Wir danken K. Deisseroth und S. Je nach den ChR2 und Synapsin1-tdTomato lentiviralen Konstrukte bzw. C. Chai für den Austausch von Know-how und das Protokoll auf iPSC Generation, WY Leong für die technische Unterstützung, die Mitglieder der Goh-Labor für den Austausch von Reagenzien und Know-how. Diese Arbeit wurde von Abbott Nutrition and Academic Centre of Excellence (ACE) Forschungspreis von Glaxosmithkline (GSK) zu ELG im Rahmen ihrer wettbewerbsfähiges Forschungsprogramm (NRF 2008 NRF-CRP 002-082) zu ELG, die von der National Research Foundation Singapur und GJA und von der Weltklasse Institute (WCI) Programm der National Research Foundation of Korea (NRF), die vom Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie Korea (MEST) gefördert (NRF Förderkennzeichen: WCI 2009-003) zu GJA

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No conflicts of interest declared.

Optogenetik stellt zeitliche und räumliche Präzision für die Aktivierung von definierten Populationen von Neuronen 13. In unseren Experimenten wurde der gesamte Bereich des Mikroskopobjektivs 30 Sek Photo stimulieren nur kortikalen Neuronen, ChR2 beleuchtet. Dies erlaubte uns, zu bestimmen, ob die synaptische Verbindungen wurden zwischen den verschiedenen Populationen von Neuronen in der Co-Kultur gebildet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Photo erhöht PSC Frequenz in iPS-abgeleitete Neuronen, was zeigt, dass diese Neuronen erhalten synaptischen Input von präsynaptischen Neurone Ausdruck ChR2. Dies wiederum festgestellt, dass die iPSC abgeleiteten Neuronen erfolgreich in Schaltungen mit den kortikalen Neuronen aufgenommen. Es gibt mehrere wichtige Schritte zur Erzeugung des Co-Kultursystem. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Maus NPC abgeleiteten Astrocytenkulturen gesund sind, mit minimalem Zelltod, bevor mit Überzug ausgehendvon anderen Zelltypen. Kortikalen Neuronen und menschlichen NPCs und befestigen auf gesunde Astrozyten und elektrophysiologischen Ableitungen hängen stark von den Kulturbedingungen. Die andere wichtige Schritte in diesem Protokoll sind die Elektroporation und Plattieren von kortikalen Neuronen auf Astrozytenkulturen. Da eine große Anzahl von Zellen nach der Elektroporation sterben, ist es wichtig, sicherzustellen, dass zumindest 6 Millionen kortikalen Neuronen zum Ausplattieren auf Astrocytenkulturen in Platten mit 24 Vertiefungen elektroporiert. Wir haben beobachtet, dass, wenn weniger als 6 Millionen Zellen wurden elektroporiert, die Anzahl der Neuronen, die überlebt haben, nicht einen dichten neuronalen Netzwerk, das elektrophysiologische Aufzeichnungen betroffen bilden. Die Anzahl der durch Elektroporation kortikalen Neuronen sollte auch konsequent sein für jeden Co-Kultur-Experiment Vergleich zwischen unterschiedlichen Studien zu ermöglichen. Für alle Schritte, welche die enzymatische Verdauung, ist es wesentlich, die nicht an Zellen in Verdauungslösung zu lange, weil es zum Zelltod führen lassen. DieseAnsatz kann verwendet werden, um die Fähigkeit von Neuronen aus patientenspezifischen Fibroblasten synaptische Kontakte mit anderen Neuronen bilden screenen. Neuronen aus Fibroblasten von Patienten mit der Erkrankung des Nervensystems Rett-Syndrom (RTT) abgeleitet aufweisen synaptischen Übertragung Defekte: RTT Neuronen zeigen eine signifikante Abnahme der PSC Frequenz und Amplitude im Vergleich zu gesunden Neuronen, was vermutlich auf weniger synaptischer Verbindungen 14. Unsere Co-Kultursystem erlaubt die Untersuchung der Wirkung von Medikamenten auf Neuronen anzeigt Entwicklungsdefekte. Dies kann durch Zugabe von