بدعم جزئي من المعاهد الوطنية للصحة R01 CA121258، R01 CA125244، R01 CA154256، NIH / NCATS UCLA CTSI غرانت عدد UL1TR000124، USAMRMC W81XWH-08-1-0734، وصندوق جوان S. هولمز التذكاري للبحوث. MJH وبطاقات المعايدة الواردة معتمد من زمالة ما بعد الدكتوراه التذكارية جوان S. هولمز في جامعة كاليفورنيا. تم الحصول على الجهاز CSM من الأساليب العلمية الإبداعية: www.creative-sci.com. وكان في استقبال ناقلات lentiviral من جامعة كاليفورنيا المتجهات الأساسية، الذي تدعمه CURE / P30 DK041301.

1. الشريحة التحضير <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج الترسيب خلية الشرائح المنوع في الحقائب التعقيم وختم الشريط مع الأوتوكلاف. مواجهة الجانب تفلون المغلفة للانزلاق على جانب ورقة من الحقيبة لتجنب الودائع من البلاستيك على الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحقائب الأوتوكلاف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشريحة من التعقيم الحقيبة داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية ومكان في العقيمة 150 × 15 مم طبق بتري معقمة. ما يصل إلى أربعة شرائح يمكن أن يصلح لكل طبق. وضع 35 × 10 مم طبق بتري بجانب الشرائح. إضافة 2-3 مل من H 2 O معقمة لتوفير الترطيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الشرائح قبل معطف مع بولي-D-يسين بمعدل 100 ميكروغرام / مل باستخدام حجم ما يكفي لتغطية كامل أيضا. بعد ساعة واحدة على RT، نضح الحل وشطف سطح مرتين جيد من قبل pipetting برنامج تلفزيوني 1X على سطح الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختياريا، إضافة فبرونيكتين أو مكونات ECM أخرى لضمان أقوى الخلايا السرطانية الالتزام. إضافة فبرونيكتين في 5 ميكروغرام / مل في ما يكفي من حجم ثار الآبار سوف لا تجف في غضون فترة قصيرة من الزمن في RT. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 1 ساعة، نضح الحل بقايا ويغسل مرتين من قبل pipetting صعودا وهبوطا مع برنامج تلفزيوني 1X. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ PBS على الآبار حتى الورم جاهز للطلاء. استخدام الشرائح في نفس اليوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد قارورة متكدسة من ملتصقة نوع من الخلايا السرطانية المطلوب. عدد خلايا قابلة للحياة باستخدام التريبان الأزرق صبغ استبعاد بواسطة المجهر الضوئي و resuspend في 5 × 10 6 خلية / مل في مخزنة على نحو كاف للنمو سبيل المثال المتوسطة ل، Dulbecco والحد الأدنى من المتوسط ​​ضروري (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، L- الجلوتامين والبيروفات الصوديوم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان المطلوب تصوير الفلورسنت من السكان خلية ملتصقة، تسمية السكان الخلية ملتصقة مع صبغة الفلورسنت حيويا أو صبغة تكاثر الخلايا عن طريق اتباع بروتوكولات المقدمة من قبل الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة بسلاسة 10 ميكرولتر من المتوسطة الكامل في كل بئر من الرعاية الشريحة باتخاذها لتجنب خلق فقاعات في أهلا وسهلاليرة سورية، وهذه يمكن منع موحد الالتزام الخلايا السرطانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2،5-5،0 × 10 4 خلايا (5-10 ميكرولتر من تعليق خلية) إلى متوسطة في كل بئر (الشكل 1A). ضبط العدد الأمثل اعتمادا على نوع من الخلايا السرطانية وعدد الأيام من النمو المنشود. الخلايا السرطانية أكبر أو الخلايا السريعة النمو قد تتطلب خلايا أقل في البداية. جلب حجم جيدا ما يصل إلى 40 ميكرولتر بإضافة المتوسطة وماصة صعودا وهبوطا لضمان حتى التوزيع من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد كل الآبار هي المصنفة، تسمح للخلايا السرطانية أن تلتزم في RT، ثم وضع غطاء على طبق بتري 150 × 15 ملم وبعناية يتحرك الطبق إلى حاضنة مرطب 37 ° C / 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة على الأقل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير ثقافة المتوسط ​​يوميا. ماصة بعناية جزء من المتوسط ​​أمضى من أحادي الطبقة المتوسطة واستبدالها مع كامل الطازجة. ملاحظة: بسبب التبخر، وسوف تحتاج أكثر من وحدة التخزين التي يمكن ان تضاف مما كان يؤخذ بها. سوف آبار تكون جاهزة للفحص عند حتى، conflطبقة uent الخلايا موجودة. هذا هو عادة بعد 1-3 أيام بذر الأولي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرة واحدة أحادي الطبقة بلطف مع PBS كما هو موضح في الخطوة 1.4 و إما انتقل إلى الخطوة 2 إذا رغبت الطبقات الوحيدة، أو إلى الخطوة 1.13 أدناه لاستخراج