Agradecemos K. Deisseroth e S. Je para as construções de lentivírus ChR2 e Synapsin1-tdTomato respectivamente, C. Chai para a partilha de conhecimentos e na geração de protocolo iPSC, WY Leong para o suporte técnico, membros do laboratório Goh para reagentes e experiência de compartilhamento. Este trabalho foi financiado pela Abbott Nutrition e do Centro Acadêmico de Excelência (ACE) prêmio de pesquisa da GlaxoSmithKline (GSK) para ELG, pela Fundação de Pesquisa Nacional de Cingapura no âmbito do seu Programa de Pesquisa Competitiva (NRF 2008 NRF-CRP 002-082) para ELG e GJA, e pelo Instituto de Classe Mundial (WCI) Programa da Fundação Nacional da Coreia Pesquisa (NRF), financiado pelo Ministério da Educação, Ciência e Tecnologia da Coreia (MEST) (NRF Grant Number: WCI 2009-003) para GJA

<ol>
	<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+mapping+of+synaptic+connectivity+using+photostimulation+in+Channelrhodopsin-2+transgenic+mice.">High-speed mapping of synaptic connectivity using photostimulation in Channelrhodopsin-2 transgenic mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (19), 8143-8148 (2007).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2,+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel.">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li><li>Zhang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Stroh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+stem+cell+differentiation+in+the+setting+of+automated+optogenetic+stimulation.">Tracking stem cell differentiation in the setting of automated optogenetic stimulation.</a> Stem Cells. 29 (1), 78-88 (2011).</li><li>Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, S. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryonic+stem+cell-derived+neurons+adopt+and+regulate+the+activity+of+an+established+neural+network.">Human embryonic stem cell-derived neurons adopt and regulate the activity of an established neural network.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (50), 20189-20194 (2011).</li><li>Viviani, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+coculture+of+neurons+and+glial+cells.">Preparation and coculture of neurons and glial cells.</a> Curr Protoc Cell Biol. 32, 2.7.1-2.7.2.1 (2006).</li><li>Braun, H., G&#252;nther-Kern, A., Reymann, K., Onteniente, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+of+human+iPS-cells+in+a+rat+cortical+primary+culture.">Neuronal differentiation of human iPS-cells in a rat cortical primary culture.</a> Acta Neurobiologiae Experimentalis. 72 (30), 219-229 (2012).</li><li>Shivaraj, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Taurine+induces+proliferation+of+neural+stem+cells+and+synapse+development+in+the+developing+mouse+brain.">Taurine induces proliferation of neural stem cells and synapse development in the developing mouse brain.</a> PLoS ONE. 7, e42935 (2012).</li><li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+more+efficient+method+to+generate+integration-free+human+iPS+cells.">A more efficient method to generate integration-free human iPS cells.</a> Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+induction+and+long-term+self-renewal+of+primitive+neural+precursors+from+human+embryonic+stem+cells+by+small+molecule+inhibitors.">Rapid induction and long-term self-renewal of primitive neural precursors from human embryonic stem cells by small molecule inhibitors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (20), 8299-8304 (2011).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (50), 424-429 (2011).</li><li>Packer, A. M., Roska, B., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+neurons+and+photons+for+optogenetics.">Targeting neurons and photons for optogenetics.</a> Nature Neuroscience. 16 (7), 805-815 (2013).</li><li>Marchetto, M. C. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+Syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A Model for neural development and treatment of Rett Syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li><li>Asrican, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transgenic+mice+for+optogenetic+analysis+of+neural+circuits.">Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits.</a> Frontiers in Neural Circuits. 7, 160 (2013).</li></ol>

No conflicts of interest declared.