Verbindungen von Interesse bei der Aussaat von erkrankten menschlichen NSC sowie bei kontinuierlicher Exposition zu Verbindungen der ganzen Zeit der neuronalen Differenzierung durchgeführt werden. Während diese Co-Kultursystem kann auch als Modell für Drogentests verwendet werden, ist eine Einschränkung bei diesem Ansatz, dass der Prozess der Untersuchung der Auswirkungen der einzelnen Kandidatenverbindung kann lang und mühsam sein, wiees ist nicht ein Hochdurchsatz-Screening-Verfahren. Nach der Behandlung mit Wirkstoffkandidaten haben iPSC abgeleiteten Neuronen einzeln gepatcht werden, um die Auswirkungen der einzelnen Verbindungen auf PSCs zu bestimmen. Darüber hinaus gibt es noch nicht viele vorhanden Fibroblasten und iPS-Zellen von Patienten. Daher wird es von Interesse, in der nahen Zukunft sein, mehr Patientenzellen und auch auf dieses Protokoll für Hochdurchsatz-Screening angepasst werden. Zum Beispiel durch Markierung iPSC abgeleiteten Neuronen mit einem Indikator, wie beispielsweise genetisch codierten Sensoren von Ionen oder des Membranpotentials, wäre es möglich, die Durchlaufgeschwindigkeit im Wesentlichen durch Seitenschritt die zeitraubelektrophysiologische Prozedur zu erhöhen. Da der gesamte Vorgang der Erzeugung dieses Co-Kultursystem, von Umprogrammierung Fibroblasten zur Durchführung elektrophysiologischen Ableitungen, benötigt mehr als 90 Tage, ist es empfehlenswert, entweder die menschlichen iPSCs oder NSC erweitert werden, nach der Umprogrammierung und neurale Induktion Schritte jeweilsund kryokonserviert, um die Zeit für zukünftige Experimente nötig zu verringern. In unseren Experimenten haben wir ausgedrückt ChR2 in kortikalen Neuronen unter synapsin1 Promotors. Da dieser Promotor pan-neuronalen wir vermutlich wurden beide hemmenden und erregenden kortikalen Neuronen photostimulating. Wenn das Ziel der zukünftigen Experimenten ist, spezifisch abzufragen entweder inhibitorisch oder exzitatorischer Schaltungen könnten spezifischeren Promotoren verwendet werden. Alternativ könnte kortikalen Neuronen aus transgenen (oder Virus-injizierten Mäusen) wobei ChR2 Expression spezifisch genetisch definierte Subpopulationen von Neuronen gezielt erhalten werden. Zum Beispiel, Ernte kortikalen Gewebe von einer Maus, die Cre-Rekombinase hat ausgedrückt in Parvalbumin haltige Inter (PV Inter), die mit einer Maus mit floxed ChR2 gekreuzt ist eine Situation, in der nur kortikalen Neuronen, ChR2 wird PV Inter 15 werden erhalten. Die Verwendung solcher ChR2-exprimierenden Inter in unserer gleichzeitig culture System ermöglichen die Bestimmung, ob ein patched iPSC abgeleiteten Neuron ist in der Lage, in einen Stromkreis mit PV Inter integrieren. Basierend auf einer früheren Studie 9, sind kortikalen Neuronen reifen mit überlappenden Dendriten nach 14 Tagen in vitro. Wenn also die Photo keine Antwort von einem patched iPSC abgeleiteten Neuron hervorrufen sollte darauf hinweisen, dass das Neuron nicht die Fähigkeit, synaptische Verbindungen mit kortikalen Neuronen zu machen. Ein iPSC abgeleiteten Neuron kann synaptischen Eingang entweder von anderen iPSC abgeleiteten Neuronen oder kortikalen Neuronen empfangen. Wenn traditionelle Patch-Clamp-Messungen verwendet wurden, wäre es nicht möglich, zu unterscheiden, wo das synaptische Eingabe kommt. Der Vorteil unseres Systems ist die postsynaptische Reaktionen aus kortikalem präsynaptischen Eingang selektiv evozierten und identifiziert werden. Die hier beschriebenen Verfahren bieten einen einfachen Einstieg in die Fähigkeit der iPS-abgeleiteten Neuronen bewerten zu integrierenin einen definierten neuronalen Netzwerks.