البروتينات ECM من أحادي الطبقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 0.5٪ تريتون-X (ت / ت) حل في المتوسط ​​كاملة وإضافة 30 ميكرولتر إلى كل بئر. السماح أحادي الطبقة هضم في غطاء محرك السيارة لمدة 2 دقيقة، ثم يغسل مرتين مع المتوسطة كاملة من قبل pipetting كما هو موضح أعلاه. ملاحظة: قد تكون طبقة ECM مرئية بواسطة المجهر الضوئي (الشكل 2). استخدام الشرائح على الفور، أو الاحتفاظ بها في المتوسط ​​كاملة في ترطيب CO 2 الحاضنة لمدة 1-2 أيام. لا تسمح الآبار لتجف. </li></ol> 2. الترسيب للخلايا T غير ملتصقة على الشريحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان المطلوب تصوير الفلورسنت من السكان الخلايا غير ملتصقة، تسمية السكان الخلية غير ملتصقة مع صبغة الفلورسنت الحيوية، مثل CFSE، خلية المقتفي الأحمر CMPTX، أو eFluor670 باتباع بروتوكولات المقدمة من قبل الشركة المصنعة لا يقل عن 1 ساعة قبل الفحص. بدلا من ذلك، والتلاعب خلايا للتعبير عن البروتينات الفلورية المشفرة بواسطة ناقلات فيروسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف مشعب الترسيب خلية في الحقيبة الأوتوكلاف كما هو موضح في 1.2 أعلاه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة غرفة ترطيب تحتوي على الشرائح تفلون المغلفة من الحاضنة ومكان في خزانة السلامة البيولوجية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الآبار مع برنامج تلفزيوني 1X قبل pipetting صعودا وهبوطا، ثم إضافة 45 ميكرولتر من المتوسط ​​كاملة تحتوي على 10٪ على الأقل المصل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة متعددة من المغلف التعقيم والشريحة بعناية في أكثر من الآبار حتى &quot;هوك&quot; في نهاية مشعب تلامس أسفل الشريحة (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من أن مستنبت مرئيا في كل من القنوات. إذا رأيت أحدا، خلع متعددة وإضافة المزيد من متوسطة إلى المقابلة جيدا، ثم استبدال والتحقق مرة أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوة 2.5 لكل تشاننيل من مشعب، أو العديد من الآبار كما تريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عدد الخلايا غير ملتصقة و resuspend في ما لا يقل عن 1.0-2.0 × 10 5 / ميكرولتر. وضع 1 ميكرولتر من الخلايا وببطء ماصة لهم في قناة (الشكل 1C). هل كل هذا لالمرجوة بشكل جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الخلية بأكملها جهاز تحميل، أي جوانب متعددة والشرائح، داخل غطاء محرك السيارة الحيوي لمدة 20-30 دقيقة للسماح للخلايا في القناة ليستقر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة متعددة عن طريق لمس طرفي ورفعه على التوالي من الشريحة حتى لا تعكر صفو خلايا المصنف الوزراء البريطانى في وسط الآبار (الشكل 1D) بلطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفقد كل بئر لضمان أن الخلايا غير ملتصقة تم المصنف بنجاح في مركز البقاء البئر داخل محيط القناة المتعددة. فإن الخلايا غير ملتصقة بشكل مثالي تلتزم قليلا إلى أحادي الطبقة أو ECM ومع بعضها البعض، وبالتالي تتحرك بلطف الشريحة في جميع أنحاء لن يتسبب في بيلي خليةر لتفريق. لا تصدم الشريحة. </li></ol> 3. المجهر مضان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع المعدات التجريبية المناسبة، نفذ التصوير بعد تأكيد الترسيب. ومن الناحية المثالية، واستخدام المجهر التي هي مجهزة تجهيزا مع غرفة CO 2 والرطوبة. صورة في الطاقة المنخفضة، أي 4X أو 10X، للسماح للصور متعددة الواجب اتخاذها من مساحة أكبر بحيث يمكن أن ينظر إلى مجمل البئر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صور رقمية باستخدام التقاط الصور البرمجيات. أداء brightfield و / أو متعدد القنوات التصوير مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا رغبت في ذلك، وإنشاء الفاصل الوقت لتسجيل الصور في قنوات مختلفة على منطقة معينة، أو الاحتفاظ الشريحة ترطيب وفي / 5٪ CO 2 حاضنة 37 درجة مئوية ويدويا إخراج لصورة عند نقاط الوقت المطلوب (الشكل 1E &amp; F، وأوصت لنقطة زمنية أطول). </li></ol> 4. التحليل والعرض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام برامج تحرير الصور، دمج الضوء وفلوريداويمكن رؤية الصور uorescent إلى أنواع الخلايا طبقة واحدة متعددة بحيث وعلامات في نفس الصورة. سحب وإسقاط الملفات على الصورة لعرض كل لون على حدة في البرنامج، وعند المطالبة، حدد الخيار &quot;إضافة طبقة&quot; لإنشاء ملف صورة مع طبقات متعددة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أعلى التكبير، واتخاذ، محاذاة، وغرزة معا الصور عبر البئر رقميا. محاذاة الملفات من خلال النظر في المناطق الحفظ بين اثنين من الصور وتتراكب صورة واحدة على رأس الآخر حتى يتم إنشاء صورة كاملة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة أشرطة ميكرون إلى صور خلال الاستحواذ باستخدام برنامج التقاط لتحديد المسافة هاجروا الخلايا الفردية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتحديد الهجرة الخلية في أوقات مختلفة، وجعل خرائط كثافة سطح مضان مع برنامج صورة، أي يماغيج، لقياس الفلورسنت تجميع الخلايا T أو نشر على مر الزمن. