우리는 IPSC 세대에 전문 지식과 프로토콜을 공유하기 위해, 각각 ChR2 및 Synapsin1-tdTomato 렌티 바이러스 구조에 대한 C. 차이를 K. Deisseroth 및 S. 이인제 감사, 와이오밍 레옹 기술 지원, 공유, 시약 및 전문 지식에 대한 총리 실험실의 구성원. 이 작품은 ELG에 경쟁력있는 연구 프로그램 (002-082 2008 NRF-CRP NRF)에 따라 연구 재단 싱가포르, 애보트 영양과 ELG에 우수 학술 센터 (ACE) 글락소 스미스 클라인 (GSK)에서 연구 수상에 의해 지원과 GJA, 교육, 과학, 한국의 기술 (교육 과학 기술부) 장관의 재원으로 한국 연구 재단의 세계 수준의 연구소 (WCI) 프로그램 (NRF)에 의해 (NRF 허가 번호 : 2009-003 WCI) GJA에

<ol>
	<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+mapping+of+synaptic+connectivity+using+photostimulation+in+Channelrhodopsin-2+transgenic+mice.">High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).</li><li>Boyden, E. 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No conflicts of interest declared.

Optogenetics 뉴런 (13)의 정의 인구의 활성화를위한 시간과 공간 정밀도를 제공합니다. 실험에서, 현미경의 대물 필드는 전체 ChR2 표현 광 자극에만 피질 뉴런에 30 초 동안 조사 하였다. 이 시냅스 연결이 공동 문화 내에서 뉴런의 서로 다른 집단 사이에 형성되었는지를 우리가 결정하는 것을 허용했다. 우리의 결과는 photostimulation이 뉴런 ChR2을 표현하는 시냅스 대뇌 피질의 뉴런에서 시냅스 입력을받을 것을 증명하는 IPSC 파생 된 신경 세포 PSC 주파수를 증가시키는 것으로 나타났다. 이것은, 차례로, IPSC 유래 신경 성공적 피질 뉴런 회로에 통합하는 것이 확립. 본 공 배양 시스템의 생성을위한 몇몇 중요한 단계가있다. 그것은 도금을 진행하기 전에 마우스 NPC 파생 성상 세포 배양, 최소한의 세포 죽음으로 건강 있는지 확인하는 것이 중요하다다른 세포 유형. 대뇌 피질의 신경 세포와 인간의 NPC 건강 성상 세포에 잘 부착 및 전기 생리학 녹음 배양 조건에 크게 의존한다. 이 프로토콜의 다른 주요 단계는 성상 세포 배양 상에 전기와 대뇌 피질의 뉴런의 도금입니다. 다수의 셀이 전기 천공 후 다이로서, 적어도 6,000,000 피질 신경 세포를 24- 웰 플레이트에서 성상 세포 배양 물에 도금을위한 전기 천공되도록하는 것이 중요하다. 우리는보다 적은 세포 6,000,000 일렉트로 때, 뉴런의 생존 수를 전기 생리 학적 기록에 영향을 치밀 신경 네트워크를 형성하지 않은 것을 발견했다. 각 공동 배양 실험을 상이한 시험의 비교를 허용하기위한 전기 천공 피질 뉴런의 수는 일치한다. 소화 효소를 포함하는 모든 단계의 경우, 너무 오래는 세포 죽음으로 이어질 수 있으므로에 대한 소화 용액에서 세포를 남기지 않도록 필수적이다. 이방법은 다른 신경 세포와 시냅스 접촉을 형성하기 위해 환자 별 섬유 아세포 유래의 신경 세포의 기능을 스크리닝하는데 사용될 수있다. 신경 발달 장애 레트 증후군 (RTT)을 앓고있는 환자에서 섬유 아세포 유래의 신경 세포가 시냅스 전달 결함을 나타낸다 : RTT 뉴런 아마도 인해 덜 시냅스 연결 14 건강한 신경 세포에 비해 PSC 주파수 및 진폭의 상당한 감소를 나타낸다. 