私たちは、IPSCの生成に関する専門知識とプロトコルを共有するため、それぞれにChR2とシナプシン-tdTomatoレンチウイルス構築物についてC.チャイをK. DeisserothとS.帝に感謝し、ワイオミング州レオン技術サポートのために、共有試薬および専門知識のためのゴーラボのメンバー。この作品は、ELGにその競争的研究プログラム（002から082 2008 NRF-CRP NRF）の下で国立研究財団シンガポールにより、アボット栄養とELGに優秀の学術センター（ACE）グラクソ·スミスクライン（GSK）から研究賞によってサポートされていましたし、 GJAへ：GJA、及び文部科学省によって資金を供給韓国国立研究財団（NRF）のワールドクラス研究所（WCI）プログラムで、韓国の科学技術（MEST）（WCI 2009-003 NRF認可番号）

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No conflicts of interest declared.

光遺伝学は、ニューロン13の定義された集団の活性化のための時間的·空間的な精度を提供します。我々の実験では、顕微鏡対物レンズの全視野は、光刺激のChR2を発現するだけ皮質ニューロンを30秒間照射した。これは、私たちは、シナプスの接続は、共培養内のニューロンの異なる集団の間に形成されたかどうかを判断することができました。我々の結果は、これらのニューロンがChR2をを表現するシナプス前皮質ニューロンからシナプス入力を受け取ることを示している、光刺激はIPSC由来の神経細胞でPSC周波数を増大させることを明らかにした。これは、順番に、IPSC由来の神経細胞が正常に皮質ニューロンを持つ回路に組み込まれていることを確立した。 この共培養系を生成するためのいくつかの重要なステップがある。これは、メッキを進める前に、最小限の細胞死に、マウスNPC由来の星状細胞培養が健康であることを確認することが重要です他の種類の細胞。皮質ニューロンと人間のNPCは健康的なアストロサイト上によく付着し、電気生理学的記録は、培養条件に大きく依存しています。このプロトコルの他の重要なステップは、星状細胞培養へのエレクトロポレーションおよび皮質ニューロンのメッキです。多数の細胞がエレクトロポレーション後に死滅したように、少なくとも600万皮質ニューロンを、24ウェルプレート中で星状細胞培養上にメッキする電気穿孔されることを保証することが重要である。私たちは、より少ない600万人以上の細胞をエレクトロポレーションした時、生き残るニューロンの数は、電気生理学的記録に影響を与えた密な神経回路網を形成していなかったことを観察した。エレクトロポレーション皮質ニューロンの数は、異なる研究間の比較を可能にするために、各共培養実験のための一貫している必要があります。酵素消化に関与するすべての手順については、それはあまりにもあれば細胞死につながる可能性があるために、消化液中で細胞を残さないことが不可欠である。 このアプローチは、他のニューロンとのシナプス接触を形成するために、患者固有の線維芽細胞から誘導された神経細胞の能力をスクリーニングすることができる。神経発達障害、レット症候群（RTT）に罹患している患者からの線維芽細胞から誘導されたニューロンは、シナプス伝達の欠陥を示す：RTTニューロンは、おそらく少ないシナプス接続14に、健康なニューロンに比べPSC周波数及び振幅の有意な減少を示す。我々の同時培養系は発達障害を表示するニューロンに対する薬物効果の検査を可能にする。これは、罹患した人間のNPCの播種の間、並びに神経分化の時間にわたって化合物への連続暴露中に目的の化合物の添加によって行うことができる。 この共培養系はまた、薬物試験のためのモデルとして使用することができるが、このアプローチの限界は、各候補化合物の効果を調査するプロセスは長くとして面倒であることであるそれは、ハイスループットスクリーニング法ではない。候補化合物で処理した後、IPSC由来のニューロンは、個別のPSCの各化合物の効果を決定するためにパッチを適用する必要があります。また、患者から多くの利用可能な線維芽細胞およびiPS細胞は、現在、存在しない。したがって、より多くの患者の細胞を有し、また、ハイスループットスクリーニングのためにこのプロトコルを適応させるために、近い将来において重要であろう。例えば、このようなイオンまたは膜電位の遺伝的にコードセンサーとして動作インジケータとIPSC由来のニューロンを標識することにより、サイドステッピング時間のかかる電気生理学的手順をすることにより、実質的にスループットレートを増大させることが可能であろう。電気生理学的記録を実行する線維芽細胞を再プログラミングから、この共培養系を生成するプロセス全体としては、90日以上、それはそれぞれのリプログラミングや神経誘導ステップの後、人間性IPSCまたはNPCはどちらが展開することをお勧めします必要があり、凍結保存将来の実験のために必要な時間を短縮する。 我々の実験では、我々はシナプシンプロモーター下皮質ニューロンにChR2を発現した。このプロモーターはパン神経であるため、我々は、おそらく抑制性と興奮性皮質ニューロンの両方を光刺激された。将来の実験の目的は、特に、阻害または刺激性のいずれかの回路を調べるためである場合、より特異的プロモーターを使用することができる。代替的に、皮質ニューロンは、トランスジェニック（またはウイルスを注射したマウス）にChR2の発現が特異的にニューロンの遺伝的に定義された亜集団を標的とするから得ることができる。例えば、Creリコンビナーゼは、フロックスChR2を持つマウスと交配されているパルブアルブミン含有介在ニューロン（PVの介在ニューロン）に発現しているマウスから収穫皮質組織は、ChR2をを表現する唯一の皮質ニューロンは、PVの介在ニューロン15になります状況が得られます。私たちの共同Cu中などChR2を発現介在ニューロンの使用ltureシステムは、パッチを適用したIPSC由来のニューロンがPVの介在ニューロンとの回路に組み込むことができるかどうかの決定を可能にします。 以前の研究9に基づき、皮質ニューロンは、in vitroで 14日後に樹状突起が重複する成熟している。光刺激は、パッチを適用したIPSC由来の神経細胞からの応答を誘発しない場合にはこのように、それはニューロンは、皮質ニューロンとシナプス結合を行う能力を持っていないことを示す必要があります。 IPSC由来のニューロンのいずれか他のIPSC由来の神経細胞または皮質ニューロンからシナプス入力を受信することができる。従来のパッチクランプ記録を用いた場合には、シナプス入力がどこから来ているのかを区別することは不可能である。私たちのシステムの利点は、皮質のシナプス前入力からシナプス後応答が選択的に誘発し、識別することができるということです。ここで概説した手順を統合するIPSC由来の神経細胞の能力を評価するために、簡単なアプローチを提供定義された神経回路網に。

