoechst-33342 and propidium iodide, and FACS sorting, with wide applications in comparative studies of male reproductive biology.

نهج موحد لتنقية مولتبيسيسيز من الثدييات خلايا الجرثومية الذكور من الأنسجة الميكانيكية التفكك والتدفق الخلوي

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) has been one of the methods of choice to isolate enriched populations of mammalian testicular germ cells. ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature maintenance and pathological malformations can result in severe ischemic diseases, while overly abundant vascular development is associated with cancer and inflammatory disorders. A promising form of pro-angiogenic therapy is the use of angiogenic cell sources, which can provide regulatory factors as well as physical support for newly developing vasculature.
Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are extensively investigated candidates for vascular regeneration due to their paracrine effects and their ability to detect and home to ischemic or inflamed tissues. In particular, first trimester human umbilical cord perivascular cells (FTM HUCPVCs) are a highly promising candidate due to their pericyte-like properties, high proliferative and multilineage potential, immune-privileged properties, and robust paracrine profile. To effectively evaluate potentially angiogenic regenerative cells, it is a requisite to test them in reliable and &#34;translatable&#34; pre-clinical assays. The aortic ring assay is an ex vivo angiogenesis model that allows for easy quantification of tubular endothelial structures, provides accessory supportive cells and extracellular matrix (ECM) from the host, excludes inflammatory components, and is fast and inexpensive to set up. This is advantageous when compared to in vivo models (e.g., corneal assay, Matrigel plug assay); the aortic ring assay can track the administered cells and observe intercellular interactions while avoiding xeno-immune rejection.
We present a protocol for a novel application of the aortic ring assay, which includes human MSCs in co-cultures with developing rat aortic endothelial networks. This assay allows for the analysis of the MSC contribution to tube formation and development through physical pericyte-like interactions and of their potency for actively migrating to sites of angiogenesis, and for evaluating their ability to perform and mediate ECM processing. This protocol provides further information on changes in MSC phenotype and gene expression following co-culture.

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Here, we present a novel application of the aortic ring assay where prelabelled mesenchymal cells are co-cultured with rat aorta-derived endothelial networks. This novel method allows visualization of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing and integration with endothelial networks, quantification of network properties, and evaluation of MSC immunophenotypes and gene expression.

والرزن ثقافة المشارك خاتم الابهري: أداة ملائمة تقييم إمكانات الأوعية الوسيطة Stromal الخلايا في المختبر

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart disease. When using prosthetic materials however, these grafts are susceptible to bacterial infections and various host responses.
Identification of bacterial and host factors that play a vital role in endovascular adherence of microorganisms is of importance to better understand the pathophysiology of the onset of infections such as infective endocarditis (IE) and to develop preventive strategies. Therefore, the development of competent models to investigate bacterial adhesion under physiological shear conditions is necessary. Here, we describe the use of a newly designed in vitro perfusion chamber based on parallel plates that allows the study of bacterial adherence to different components of graft tissues such as exposed extracellular matrix, endothelial cells and inert areas. This method combined with colony-forming unit (CFU) counting is adequate to evaluate the propensity of graft materials towards bacterial adhesion under flow. Further on, the flow chamber system might be used to investigate the role of blood components in bacterial adhesion under shear conditions. We demonstrated that the source of tissue, their surface morphology and bacterial species specificity are not the major determining factors in bacterial adherence to graft tissues by using our in-house designed in vitro perfusion model.

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

We describe an in-house designed in vitro flow chamber model, which allows the investigation of bacterial adherence to graft tissues.

نموذج في المختبر نظام التروية التوازي-لوحة لدراسة البكتيريا التمسك Graft الأنسجة

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more than 50 different pathological conditions, such as rheumatoid arthritis, oculopathy, cardiovascular diseases, and tumor metastasis. During angiogenesis drug development, it is crucial to use in vitro assay systems with appropriate cell types and proper conditions to reflect the physiologic angiogenesis process. To overcome limitations of current in vitro angiogenesis assay systems using mainly endothelial cells, we developed a 3-dimensional (3D) co-culture spheroid sprouting assay system. Co-culture spheroids were produced by two human vascular cell precursors, endothelial colony forming cells (ECFCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) with a ratio of 5 to 1. ECFCs+MSCs spheroids were embedded into type I collagen matrix to mimic the in vivo extracellular environment. A real-time cell recorder was utilized to continuously observe the progression of angiogenic sprouting from spheroids for 24 h. Live cell fluorescent labeling technique was also applied to tract the localization of each cell type during sprout formation. Angiogenic potential was quantified by counting the number of sprouts and measuring the cumulative length of sprouts generated from the individual spheroids. Five randomly-selected spheroids were analyzed per experimental group. Comparison experiments demonstrated that ECFCs+MSCs spheroids showed greater sprout number and cumulative sprout length compared with ECFCs-only spheroids. Bevacizumab, an FDA-approved angiogenesis inhibitor, was tested with the newly-developed co-culture spheroid assay system to verify its potential to screen anti-angiogenic drugs. The IC50 value for ECFCs+MSCs spheroids compared to the ECFCs-only spheroids was closer to the effective plasma concentration of bevacizumab obtained from the xenograft tumor mouse model. The present study suggests that the 3D ECFCs+MSCs spheroid angiogenesis assay system is relevant to physiologic angiogenesis, and can predict an effective plasma concentration in advance of animal experiments.