In den letzten Jahren haben unser Verständnis des Neurons und der neuronalen Schaltungsfunktion durch mehrere optogenetische Werkzeuge, die neuronale Erregbarkeit steuern revolutioniert. Ein solches Instrument ist das Licht-aktivierten Kationen-Kanal, Channelrhodopsin-2 (ChR2): Neuronen, ChR2 Feuer Aktionspotentiale in Reaktion auf Lichtstimulation 1-3. Da Neuronen normalerweise nicht empfindlich auf Licht, öffnet sich diese bemerkenswerte Fähigkeit neue Wege für die genaue zeitliche und räumliche Steuerung der Aktivität von genetisch definierten Populationen von Neuronen 4 und hat sich stark beschleunigt Studien der Hirnfunktion. ChR2 wurde angewandt, um Zellforschung für verschiedene Zwecke ergeben, von der Überwachung der neuronalen Entwicklung 5 bis Regulierung Aktivität neuronaler Netzwerke 6. Hier ChR2 verwendet wir, um die Nützlichkeit eines neuronalen Cokultursystem erhöhen. Co-Kultur-Systeme ermöglichen die Bewertung von Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen.Co-Kulturen von Neuronen und Gliazellen, die Hauptzelltypen des Nervensystems werden häufig verwendet, um zu untersuchen Signalisierung zwischen den verschiedenen Zelltypen, sowie die Bedeutung dieser Signalisierung für physiologische Reaktionen zu bewerten, die Ausbreitung des Schadens und die Studie molekularen Mechanismen, die möglicherweise in dieser Signal 7 beteiligt sind. Eine frühere Untersuchung zeigte, dass menschliche iPSCs unterscheiden sich sehr schnell in die Neuronen in Gegenwart von Rattenkortexprimärkultur enthält Neuronen, Astrozyten, Oligodendrozyten und Mikroglia 8. In diesem Protokoll zeigen wir eine Methode, die ChR2 nutzt in einer Co-Kultursystem zur synaptischen Verbindungen zwischen Ratte kortikalen Neuronen und Neuronen aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) abgeleitet verhören. Wir beschreiben Schritte zu zerlegen und zu ernten Hirngewebe 9 sowie zu pflegen und zu differenzieren Maus neurale Vorläuferzellen (NPCs) in Astrozyten und menschlichen NPCs into Neuronen, die Co-Kultursystem zu schaffen. Um diese Co-Kultursystem zu etablieren, haben wir die von Okita et al Integration freie Umprogrammierung Verfahren. 10 die menschliche iPS-Zellen zu erzeugen. Diese iPS-Zellen wurden dann effizient in NPCs in chemisch definierten Bedingungen differenziert mit niedermolekularen Inhibitoren wie von Li et al. 11 In den Co-Kulturen können die verschiedenen Populationen von Neuronen über Erkennung des ChR2 Expression in kortikale Neuronen und Markierung von iPSC abgeleiteten Neuronen über das fluoreszierende Protein, tandem-Dimer Tomate (tdTomato) identifiziert werden. Kombinieren elektrophysiologische Aufzeichnungen von iPSC abgeleiteten Neuronen mit optogenetische Photo der kortikalen Neuronen ermöglicht Einschätzung der Fähigkeit dieser zwei Arten von Neuronen zu einander bilden. Insbesondere Photo von ChR2-exprimierenden kortikalen Neuronen hervorrufen synaptischen Antworten in iPS-abgeleitete Neuronen, die synaptischen Schaltungen gebildet habenmit der photo kortikalen Neuronen-Netzwerk. Wir zeigen, dass erhöhte postsynaptische Ströme sind in der Tat in iPS-abgeleiteten Neuronen unter diesen Bedingungen erkannt werden. Dieses Protokoll ermöglicht die Beurteilung der synaptischen Schaltung unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen einschließlich Rekapitulation verschiedenen neurologischen Erkrankungsmodellen unter Verwendung iPSCs von Fibroblasten aus Patienten mit Morbus abgeleitet.

an optogenetic approach for assessing formation of neuronal connections in a co-culture system