近年では、ニューロン及び神経回路機能の我々の理解は、神経細胞の興奮性を制御するいくつかの光遺伝学的ツールで革命をもたらしてきた。そのようなツールが光活性陽イオンチャネルであり、チャネルロドプシン2（ChR2を）：光刺激1-3に対応してChR2を消防活動電位を発現するニューロン。神経細胞が光に通常は区別されませんので、この驚くべき能力は、ニューロン4の遺伝的に定義された集団の活動の正確な時間的および空間的制御のための新たな道を切り開くと大幅に脳機能の研究を加速しています。 ChR2をニューラルネットワーク6の活性を調節する神経発達5の監視が 、異なる目的のために幹細胞研究するために適用されている。 ここでは、神経細胞の共培養系の有用性を高めるためにChR2を用いる。共培養システムは、異なる細胞型の間の相互作用の評価を可能にする。ニューロンおよびグリアの共培養は、神経系の主要な細胞型は、一般的に、これらの異なる細胞型の間のシグナリングを調査するために、ならびに生理学的反応のためにこのシグナリングの重要性を評価するために、損傷の伝播及び検査するために使用されている潜在的にこのシグナル伝達7に関与する分子機構。以前の研究は、ヒトiPS細胞がラット皮質初代培養含有ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、およびミクログリア8の存在下でニューロンに非常に迅速に分化することを明らかにした。 このプロトコルでは、我々は、ヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）に由来するラット皮質ニューロン及びニューロン間のシナプス結合を調べるために、共培養系でのChR2を利用する方法を実証する。我々は、アストロサイトに解剖するステップと収穫脳組織9と同様に、マウス神経前駆細胞を維持し、分化する（NPCの）を記述し、人間のNPC値intOニューロンは、共培養系を作成する。この共培養系を確立するために、我々は、ヒトiPS細胞を生成するために、 文献 10沖田らによって記載統合のない再プログラミング法を用いた。 Li らによって記載されているように、これらのiPS細胞は、その後、効率的小分子阻害剤を用いた化学的に定義された条件でのNPCに分化した。11 共培養では、ニューロンの異なる集団は、トマト（tdTomato）二量体蛍光タンパク質、タンデム経由IPSC由来のニューロンの皮質ニューロンにおけるChR2を発現の検出とタグ付けを介して同定することができます。皮質ニューロンの光遺伝学的光刺激とIPSC由来のニューロンからの電気生理学的記録を組み合わせると、互いに回路を形成するニューロンのこれら2つのタイプの能力の評価を可能にする。具体的には、ChR2を発現皮質神経細胞の光刺激は、シナプス回路を形成しているIPSC由来のニューロンにおけるシナプス応答を呼び起こす輝皮質ニューロンネットワークと。我々は、増加したシナプス後電流が実際にそのような条件下でIPSC由来のニューロンで検出されたことを示している。このプロトコルは、疾患患者からの線維芽細胞から派生iPS細胞を使って、別の神経疾患モデルの要約を含む実験条件、種々の条件下でシナプス回路の評価を可能にする。

an optogenetic approach for assessing formation of neuronal connections in a co-culture system