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتوليد المؤامرات السطح، وتأخذ صورة الطبقات إنشاؤها في الخطوة 4.1 وتحت نافذة الطبقات،إلغاء جميع الطبقات ما عدا تلك المقابلة إلى القناة المطلوبة. على سبيل المثال، إذا كان المطلوب مؤامرة سطح لتصور EMD التعبير، يجب فقط الطبقات الخضراء المقابلة لتصفية المستخدمة لهذه العلامة تكون مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتسطح الصورة وحفظه في تنسيق ملف معترف بها (على سبيل المثال، بابوا نيو غينيا) وتحميل الصور إلى البرنامج. لتوليد مؤامرة السطح، تغيير نوع الصورة ل8 بت، تغيير السطوع / التباين حسب الحاجة للحد من الخلفية، وحدد الخيار &quot;تحليل قطعة أرض / سطح&quot;. وقد تم توليد الصور في الشكل 5 عن طريق التحقق من &quot;الظل &#39;،&#39; رسم المحور &#39;،&#39; المضلع واحدة لكل خط، وخانات&quot; السلس &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، أخذ قياسات باستخدام نصف قطر أو القطر من إيداع خلية التنسيق في وقت الصفر وقارن بين الخلايا في أبعد نقطة في أوقات مختلفة. قطر تفلون الآبار هو 6.0 ملم. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hwang, J. H., Smith, C. A., Salhia, B., Rutka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+fascin+in+the+migration+and+invasiveness+of+malignant+glioma+cells.">The role of fascin in the migration and invasiveness of malignant glioma cells.</a> Neoplasia. 10 (2), 149-159 (2008).</li><li>Valster, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+and+invasion+assays.">Cell migration and invasion assays.</a> Methods. 37 (2), 208-215 (2005).</li><li>Berens, M. E., Rief, M. D., Loo, M. A., Giese, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+in+human+astrocytoma+migration+and+proliferation+studied+in+a+microliter+scale+assay.">The role of extracellular matrix in human astrocytoma migration and proliferation studied in a microliter scale assay.</a> Clin Exp Metastasis. 12 (6), 405-415 (1994).</li><li>Osawa, H., Smith, C. A., Ra, Y. S., Kongkham, P., Rutka, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+membrane+cytoskeleton+cross-linker+ezrin+in+medulloblastoma+cells.">The role of the membrane cytoskeleton cross-linker ezrin in medulloblastoma cells.</a> Neuro-oncology. 11 (4), 381-393 (2009).</li><li>Berens, M. E., Beaudry, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radial+monolayer+cell+migration+assay.">Radial monolayer cell migration assay.</a> Methods Mol Med. 88, 219-224 (2004).</li><li>Giese, A., Rief, M. D., Loo, M. A., Berens, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+human+astrocytoma+migration.">Determinants of human astrocytoma migration.</a> Cancer Res. 54 (14), 3897-3904 (1994).</li><li>Vlodavsky, I., Levi, A., Lax, I., Fuks, Z., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+cell+attachment+and+morphological+differentiation+in+a+pheochromocytoma+cell+line+and+embryonal+sensory+cells+by+the+extracellular+matrix.">Induction of cell attachment and morphological differentiation in a pheochromocytoma cell line and embryonal sensory cells by the extracellular matrix.</a> Dev Biol. 93 (2), 285-300 (1982).</li><li>Hulkower, K. I., Herber, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+and+invasion+assays+as+tools+for+drug+discovery.">Cell migration and invasion assays as tools for drug discovery.</a> Pharmaceutics. 3 (1), 107-124 (2011).