Optogenética fornece precisão temporal e espacial para a ativação de populações de neurônios 13. Em nossos experimentos, todo o campo da objetiva do microscópio foi iluminado por 30 s para foto-estimular apenas neurônios corticais que expressam ChR2. Isso nos permitiu determinar se conexões sinápticas foram formados entre diferentes populações de neurônios dentro do co-cultura. Nossos resultados revelaram que fotoestimulação aumenta freqüência PSC em neurônios iPSC derivados, o que demonstra que esses neurônios recebem a entrada sináptica dos neurônios corticais pré-sinápticos que expressam ChR2. Este, por sua vez, demonstrado que os neurónios iPSC derivados incorporados com sucesso em circuitos com os neurónios corticais. Existem vários passos críticos para a geração deste sistema de co-cultura. É importante assegurar que as culturas de astrócitos de rato NPC-derivados são saudáveis, com a morte celular mínima, antes de prosseguir com chapeamentode outros tipos de células. Os neurônios corticais e NPCs humanos atribuem bem em astrócitos saudáveis ​​e registros eletrofisiológicos dependem fortemente das condições de cultivo. As outras etapas fundamentais neste protocolo são a eletroporação e chapeamento de neurônios corticais em culturas de astrócitos. Como um grande número de células morrem após a electroporação, é importante para assegurar que, pelo menos, 6 milhões de neurónios corticais são electroporadas para placas com as culturas de astrócitos em placas de 24 poços. Temos observado que, quando menos do que 6 milhões de células foram electroporadas, o número de neurónios que sobrevivem não formar uma rede neuronal densa, que afectou registos electrofisiolicos. O número de neurônios corticais eletroporados também deve ser consistente para cada experimento co-cultura para permitir a comparação entre os diferentes estudos. Para todas as etapas que envolvem a digestão enzimática, é essencial para não deixar as células em solução digestivo durante muito tempo, pois pode levar à morte da célula. Esteabordagem pode ser utilizada para rastrear a capacidade de neurónios derivados de fibroblastos específicos do paciente para formar contactos sinápticos com outros neurónios. Os neurónios derivados de fibroblastos de pacientes que sofrem da perturbação do neurodesenvolvimento síndrome de Rett (RTT) apresentam defeitos de transmissão sináptica: RTT neurónios apresentam uma redução significativa na frequência e amplitude de PSC comparada com os neurónios saudáveis, presumivelmente devido à menor conectividade sináptica 14. Nosso sistema de co-cultura permite o exame dos efeitos da droga sobre os neurônios que apresentam defeitos de desenvolvimento. Isto pode ser realizado por meio de adição de compostos de interesse durante a semeadura de NPCs humanos doentes, bem como durante a exposição contínua a compostos ao longo do tempo de diferenciação neuronal. Embora este sistema de co-cultura pode também ser utilizada como um modelo para o teste da droga, uma limitação desta abordagem é que o processo de investigar os efeitos de cada composto candidato pode ser longo e tedioso quantonão é um método de rastreio de alto rendimento. Após o tratamento com compostos candidatos, os neurónios derivados de iPSC tem que ser corrigido individualmente para determinar os efeitos de cada composto sobre PSCs. Além disso, atualmente há não muitos fibroblastos disponíveis e iPSCs de pacientes. Portanto, será de interesse em um futuro próximo para ter mais células do paciente e também para adaptar este protocolo para triagem de alto rendimento. Por exemplo, por marcação de neurónios iPSC derivados com um indicador de actividade, tais como sensores geneticamente codificados de iões, ou o potencial de membrana, seria possível aumentar a taxa de produção substancialmente pelo procedimento electrofisiológico demorado-pisar lado. Como todo o processo de gerar este sistema de co-cultura, a partir de fibroblastos de reprogramação para executar registos electrofisiolicos, requer mais do que 90 dias, recomenda-se que tanto os iPSCs humanos ou NPCs ser expandida, após a reprogramação e etapas de indução neural respectivamente,e criopreservadas para reduzir o tempo necessário para experiências futuras. Em nossos experimentos, nós expressamos ChR2 em neurônios corticais sob o promotor synapsin1. Porque este promotor é pan-neuronal, que presumivelmente foram photostimulating ambos os neurônios corticais inibitórios e excitatórios. Se o objectivo de experiências futuras é interrogar especificamente circuitos ou inibitórios ou excitatórios, promotores mais específicos podem ser usados. Como alternativa, os neurônios corticais poderia ser obtido a partir de transgênicos (ou injetada-virus ratos) onde a expressão ChR2 é especificamente orientada para as subpopulações geneticamente definidos de neurônios. Por exemplo, os tecidos corticais colheita de um rato que tem Cre recombinase expressa em interneurons contendo parvalbumina (Interneurônios PV) que é cruzada com um mouse com floxed ChR2 renderá uma situação em que os únicos neurônios corticais que expressam ChR2 será interneurons PV 15. O uso de tais ChR2-expressando interneurónios no nosso pedido co-cuLTURE sistema permitirá a determinação de se um neurônio iPSC derivado remendada é capaz de incorporar em um circuito com interneurons PV. Com base em um estudo anterior 9, os neurônios corticais são maduros com sobreposição de dendrites após 14 dias in vitro. Assim, se fotoestimulação não desencadeia uma resposta de um neurónio iPSC derivado de patched, deve indicar que o neurónio não tem a capacidade para fazer ligações sinápticas com neurónios corticais. Um neurônio iPSC derivada é capaz de receber a entrada sináptica ou de outros neurônios iPSC derivados ou neurônios corticais. Se foram utilizadas gravações de sujeição do emplastro tradicional, não seria possível distinguir onde a entrada sináptica é proveniente. A vantagem do nosso sistema é que as respostas pós-sinápticos de entrada presynaptic cortical pode ser evocado seletivamente e identificados. Os procedimentos descritos aqui fornecer uma abordagem simples para avaliar a capacidade dos neurônios iPSC derivados de integrarnuma rede neuronal definido.