우리의 공동 문화 시스템은 발달 결함을 표시하는 신경 세포에 약물 효과를 검사 할 수 있습니다. 이 병에 걸린 사람의 NPC 시드 동안뿐만 아니라 신경 세포의 분화의 시간에 걸쳐 연속 화합물 노광 중에 관심 화합물의 첨가를 통해 수행 될 수있다. 본 공 배양 시스템은 또한 약물 테스트에 대한 모델로서 사용될 수 있지만,이 방법의 한계는 각 후보 화합물의 효과를 조사하는 과정이 길고 지루 수 있다는 것이다그것은 높은 처리량 스크리닝 방법이 아닙니다. 후보 화합물과 치료 후, I​​PSC 파생 뉴런은 개별적으로 PSC를 각 화합물의 효과를 결정하기 위해 패치해야합니다. 또한, 현재 환자의하지 사용할 수있는 많은 섬유 아세포 및 iPSCs있다. 따라서, 환자의 세포를 더 갖고 있으며 높은 처리량 스크리닝이 프​​로토콜을 적응 가까운 미래에 관심이있을 것이다. 예를 들어, 이온 또는 막 전위의 유전자 인코딩 센서 등의 작동 표시와 IPSC 유래의 신경 세포를 라벨링함으로써, 사이드 스테핑 시간이 소요되는 전기 생리 학적 절차에 의해 실질적으로 처리 속도를 높일 수있다. 전기 생리 학적 기록을 수행 아세포 재 프로그래밍에서,이 공존 배양 시스템을 생성하는 전체 프로세스로서, 90 일 이상, 그것은 각각 리 프로그래밍 및 신경 유도 단계 후에, 인간 iPSCs 나 NPC의 하나가 확장 될 것을 권장 필요동결 보존 및 미래 실험에 필요한 시간을 감소시킨다. 우리의 실험에서, 우리는 synapsin1 프로모터에서 대뇌 피질의 신경 세포에 ChR2을 표현했다. 이 프로모터는 팬의 연결이기 때문에, 우리는 아마 모두 억제와 흥분 대뇌 피질의 신경 세포를 photostimulating했다. 미래의 실험의 목적은 구체적으로 흥분성 또는 억제 회로 중 심문하는 경우,보다 특이 적 프로모터가 사용될 수있다. 또한, 대뇌 피질의 신경 세포는 유전자 변형 (또는 바이러스가 주입 된 쥐) ChR2 표현 특별히 신경 세포의 유전자 정의 주민들을 대상으로 얻을 수 있었다. 예를 들어, Cre 호텔 재조합 효소가 마우스에서 수확 대뇌 피질의 조직 ChR2을 표현하는 유일한 대뇌 피질의 신경 세포가 태양 광 발전의 interneurons 15됩니다 상황을 얻을 것입니다 floxed ChR2와 마우스로 교차 parvalbumin 함유의 interneurons (태양 광 발전의 interneurons)로 표현. 이러한 ChR2 발현 우리에서의 interneurons을 공동 CU의 사용lture 시스템 패치 IPSC 유래 뉴런의 PV의 interneurons와 회로에 통합 할 수 있는지 여부의 판단을 가능하게 할 것이다. 이전 연구 (9)을 바탕으로, 대뇌 피질의 신경 세포는 체외 14 일 후에 수상 돌기 겹치는 성숙. photostimulation 패치 된 IPSC 유래 신경 세포 반응을 유발하지 않는 경우 즉, 그것은 뉴런 피질 뉴런과 시냅스 연결을 할 수있는 능력을 갖고 있지 않음을 표시한다. IPSC 파생 된 신경 세포는 다른 IPSC 파생 된 신경 세포 또는 대뇌 피질의 신경 세포에서 하나의 시냅스 입력을 수신 할 수있다. 전통적인 패치 클램프 기록을 사용한 경우, 시냅스 입력이 어디에서 오는 구별 할 수 없을 것이다. 우리의 시스템의 장점은 피질 시냅스 입력에서 시냅스 반응은 선택적으로 유발하고 식별 할 수있다. 여기에 설명 된 절차를 통합하는 IPSC 유래 신경 세포의 능력을 평가하는 간단한 방법을 제공한다정의 된 신경 네트워크에.