</li><li>Hickey, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementing+preclinical+study+findings+to+protocol+design:+translational+studies+with+alloreactive+CTL+for+gliomas.">Implementing preclinical study findings to protocol design: translational studies with alloreactive CTL for gliomas.</a> Am J Transl Res. 4 (1), 114-126 (2012).</li><li>Tai, C. K., Wang, W. J., Chen, T. C., Kasahara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-shot,+multicycle+suicide+gene+therapy+by+replication-competent+retrovirus+vectors+achieves+long-term+survival+benefit+in+experimental+glioma.">Single-shot, multicycle suicide gene therapy by replication-competent retrovirus vectors achieves long-term survival benefit in experimental glioma.</a> Mol Ther. 12, 842-851 (2005).</li><li>Logg, C. R., Baranick, B. T., Lemp, N. A., Kasahara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+evolution+of+a+tagged+chimeric+gammaretrovirus:+identification+of+novel+cis-acting+elements+that+modulate+splicing.">Adaptive evolution of a tagged chimeric gammaretrovirus: identification of novel cis-acting elements that modulate splicing.</a> J Mol Biol. 369 (5), 1214-1229 (2007).</li><li>Koya, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+phases+of+distribution+and+tumor+targeting+by+T+cell+receptor+engineered+lymphocytes+inducing+robust+antitumor+responses.">Kinetic phases of distribution and tumor targeting by T cell receptor engineered lymphocytes inducing robust antitumor responses.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 107 (32), 14286-14291 (2010).</li><li>Zumwalde, N. A., Domae, E., Mescher, M. F., Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-1-dependent+homotypic+aggregates+regulate+CD8+T+cell+effector+function+and+differentiation+during+T+cell+activation.">ICAM-1-dependent homotypic aggregates regulate CD8 T cell effector function and differentiation during T cell activation.</a> J Immunol. 191 (7), 3681-3693 (2013).</li><li>Campbell, C. B., Cukierman, E., Artym, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-D+extracellular+matrix+from+sectioned+human+tissues.">3-D extracellular matrix from sectioned human tissues.</a> Curr Protocol Cell Biol. 62 (Unit 19), 11-20 (2014).</li><li>Prevention, C. f. D. C. a. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , (2009).</li><li>Zigmond, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ability+of+polymorphonuclear+leukocytes+to+orient+in+gradients+of+chemotactic+factors.">Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors.</a> J Cell Biol. 75 (2 Pt 1), 606-616 (1977).</li><li>Alstergren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+and+directed+migration+of+murine+neutrophils+is+dependent+on+cell+surface+expression+of+CD44.">Polarization and directed migration of murine neutrophils is dependent on cell surface expression of CD44.</a> Cell Immunol. 231 (1-2), 146-257 (2004).</li><li>Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+under+agarose:+a+new+and+simple+method+for+measuring+chemotaxis+and+spontaneous+migration+of+human+polymorphonuclear+leukocytes+and+monocytes.">Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes.</a> J Immunol. 115 (6), 1650-1656 (1975).</li><li>Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metallothionein+mediates+leukocyte+chemotaxis.">Metallothionein mediates leukocyte chemotaxis.</a> BMC Immunol. 6 (12), 21 (2005).</li><li>Hadjout, N., Laevsky, G., Knecht, D. A., Lynes, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+real-time+measurement+of+chemotactic+cell+motility.">Automated real-time measurement of chemotactic cell motility.</a> Biotechniques. 31 (5), 1130-1138 (2001).</li><li>Zhang, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+antigen+precursor+protein+profiles+of+adult+and+pediatric+brain+tumors+identify+potential+targets+for+immunotherapy.">Tumor antigen precursor protein profiles of adult and pediatric brain tumors identify potential targets for immunotherapy.</a> J Neuro-oncol. 88, 65-76 (2008).</li></ol>