Nos últimos anos, a nossa compreensão do neurônio e função do circuito neuronal foram revolucionou por várias ferramentas Optogenetic que controlam a excitabilidade neuronal. Uma dessas ferramentas é o canal de cátions ativado por luz, channelrhodopsin-2 (ChR2): neurônios que expressam ChR2 potenciais de ação fogo em resposta à estimulação de luz 1-3. Porque os neurónios não são normalmente sensíveis à luz, esta capacidade notável abre novos caminhos para o controlo temporal e espacial exacta da actividade de populações geneticamente definidas de neurónios 4 e tem estudos da função cerebral grandemente acelerada. ChR2 foi aplicada a investigação em células estaminais para fins diferentes, de acompanhamento do desenvolvimento neuronal 5 a atividade de redes neurais 6 regulação. Aqui usamos ChR2 para aumentar a utilidade de um sistema de co-cultura neuronal. Sistemas de co-cultura permitir a avaliação das interações entre os diferentes tipos de células.Co-culturas de neurónios e células da glia, os principais tipos de células do sistema nervoso, são comumente usados ​​para investigar a sinalização entre estes tipos de células diferentes, bem como para avaliar a significância do presente sinalização para respostas fisiológicas, a propagação de danos e para examinar o mecanismos moleculares que estão potencialmente envolvidos no presente sinalização 7. Um estudo prévio revelou que iPSCs humanos diferenciar-se em neurónios muito rapidamente na presença de meio de cultura contendo os neurónios corticais de rato primários, astrócitos, oligodendrócitos, microglia e 8. Neste protocolo, demonstramos um método que utiliza ChR2 em um sistema de co-cultura para interrogar conexões sinápticas entre os neurônios e neurônios corticais de rato derivadas de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs humanos). Nós descrevemos etapas para dissecar e colheita tecidos cerebrais 9, bem como para manter e diferenciar as células progenitoras neurais de rato (NPCs) em astrócitos e NPCs humanos intO neurónios para criar o sistema de co-cultura. Para estabelecer este sistema de co-cultura, foi utilizado o método de reprogramação sem integração descrito por Okita et al. 10 para gerar iPSCs humanos. Estes foram, em seguida, de forma eficiente iPSCs diferenciadas em NPCs em condições quimicamente definidas utilizando inibidores de moléculas pequenas, tal como descrito por Li et al. 11 Na co-culturas, as diferentes populações de neurónios podem ser identificados através de detecção de expressão ChR2 em neurónios corticais e de marcação de neurónios iPSC derivados através da proteína fluorescente, em tandem dímero de tomate (tdTomato). Combinando registos electrofisiolicos de neurónios iPSC derivados com fotoestimulação optogenetic dos neurónios corticais permite avaliar a capacidade destes dois tipos de neurónios para formar circuitos uns com os outros. Especificamente, fotoestimulação de ChR2 expressando neurônios corticais evocar respostas sinápticas em neurônios iPSC derivados que se formaram circuitos sinápticoscom a rede de neurônios corticais photostimulated. Nós demonstramos que o aumento correntes pós-sinápticos são realmente detectado em neurônios iPSC derivados sob tais condições. Este protocolo permite a avaliação de circuitos sináptica sob uma variedade de condições experimentais, incluindo recapitulação dos diferentes modelos de doenças neurológicas usando iPSCs derivadas a partir de fibroblastos de pacientes com a doença.

an optogenetic approach for assessing formation of neuronal connections in a co-culture system