최근 몇 년 동안, 신경 세포와 신경 회로 기능에 대한 우리의 이해는 신경 세포의 흥분을 제어하는​​ 여러 optogenetic 도구에 의해 혁명되었습니다. 이러한 도구 중 하나가 빛 활성화 양이온 채널입니다, channelrhodopsin-2 (ChR2) : 가벼운 자극 1-3 응답 ChR2 화재의 활동 전위를 표현하는 뉴런. 신경 세포는 빛에 일반적으로 구분하지 않습니다 때문에,이 놀라운 능력은 뉴런 4의 유전자 정의 인구의 활동의 정확한 시간적 및 공간적 제어를위한 새로운 길을 열어 크게 뇌 기능의 연구를 가속화하고있다. ChR2 신경망 (6)의 활동을 조절에 신경 개발 5 모니터링에서, 서로 다른 목적을위한 줄기 세포 연구에 적용되고있다. 여기서 우리는 신경 세포 공동 배양 시스템의 유용성을 높이기 위해 ChR2을 사용했다. 공동 문화 시스템은 서로 다른 종류의 세포 사이의 상호 작용에 대한 평가를 할 수 있습니다.신경원과 신경교의 공동 배양, 신경계의 주된 세포 유형은 일반적으로 서로 다른 세포 유형 간의 시그널링을 조사 할뿐만 아니라 생리적 반응이 시그널링의 중요성을 평가하기 위해, 손상 및 전파를 조사하는 데 사용 잠재적으로 7 시그널링에 관여하는 분자 메커니즘. 이전 연구는 인간의 iPSCs 쥐 대뇌 피질의 차 문화를 포함하는 신경 세포, 성상 세포, 희소 돌기 아교 세포 및 미세 아교 세포 (8)의 존재에 신경 세포에 매우 빠르게 분화 것으로 나타났다. 이 프로토콜에서 우리는 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)에서 파생 된 쥐의 대뇌 피질의 뉴런과 뉴런 사이의 시냅스 연결을 심문하기 위해 공동 배양 시스템에서 ChR2을 활용하는 방법을 보여줍니다. 우리는 성상 세포로 해부하는 단계와 수확 뇌 조직 (9)뿐만 아니라 마우스 신경 전구 세포를 유지하고 차별화 (NPC들)을 설명하고 인간의 NPC 값 int오 신경 세포 공동 배양 시스템을 만들 수 있습니다. 본 공 배양 시스템을 구축하기 위해, 우리는 오키타 동부 등에 의해 설명 된 통합 무 리 프로그래밍 방법을 사용 하였다. 10 인간 iPSCs를 생성하기. 리 등에 의해 기술 된 바와 같이 선택된 iPSCs는 효율적 소분자 억제제를 사용하여 화학적으로 정의 된 조건에서의 NPC를 분화시켰다. 11 공동 문화에서 신경 세포의 다른 인구 토마토 (tdTomato) 이량 체 형광 단백질, 탠덤를 통해 IPSC 파생 된 신경 세포의 대뇌 피질의 뉴런에서 ChR2 표현의 감지 및 태그를 통해 확인할 수있다. 피질 뉴런의 optogenetic photostimulation와 IPSC 유래 뉴런으로부터 전기 생리 레코딩 결합 서로 회로를 형성하는 뉴런이 두 가지 유형의 능력을 평가할 수있다. 특히, 대뇌 피질의 뉴런 ChR2가 발현의 photostimulation는 시냅스 회로를 형성 IPSC 파생 된 신경 세포의 시냅스 반응을 불러 일으킨다광 여기 대뇌 피질의 신경 세포 네트워크와. 우리는 증가 된 시냅스 후 전류가 실제로 이러한 조건에서 IPSC 파생 된 신경 세포에서 발견되는 것을 보여줍니다. 이 프로토콜은 병 환자로부터 유래의 섬유 아세포를 이용하여 iPSCs 다른 신경 학적 질병 모델의 재현부 포함한 실험 조건 하에서 다양한 시냅스 회로의 평가를 허용한다.

an optogenetic approach for assessing formation of neuronal connections in a co-culture system