The authors declare they have no competing financial interests.

تم pipetted الخلايا السرطانية في تعليق خلية واحدة في الآبار من الشريحة ملثمين تفلون. سمح للخلايا التمسك ومن ثم تشكيل الطبقات الوحيدة في ترطيب 5٪ CO 2، 37 ° C الحاضنة (الشكل 1A). الطبقات الوحيدة التي أنشئت أو البروتينات ECM المستمدة من أحادي الطبقة يمكن أن تحصد لهذ...

وقد تم تطوير هذا الفحص الهجرة خلية شعاعي واحد رقائق أصلا لقياس خصائص الارتشاحي من الخلايا السرطانية ملتصقة 1-4 على الشرائح المغلفة مع المصفوفة خارج الخلية (ECM) البروتينات 5-7 أو مع مكونات ECM الفردية، مثل فبرونيكتين أو laminin 1،2. وشملت تقنية البذر تعليق خلية واحدة من الخلايا السرطانية في وسط الآبار باستخدام الفولاذ المقاوم للصدأ الترسيب خلية متعددة (CSM). بعد الترسيب، فإن الخلايا السرطانية الانضمام إلى قاع البئر والتغيير في قطر من السكان الخلية الأولي مع مرور الوقت كانت تستخدم لإقامة معدل الحركة الأفقية. قدم فحص شعاعي الهجرة الخلية أحادي الطبقة ميزة البصرية على الطرق الأخرى القائمة التي يعملون transwell لوحات لفحص القدرات في المختبر من خلايا المهاجرة. هذه المقايسات غير قابلة للتفضي إلى التصوير 8. كذلك، قدمت أيضا قدرا كبيرا من الحرية في اختيار timepointليالي عندما يتم تقييم الهجرة، مع عدم وجود حد لعدد من timepoints الباحث يمكن أن يختار الصورة بعد الترسيب. لأن القدرة على الهجرة هي وظيفة هامة للخلايا غير ملتصقة، وخاصة في مجال العلاج المناعي أو حيث يمكن أن تستخدم وسائل إيصالها للناقلات فيروسية، ونحن تكييفها استخدام CSM لتقييم هجرة الخلايا غير ملتصقة أنواع على الطبقات الوحيدة الخلية السرطانية، بالإضافة إلى البروتينات ECM. فائدة إضافية تتمثل في تصور مجهريا هجرة الخلايا غير ملتصقة على الطبقات الوحيدة الخلية السرطانية قابلة للحياة، على ECM معقدة معزولة عن الورم، أو على مكونات ECM الفردية يجعل هذا الاختبار تنوعا. لا تعكس المقايسات التي تستخدم الآبار المغلفة مع البروتين خارج الخلية واحد بدقة الركيزة الأنسجة ECM أو ورم أن الخلايا تهاجر من خلال في الجسم الحي. هنا، كنا alloreactive السامة للخلايا T الليمفاوية (alloCTL)، توعيتهم histocomp الرئيسيةمجمع atibility (MHC) البروتينات باستخدام تفاعلات في اتجاه واحد الخلايا السرطانية اللمفاوية مختلطة (MLTR) أو ردود الفعل اللمفاويات مختلطة (MLR) 9، كما لدينا التمثيلي غير ملتصقة نوع من الخلايا. نحن اختبار خلايا المنشأ البشري والفئران على حد سواء. عندما تم قياس الهجرة على الطبقات الوحيدة الورم، وكانت الخلايا السرطانية يعملون الأهداف ذات الصلة إما جزئيا، وعرض بعض من نفس البروتينات MHC وجدت على السكان الخلية المستخدمة لتوعية المستجيبات، أو الأهداف ذات الصلة بشكل كامل، مع مجموعة كاملة من جزيئات MHC أن تم توعية المستجيبات نحو. في بعض التجارب، وكنا CellTracker الفلورسنت الأحمر CMPTX أو تكاثر الخلايا صبغ eFluor 670 إلى التفريق بين الخلايا المستجيب والهدف. كنا أيضا التنبيغ مع ترميز ناقلات فيروسية لالبروتينات الفلورية وسيلة إضافية لتصور الخلايا. بالنسبة لبعض المقايسات، فإننا transduced في alloCTL مع ناقلات تتكاثر فيروسات (RRV) الترميز لالزمرد الأخضر (EMD) البروتين الفلوري 10،11. لأوراسكوم تليكوم القابضةالمتطلبات البيئية، تم transduced الخلايا السرطانية مع ناقلات lentiviral الترميز لmStrawberry. تم المصنفة في alloCTL من خلال قناة من مشعب في مركز الورم إما الطبقات الوحيدة الخلية أو ECM تحصد من الطبقات الوحيدة الخلية السرطانية. تم تصور ملتصقة وغير ملتصقة التفاعلات الخلية التي كتبها ضوء و / أو بواسطة المجهر مضان على مر الزمن. كانت اضطراب في أحادي الطبقة الخلية السرطانية في انخفاض القوة، أو ورم الخلايا مع نوى مجزأة في عالية الطاقة مؤشرات إصابة الخلية التي تحلل وموت الخلايا المبرمج، على التوالي. أنشأنا رقميا كثافة سطح خرائط الفلورسنت تبين هجرة الخلايا T الاستشعاع غير ملتصقة على الثقافات أحادي الطبقة. لاحظنا أيضا أفرز السمسة إلى ملتصقة أحادي الطبقة خلية الورم بعد تشكيل مجموعة من alloCTL غير ملتصقة مضافين. كذلك، لوحظ التنبيغ الأفقي للRRV-EMD من alloCTL إلى أحادي الطبقة بالورم.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:239px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:312px;">Teflon-masked microscope slides</td>
			<td style="width:203px;">Creative Scientific Methods</td>
			<td style="width:239px;">CSM002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:312px;">Cell Sedimentation Manifold</td>
			<td style="width:203px;">Creative Scientific Methods</td>
			<td style="width:239px;">CSM001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Petri Dish, 150mm</td>
			<td style="width:203px;">Corning</td>
			<td style="width:239px;">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Petri Dish, 35mm</td>
			<td style="width:203px;">Corning</td>
			<td style="width:239px;">430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">21-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">20 &#956;L Pipetman</td>
			<td style="width:203px;">Gilson</td>
			<td style="width:239px;">F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">200 &#956;L Pipetman</td>
			<td style="width:203px;">Gilson</td>
			<td style="width:239px;">F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">200 &#956;L pipette tips</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:239px;">89003-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Distilled, deionized water (sterile)</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">25-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Trypsin</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">25-054-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Celltracker Red CMPTX</td>
			<td style="width:203px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:239px;">C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">TrypLE Express (optional)</td>
			<td style="width:203px;">Gibco</td>
			<td style="width:239px;">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Tumor cell culture media (e.g. DMEM)</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">10-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">AIM-V serum-free media</td>
			<td style="width:203px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:239px;">12055-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:203px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:239px;">FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">SPOT Advanced</td>
			<td style="width:203px;">Diagnostic Instruments</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:203px;">Millipore</td>
			<td style="width:239px;">A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:203px;">BD</td>
			<td style="width:239px;">354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">31/2 x 51/4 Autoclave Pouches</td>
			<td style="width:203px;">Crosstex</td>
			<td style="width:239px;">SCXS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Cell Proliferation eFluor 670</td>
			<td style="width:203px;">eBioscience</td>
			<td style="width:239px;">65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">ImageJ</td>
			<td style="width:203px;">NIH</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radial mobility and cytotoxic function of retroviral replicating vector transduced, non-adherent alloresponsive t lymphocytes