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

Aqui, um protocolo descrevendo os vários passos envolvidos na geração de uma co-cultura consistindo astrócitos, os neurónios corticais e neurónios humanos é ilustrado. IPSCs humano foram obtidas através da reprogramação de fibroblastos utilizando vectores epissomais 10 e especificada na linhagem neural com um cocktail de inibidores de moléculas pequenas, tornando NPCs 11 que foram mantidas a uma densidade elevada (Figura 1A). Vários passos são necessários para gerar a co-cultura: diferenciação dos NPCs do mouse em astrócitos, chapeamento de neurônios corticais de ratos que expressam ChR2, e semeadura de NPCs humanos marcados com tdTomato (Figura 1B). No dia 2 de diferenciação, proteína ácida fibrilar glial (GFAP) + astrócitos podem ser facilmente observadas nas nossas culturas (Figura 1C). Rato NPCs foram deixadas diferenciar durante pelo menos uma semana antes do plaqueamento neurónios corticais que expressam ChR2 sobre a monocamada de astrócitos (Figura 1D). Após 34 semanas de diferenciação NPC humano, tdTomato + neurónios foram detectados nas culturas (Figura 1E). Este sistema de co-cultura permite a detecção de correntes coerentes de neurónios pós-sinápticos iPSC derivados individuais em resposta à estimulação luminosa (Figura 2A). Quando estimulada por luz, potenciais de acção foram gerados em neurónios corticais que expressam ChR2 (Figura 2B). iPSC-neurónios derivados também são excitáveis ​​(Figura 2C), que mostra o aumento da acção de disparo potencial como a amplitude de despolarização impulsos de corrente foi aumentada (Figura 2D). Assim, estas células exibem propriedades neuronais maduros. Na ausência de luz, os neurónios derivados de iPSC recebido entradas sinápticas espontâneas (Figura 2E). Estas correntes dentro pós-sinápticos foram predominantemente mediado por receptores AMPA, porque as correntes através de receptores GABA seria ida e receptores NMDA não carregam uma correnteta segurando potencial de -70 mV. Pelo menos alguns desses insumos eram de neurônios corticais pré-sinápticos que expressam ChR2, porque a estimulação de luz aumentou consideravelmente a frequência das correntes pós-sinápticos (Figura 2E). O tempo de este aumento na entrada sináptica é mostrado na Figura 2F: fotoestimulação dos neurônios corticais foi sustentado ao longo do 30 seg longo luz do flash. Embora a frequência das unidades de atendimento foi elevada quando ChR2 expressando neurônios corticais foram photostimulated (Figura 2G), a sua amplitude não foi afetada (Figura 2H). Em resumo, estes resultados indicam que os neurônios iPSC derivados exibiu propriedades neuronais maduras e poderia formar conexões sinápticas com neurônios corticais pré-sinápticos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig1highres.jpg" /> Figura 1: diagramas esquemáticos para a geração de co-cultura(A) Timeline sistema. para a reprogramação fibroblastos humanos em iPSCs e indução neural para NPCs. (B) Timeline para diferenciação terminal de NPCs humanos em neurônios maduros sobre corticais neurônios e astrócitos culturas. (C) rato NPCs diferenciar rapidamente em GFAP + astrócitos após 2 dias in vitro. (D) Após uma semana, os neurónios corticais que expressam ChR2 foram plaqueadas em astrócitos GFAP +. (E) com 4 a 5 semanas após a diferenciação de NPCs humanos, registos electrofisiolicos foram efectuados em tdTomato + neurónios. Barras de escala representam 100 um. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig2highres.jpg" /> Figura 2: Análise Optogenetic de conectividade sináptica funcional. (A) derivado de células iPSC marcados com tdTomato (vermelho) foram co-cultivadas com os neurónios corticais que expressa o activado pela luzcanal, ChR2 (verde). Gravações de neurônios iPSC derivados revelou atuais (PSC) respostas pós-sinápticos, o que poderia vir de qualquer neurônios corticais ou outros neurônios iPSC derivados. (B) Iluminação (barra azul) provocou uma série de potenciais de ação em neurônios corticais que expressam ChR2. ( células C) iPSC derivados são evocadas por injecção de corrente. (D) Firing vs curva de corrente de células iPSC derivados. (E) fotoestimulação dos neurônios corticais ChR2 expressando (barra azul) aumentou a freqüência de unidades de atendimento em neurônios iPSC derivadas . Claro que (F) Hora do aumento na freqüência PSC produzido por fotoestimulação. Barra azul indica o tempo de fotoestimulação. (G, H) Enquanto frequência CPS foi aumentada por fotoestimulação (G), a amplitude do PSC não foi afectada (H). * Indica p &lt;0,05 comparado com o controlo com o teste t de estudante.

Watch this Scientific Journal Video about An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System at JoVE.com

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

Uma Abordagem Optogenetic para Avaliar Formação das conexões neuronais em um sistema de co-cultura

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

an-optogenetic-approach-for-assessing-formation-neuronal-connections

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.3K visualizações.  Duke-NUS Graduate Medical School. A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2. 