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

여기서, 성상 세포로 구성된 공존 배양 생성에 관련된 여러 단계를 설명하는 프로토콜, 및 인간 대뇌 피질 뉴런 뉴런 도시된다. 인간 iPSCs 고밀도 (그림 1A)에서 유지되었다 NPC들 (11)을, 작은 분자 억제제의 칵테일 신경 계통에 에피 솜을 사용하여 섬유 아 세포를 재 프로그래밍하여 얻은 10 벡터 및 지정되었습니다. tdTomato (그림 1B) 태그 인간의 NPC의 성상 세포에 마우스의 NPC의 차별화, ChR2을 표현하는 쥐의 대뇌 피질의 뉴런의 도금 및 시드 : 몇 가지 단계가 공동 문화를 생성해야합니다. 분화 일 2시, 아교 섬유 성 산성 단백질 (GFAP) + 성상 세포는 쉽게 우리의 문화 (그림 1C)에서 관찰 할 수있다. 마우스의 NPC는 성상 세포 단일 층 (그림 1D)에 ChR2을 표현하는 대뇌 피질의 신경 세포를 도금하기 전에 적어도 일주일 차별화시켰다. 3 후인간의 NPC 분화의 사주로, tdTomato + 뉴런은 문화 (그림 1E)에서 검출되었다. 이 공동 문화 시스템은 빛의 자극 (그림 2A)에 대응하여 개별 IPSC 파생 된 신경 세포의 시냅스 전류의 일관성을 검출 할 수있다. 빛에 의해 자극되면, 활동 전위는 ChR2 (그림 2B)를 표현하는 대뇌 피질의 신경 세포에서 생성되었다. 전류 펄스를 탈분극의 진폭 증가 활동 전위 소성을 보여 뉴런도 (그림 2C) 고르기가 있습니다 IPSC 파생 (그림 2D)를 증가 하였다. 따라서, 이들 세포는 성숙한 신경 특성을 나타낸다. 광 부재에서 IPSC 유래 신경 자발 시냅스 입력 (도 2e)을 받았다. GABA 수용체를 통해 전류가 외부 것이기 때문에이 안쪽으로 시냅스 전류는 주로, AMPA 수용체에 의해 매개하고 NMDA 수용체는 전류를 운반하지 않습니다-70 MV의 유지 가능성을 t. 빛 자극이 크게 시냅스 후 전류 (그림 2E)의 주파수를 증가하기 때문에 적어도 이러한 입력의 일부는, ChR2 표현 시냅스 대뇌 피질의 뉴런에서 있었다. 시냅스 입력의 증가의 시간 과정은 그림 2 층에 표시됩니다 : 대뇌 피질의 뉴런의 photostimulation은 30 초 긴 빛 플래시에 걸쳐 지속되었다. ChR2 - 표현 대뇌 피질의 뉴런 (그림 2G) 광 여기 때 PSC를의 주파수가 상승하는 동안, 자신의 진폭 (그림 2H)의 영향을받지이었다. 요약하면, 이러한 결과는 IPSC 파생 된 신경 세포가 성숙한 신경 세포의 특성을 나타내과 연접 대뇌 피질의 뉴런과 시냅스 연결을 형성 할 수 있음을 나타냅니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig1highres.jpg" /> 그림 1 : 공동 문화의 생성을위한 개략도iPSCs 및 NPC들에 신경 유도로 인간의 섬유 아 세포를 재 프로그래밍 시스템. (A) 타임 라인. 대뇌 피질의 신경 세포와 성상 세포 문화에 성숙한 신경 세포로 인간의 NPC의 터미널 차별화를위한 (B) 타임 라인. (C) 마우스의 NPC가 빠르게 GFAP로 분화 + 성상 세포 (2) 후 체외에서 일. (D) 일주 후, ChR2을 표현하는 대뇌 피질의 신경 세포가 GFAP + 성상 세포에 배양 하였다. (E) 4~5주에서 인간의 NPC의 분화 후, 전기 생리학 녹음은 tdTomato + 뉴런에서 수행되었다. 스케일 바는 100 μm의를 나타냅니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig2highres.jpg" /> 그림 2 : 기능 시냅스 연결의 Optogenetic 분석. tdTomato (빨간색) 태그 (A) IPSC 유래 세포는 대뇌 피질의 신경 세포가 발현와 공동 배양 한 빛 활성화채널 ChR2 (녹색). IPSC 파생 된 신경 세포에서 녹음은 대뇌 피질의 신경 세포 또는 다른 IPSC 파생 된 신경 세포 하나에서 올 수 시냅스 전류 (PSC) 응답을 밝혔다. (B) 조명 (파란색 막대)는 ChR2을 표현하는 대뇌 피질의 신경 세포의 활동 전위의 시리즈를 유발. ( C) IPSC 유래 세포 ChR2 - 표현 대뇌 피질의 신경 세포 (E) Photostimulation (파란색 막대). IPSC 파생 된 세포의 전류 곡선 대 D) 발사 (. 전류 주입에 의해 유발 IPSC 파생 된 신경 세포에서 PSC를의 주파수를 증가 . photostimulation 의해 제조 PSC 주파수의 증가 (F) 경시. 블루 바는 photostimulation의 시간을 나타냅니다. PSC 주파수 photostimulation (G) 증가 동안 (G, H), PSC 진폭은 영향을받지 않습니다 (H)이었다. * P &lt;0.05는 학생의 t-test로 대조군에 비해 나타냅니다.

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An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

공동 문화 시스템에 신경 연결의 형성을 평가하기위한 Optogenetic 접근

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

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Developmental Biology

13.3K 조회수.  Duke-NUS Graduate Medical School. A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2. 