نحن الإبلاغ عن التكيف رواية للمقايسة الهجرة خلية شعاعي أحادي الطبقة، لاول مرة لقياس الهجرة شعاعي من الخلايا السرطانية ملتصقة على البروتينات المصفوفة خارج الخلية، لقياس الحركة البشرية غير ملتصقة أو المستجيب الفئران خلايا fluorescently المسمى، المناعية. هذه التقنية تستخدم مشعب الفولاذ المقاوم للصدأ و10-جيدا الشريحة تفلون لإيداع الوزراء البريطانى خلايا T غير ملتصقة في آبار أعدت مع أي متموجة الطبقات الوحيدة الخلية السرطانية أو البروتينات المصفوفة خارج الخلية. يستخدم الضوء و / أو متعدد القنوات المجهري مضان لتتبع حركة وسلوك الخلايا المستجيب على مر الزمن. الأصباغ الفلورية و / أو ناقلات فيروسية أن يتم استخدام رمز الجينات المحورة الفلورية لتسمية بشكل مختلف أنواع الخلايا للتصوير. هذا الأسلوب هو متميز من نوع مماثل في فحوصات المختبر التي تتبع أفقي أو عمودي الهجرة / الغزو استخدام غرف الشرائح، أجار أو transwell لوحات. مقايسة يسمح بيانات التصوير مفصلة لبالبريد جمعها مع أنواع مختلفة من الخلايا تتميز علامات الفلورسنت محددة؛ يمكن رصدها حتى القطعان معينة من الخلايا (أي transduced / nontransduced). يتم إنشاؤها سطح المؤامرات كثافة مضان باستخدام قنوات محددة مضان التي تتوافق مع نوع من الخلايا المهاجرة. وهذا يسمح لتصور أفضل للتنقل الخلايا المناعية غير ملتصقة في أوقات محددة. فمن الممكن لجمع أدلة عن وظائف الخلية المستجيب أخرى، مثل سمية الخلايا أو نقل ناقلات فيروسية من المستجيب لاستهداف الخلايا، كذلك. وهكذا، فإن الأسلوب يسمح للباحثين لتوثيق مجهريا خلية الى خلية تفاعلات المسمى تفاضلي، وعدم تمسكا مع الخلايا الملتصقة من مختلف الأنواع. قد تكون هذه المعلومات ذات أهمية خاصة في تقييم أنواع الخلايا المناعية بيولوجيا التلاعب بها أو تفعيلها، حيث هو المطلوب برهان البصرية من وظائف مع الخلايا المستهدفة الورم قبل استخدامها لعلاج السرطان.