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

Hier wird ein Protokoll der mehreren Schritte beim Erzeugen einer Co-Kultur, die aus Astrozyten beteiligt beschreiben, kortikale Neuronen und humanen Neuronen dargestellt. Menschen iPSCs wurden durch Neuprogrammierung Fibroblasten mit episomalen erhalten Vektoren 10 und spezifiziert in ein neuronales Linie mit einem Cocktail aus niedermolekularen Inhibitoren, so dass NPCs 11, die bei hoher Dichte (1A) gehalten wurden. Mehrere Schritte sind nötig, um die Co-Kultur zu generieren: Differenzierung von Maus-NPCs in Astrozyten, Beschichtung der Ratte kortikalen Neuronen, ChR2, und Aussaat der menschlichen NPCs mit tdTomato (1B) markiert. An Tag 2 der Differenzierung, können saure Gliafaserprotein (GFAP) + Astrozyten ohne weiteres in unseren Kulturen (1C) zu beachten. Maus NSC wurden für mindestens eine Woche vor dem Beschichten unterscheiden kortikalen Neuronen, ChR2 in die Astrozyten Monoschicht (1D). Nach 3bis 4 Wochen menschlicher NPC Differenzierung wurden tdTomato + -Neuronen in Kulturen (1E) detektiert. Diese Co-Kultursystem ermöglicht die konsistente Erfassung der postsynaptischen Ströme von einzelnen iPSC abgeleiteten Neuronen in Reaktion auf Lichtstimulation (2A). Wenn sie durch Licht angeregt wurden Aktionspotentiale in kortikalen Neuronen, ChR2 (2B) erzeugt wird. iPSC abgeleiteten Neuronen auch erregbaren (2C), welche erhöhte neuronaler Aktivität als die Amplitude der depolarisierenden Stromimpulse erhöht wurde (2D). Damit diese Zellen reife neuronale Eigenschaften. In der Abwesenheit von Licht, empfangen iPSC abgeleiteten Neurone spontan synaptischen Eingaben (2E). Diese inneren postsynaptischen Ströme wurden überwiegend von AMPA-Rezeptoren vermittelt, da Ströme durch GABA-Rezeptoren würde nach außen und NMDA-Rezeptoren tragen keine aktuellen eint die Haltepotential von -70 mV. Mindestens einige dieser Eingänge den von präsynaptische kortikale Neuronen, ChR2, weil Lichtstimulation der Frequenz des postsynaptischen Ströme (2E) stark erhöht. Der Zeitverlauf der Erhöhung der synaptischen Eingang in 2F dargestellt: Photo der kortikalen Neuronen wurde während des 30 s langen Lichtblitz aufrechterhalten. Während die Frequenz der PSCs wurde erhöht, wenn ChR2-exprimierende Neurone wurden photostimulierte (Figur 2G), war ihre Amplitude unbeeinflusst (Figur 2H). Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass die iPS-abgeleiteten Neuronen zeigte reife neuronale Eigenschaften und könnte synaptischen Verbindungen mit präsynaptischen Neurone zu bilden. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig1highres.jpg" /> Abbildung 1: Schematische Darstellung zur Erzeugung KokulturSystem. (A) Timeline zur Umprogrammierung menschlichen Fibroblasten in iPS-Zellen und neurale Induktion an NPCs. (B) Zeitleiste für die terminale Differenzierung der menschlichen NPCs zu reifen Neuronen auf kortikalen Neuronen und Astrozyten-Kulturen. (C) Maus NPCs schnell in GFAP unterscheiden + Astrozyten nach 2 Tagen in vitro. (D) nach einer Woche kortikalen Neuronen, ChR2 wurden auf GFAP + Astrozyten bei 4 bis 5 Wochen nach der Differenzierung menschlicher NSC plattiert. (E), wurden elektrophysiologische Aufzeichnungen auf tdTomato + Neuronen durchgeführt. Maßstabsbalken entspricht 100 &amp; mgr; m. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig2highres.jpg" /> Abbildung 2: optogenetische Analyse der funktionalen synaptischer Verbindungen. (A) iPS-abgeleiteten Zellen mit tdTomato (rot) markiert waren mit kortikalen Neuronen, co-kultiviert das lichtaktivierteKanal, ChR2 (grün). Aufnahmen aus iPS-abgeleiteten Neuronen zeigte postsynaptischen Strom (PSC) Antworten, die entweder von den kortikalen Neuronen oder andere iPSC abgeleiteten Neuronen kommen könnte. (B) Beleuchtung (blauer Balken) rief eine Reihe von Aktionspotentialen in kortikalen Neuronen, ChR2. ( C) iPS-abgeleiteten Zellen sind durch Strominjektion hervorgerufen. (D) Brenn vs Stromkurve von iPS-Zellen abgeleitet. (E) Photostimulation der ChR2-exprimierenden kortikalen Neuronen (blauer Balken) erhöht die Frequenz der PSCs in iPS-abgeleiteten Neuronen . (F) den zeitlichen Verlauf der Zunahme der PSC Frequenz durch Ausleuchtung erzeugt. Blaue Balken zeigt die Zeit der Photostimulation. (G, H) Während PSC Frequenz wurde durch Photo (G) erhöht wird, PSC Amplitude unverändert war (H). * Zeigt Ihnen, p &lt;0,05 im Vergleich zu mit Student-t-Test zu kontrollieren.

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An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Ein optogenetische Ansatz zur Abschätzung Bildung neuronaler Verbindungen in einer Co-Kultursystem

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

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Developmental Biology

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