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

ここで、共培養から星状細胞、皮質ニューロンおよびヒトの神経細胞の生成に関与する複数のステップを説明するプロトコルが示されている。ヒトiPS細胞は、エピソームベクター10と高密度（ 図1A）に維持されたNPCは11を作り、小分子阻害剤のカクテルで神経系統に指定を使用して線維芽細胞を再プログラムすることによって得た。 tdTomato（ 図1B）でタグ付けされた人間のNPCのアストロサイトへのマウスのNPCの分化、ChR2をを表現するラット皮質ニューロンのめっき、播種を：いくつかのステップが共培養を生成するのに必要とされる。分化の2日目に、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）+アストロサイトは容易に私たちの培養物（ 図1C）で観察することができる。マウスのNPCは、アストロサイトの単分子層（ 図1D）にChR2をを表現する皮質神経細胞をプレーティングする前に少なくとも1週間分化させた。 3の後人間のNPC分化の4週間、tdTomato +ニューロンは、培養物（ 図1E）で検出された。 この共培養系は、光刺激（ 図2A）に応答して、個々のIPSC由来のニューロンからシナプス後電流の一貫した検出を可能にする。光によって刺激されると、活動電位は、ChR2を（ 図2B）を発現する皮質ニューロンで生成された。 IPSC由来のニューロンは、現在の脱分極パルスの振幅が増加したように（ 図2D）増加し、活動電位発火を示す、また（ 図2C）励起可能である。したがって、これらの細胞は、成熟したニューロンの特性を示す。光がない場合には、IPSC由来のニューロンは、自発的なシナプス入力（ 図2E）を受けた。 GABA受容体を介して電流が外向きになるので、これらの内向きシナプス後電流は、主に、AMPA受容体によって媒介され、NMDA受容体は電流αを有していない-70 mVの保持電位トン。光刺激が大幅にシナプス後電流（ 図2E）の周波数を増加させているため、これらの入力のうちの少なくともいくつかは、ChR2を発現しているが、シナプス前皮質ニューロンからのものであった。シナプス入力の増加の時間経過を図2Fに示されている：皮質ニューロンの光刺激は、30秒の長い光のフラッシュを通して持続した。 ChR2を発現皮質神経細胞は（ 図2G）輝されたときのPSCの周波数が上昇したが、その振幅は（ 図2H）影響を受けなかった。要約すると、これらの結果は、IPSC由来のニューロンが成熟した神経細胞の性質を示し、シナプス前皮質ニューロンとシナプス結合を形成することができることを示している。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig1highres.jpg" /> 図1：共培養の生成のための模式図のNPCに性IPSCと神経誘導にヒト線維芽細胞を再プログラムするためのシステム。（A）のタイムライン。皮質ニューロンとアストロサイト培養物に対する成熟したニューロンへの人間のNPCの最終分化のために（B）タイムライン。（C）マウスNPCは急速に2の後GFAP +アストロサイトに分化するインビトロでの日数（D）1週間後にChR2を発現する皮質ニューロンのGFAP +星状細胞上にプレーティングした。（E）4〜5週目人間のNPCの分化後、電気生理学的記録は、tdTomato +ニューロンで行った。スケールバーは、100μmを表す。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52408/52408fig2highres.jpg" /> 図2：機能的なシナプスの接続性の光遺伝学的解析。 tdTomatoでタグ付けされた（A）IPSC由来細胞（赤色）は、皮質ニューロンが光活性を発現する共培養したチャンネル、ChR2を（緑）。 IPSC由来のニューロンからの記録は、皮質ニューロンまたは他のIPSC由来の神経細胞のいずれかから来ることができシナプス後電流（PSC）の応答を、明らかにした。（B）イルミネーション（青いバー）ChR2をを表現する皮質ニューロンにおける活動電位のシリーズを誘発。（ C）IPSC由来の細胞は、ChR2を発現皮質神経細胞の（E）光刺激（青いバー）。IPSC由来細胞の現在の関係を示す曲線D）焼成（。電流注入により誘発されるIPSC由来の神経細胞内のPSCの頻度が増加している光刺激によって生成PSC周波数の増加の。（F）時間のコース。青いバーが光刺激の時間を示している。 PSC周波数は光刺激（G）増加したが（G、H）、PSC振幅が（H）影響を受けなかった。 *はp &lt;0.05は、スチューデントのt検定を用いてコントロールと比較して示している。

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An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

共培養系における神経結合の形成を評価するための光遺伝学的アプローチ

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.3K ビュー.  Duke-NUS Graduate Medical School. A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2. 