<html> النواقل الفيروسية ترميز لالبروتينات الفلورية يمكن استخدامها بالإضافة إلى، أو بدلا من صبغة الفلورسنت. يجب أن يتم تنفيذ تنبيغ الفيروسية في وقت سابق للفحص الحركة. كل من أنواع الخلايا الملتصقة وغير ملتصقة يمكن أن توصف بشكل مختلف. سوف بروتوكول لالتنبيغ تعتمد على نوع ?...

Watch this Scientific Journal Video about Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes at JoVE.com

Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.

شعاعي التنقل والسامة للخلايا وظيفة من فيروسات الرجعية تكرار ناقل Transduced، غير ملتصقة Alloresponsive T اللمفاويات

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

radial-mobility-cytotoxic-function-retroviral-replicating-vector

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.7K Views.  UCLA David Geffen School of Medicine. We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality. 

Video: Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

تنبيغ من فيروسات تي خلية المستقبلات في الخلايا التائية ماوس

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

إعداد واستخدام HIV - 1 CD4 + T الابتدائية المصابة خلايا والخلايا المستهدفة في الخلايا القاتلة الطبيعية فحوصات السامة للخلايا

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

طرق لتقييم موت الخلايا بيتا وساطة من قبل الخلايا اللمفاوية التائية السامة

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

توسيع الخلايا اللمفاوية T السامة للخلايا من دم الحبل السري أن الفيروس المضخم للخلايا الهدف، فيروس ابشتاين بار، واتش

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

توجه التمييز بين الخلايا الجذعية المحفزة المستحثة نحو الخلايا اللمفية تي

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

العزلة والتمايز TH17 من السذاجة CD4 T الخلايا اللمفاوية

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

ثابت التصاق الفحص لدراسة إنتغرين تنشيط الخلايا اللمفية تي في

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

بروتوكول عزل فعال للاللمفاوية البائية والتائية من بلاطي اللوزتين الإنسان

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

فيروسات تنبيغ من خلايا نخاع العظم السلف لتوليد خلايا T مستقبلات Retrogenic الفئران

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

توليد<em&gt; دي نوفو</em&gt; محددة مستضد تي الإنسان مستقبلات الخلية من قبل فيروسات تنبيغ من مركزية Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...