Three-dimensional co-culture spheroid angiogenesis assay system is designed to mimic the physiologic angiogenesis. Co-culture spheroids are formed by two human vascular cell precursors, ECFCs and MSCs, and embedded in collagen gel. The new system is effective for evaluating angiogenic modulators, and provides more relevant information to the in vivo study.

نظام فحص تكوين الأوعية ثلاثي الأبعاد باستخدام Spheroids الثقافة المشتركة التي شكلتها الخلايا المكونة للمستعمرة البطانية والخلايا الجذعية Mesenchymal

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...

A Co-Culture Method to Study Neurite Outgrowth in Response to Dental Pulp Paracrine Signals

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. Without sensory innervation, daily oral activities would cause irreparable damage. Despite its importance, the roles of innervation in tooth development and maintenance have been largely overlooked. Several studies have demonstrated that DP cells secrete extracellular matrix proteins and paracrine signals to attract and guide TG axons into and throughout the tooth. However, few studies have provided detailed insight into the crosstalk between the DP mesenchyme and neuronal afferents. To address this gap in knowledge, researchers have begun to utilize co-cultures and a variety of techniques to investigate these interactions. Here, we demonstrate the multiple steps involved in co-culturing primary DP cells with TG neurons dispersed on an overlying transwell filter with large diameter pores to allow axonal growth through the pores. Primary DP cells with the gene of interest flanked by loxP sites were utilized to facilitate gene deletion using an Adenovirus-Cre-GFP recombinase system. Using TG neurons from the Thy1-YFP mouse allowed for precise afferent imaging, with expression well above background levels by confocal microscopy. The DP responses can be investigated via protein or RNA collection and analysis, or alternatively, through immunofluorescent staining of DP cells plated on removable glass coverslips. Media can be analyzed using techniques such as proteomic analyses, although this will require albumin depletion due to the presence of fetal bovine serum in the media. This protocol provides a simple method that can be manipulated to study the morphological, genetic, and cytoskeletal responses of TG neurons and DP cells in response to the controlled environment of a co-culture assay.

We describe the isolation, dispersion and plating of dental pulp (DP) primary cells with trigeminal (TG) neurons cultured atop overlying transwell filters. Cellular responses of DP cells can be analyzed with immunofluorescence or RNA/protein analysis. Immunofluorescence of neuronal markers with confocal microscopy permits the analysis of neurite outgrowth responses.

طريقة الثقافة المشتركة لدراسة النيرايت الناء في الاستجابة لإشارات اللب الأسنان باراكرين

Tooth innervation allows teeth to sense pressure, temperature and inflammation, all of which are crucial to the use and maintenance of the tooth organ. ...

An Optimized O9-1/Hydrogel System for Studying Mechanical Signals in Neural Crest Cells

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to various organs and tissues. Tissue stiffness produces mechanical force, a physical cue that plays a critical role in NCC differentiation; however, the mechanism remains unclear. The method described here provides detailed information for the optimized generation of polyacrylamide hydrogels of varying stiffness, the accurate measurement of such stiffness, and the evaluation of the impact of mechanical signals in O9-1 cells, a NCC line that mimics in vivo NCCs.
Hydrogel stiffness was measured using atomic force microscopy (AFM) and indicated different stiffness levels accordingly. O9-1 NCCs cultured on hydrogels of varying stiffness showed different cell morphology and gene expression of stress fibers, which indicated varying biological effects caused by mechanical signal changes. Moreover, this established that varying the hydrogel stiffness resulted in an efficient in vitro system to manipulate mechanical signaling by altering gel stiffness and analyzing the molecular and genetic regulation in NCCs. O9-1 NCCs can differentiate into a wide range of cell types under the influence of the corresponding differentiation media, and it is convenient to manipulate chemical signals in vitro. Therefore, this in vitro system is a powerful tool to study the role of mechanical signaling in NCCs and its interaction with chemical signals, which will help researchers better understand the molecular and genetic mechanisms of neural crest development and diseases.

Detailed step-by-step protocols are described here for studying mechanical signals in vitro using multipotent O9-1 neural crest cells and polyacrylamide hydrogels of varying stiffness.

نظام O9-1/Hydrogel محسن لدراسة الإشارات الميكانيكية في خلايا كريست العصبية

Neural crest cells (NCCs) are vertebrate embryonic multipotent cells that can migrate and differentiate into a wide array of cell types that give rise to ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control over gene expression timing, location, and amplitude using light as the inducing agent. In this protocol, an optogenetic expression system is used to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos. This system relies on an engineered transcription factor called TAEL based on a naturally occurring light-activated transcription factor from the bacterium E. litoralis. When illuminated with blue light, TAEL dimerizes, binds to its cognate regulatory element called C120, and activates transcription. This protocol uses transgenic zebrafish embryos that express the TAEL transcription factor under the control of the ubiquitous ubb promoter. At the same time, the C120 regulatory element drives the expression of a fluorescent reporter gene (GFP). Using a simple LED panel to deliver activating blue light, induction of GFP expression can first be detected after 30 min of illumination and reaches a peak of more than 130-fold induction after 3 h of light treatment. Expression induction can be assessed by quantitative real-time PCR (qRT-PCR) and by fluorescence microscopy. This method is a versatile and easy-to-use approach for optogenetic gene expression.

Optogenetics is a powerful tool with wide-ranging applications. This protocol demonstrates how to achieve light-inducible gene expression in zebrafish embryos using the blue light-responsive TAEL/C120 system.

تعبير GFP الناجم عن الضوء في أجنة حمار وحشي باستخدام نظام TAEL/C120 Optogenetic

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...