NIH R01 CA121258, R01 CA125244, R01 CA154256, NIH / NCATS UCLA CTSI 허가 번호 UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, 그리고 조안 S. 홈즈 기념 연구 기금에 의해 부분적으로 지원됩니다. MJH와 GCO는 UCLA에서 조안 S. 홈즈 기념 박사후 원정대에서 지원 받았다. CSM 장치는 창조적 인 과학적인 방법에서 얻은 : www.creative-sci.com. 렌티 바이러스 벡터는 CURE / P30의 DK041301 지원하는 UCLA 벡터 코어에서 받았습니다.

1. 슬라이드 준비 <ol><li> 멸균 파우치에 휴대 침전 매니 폴드 슬라이드를 삽입하고 오토 클레이브 테이프로 밀봉. 봉지의 종이 측 플라스틱 웰에 침착을 방지하기 위해 슬라이드 테프론 코팅면에 직면한다. </li><li> 121 ℃에서 15 분간 멸균 파우치. </li><li> 멸균 150 X 15mm 멸균 페트리 접시에 바이오 안전성 캐비닛과 장소 내부 살균 주머니에서 슬라이드를 제거합니다. 네 개의 슬라이드까지 접시 당에 맞게 할 수 있습니다. 슬라이드 옆에 35 X 10mm 페트리 접시를 놓습니다. 가습을 제공하기 위해 멸균 H 2 O의 2-3 ML을 추가합니다. </li><li> 물론 전체를 커버하기에 충분한 양을 사용하여 100 ㎍ / ㎖의에 폴리 D 리신으로 미리 코팅 슬라이드. RT 이상의 시간 후, 용액을 흡인하고, 웰의 표면 위에 1X PBS 피펫 팅하여 잘 배의 표면을 헹군다. </li><li> 선택적으로, 더 강한 종양 세포 부착을 위해 피브로넥틴 또는 다른 ECM 성분을 추가한다. 충분한 볼륨 그쪽에서 5 ㎍ / ㎖의에서 피브로넥틴 추가웰 T RT에서 단시간 내에 건조하지 않습니다. <ol><li> 1 시간 후, 남아있는 솔루션을 대기음 1X PBS와 피펫 팅에 의해 아래로 두 번 씻는다. </li></ol></li><li> 종양이 도금을위한 준비가 될 때까지 우물에 PBS를 유지합니다. 사용 당일 슬라이드. </li><li> 원하는 점착성 종양 세포 유형의 융합 플라스크 수확. 적절히 완충 성장 매체 - 예를 들어 5 × 106 세포 / ml의 광 현미경 resuspend에 의해 트립 판 블루 염색 배제를 사용하여 생존 세포를 세어, 둘 베코 최소 필수 배지, 10 % 소 태아 혈청 (DMEM) (FBS), L- 글루타민 및 피루브산 나트륨. </li><li> 부착 성 세포 집단의 형광 영상을 원하는 경우, 중요한 형광 염료 또는 제조사에 의해 제공된 프로토콜에 따라 세포 증식 염료 부착 세포 집단 레이블. </li><li> 부드럽게 아에 거품을 만들지 않도록하기 위해 슬라이드 돌보는의 각 웰에 전체 매체의 10 μl를 피펫LS, 다음과 같이 균일 한 종양 세포의 부착을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 각 웰 (그림 1A)의 매체에 2.5-5.0 × 10 4 세포 (세포 현탁액의 5 ~ 10 μL)를 추가합니다. 종양 세포 유형의 성장 및 바람직한 일 수에 따라 최적의 수를 조정한다. 큰 종양 세포 또는 빠르게 성장하는 세포는 처음에는 적은 수의 세포를 필요로 할 수있다. 세포의 균일 한 분포를 확인하기 위해 위 아래로 중간 피펫을 추가하여 40 μL까지 잘 볼륨을 가져와. </li><li> 모든 웰은 시딩 한 후, 종양 세포는 그 후, 실온에서 접착 배치 뚜껑을 150 X 15mm 페트리 접시에 조심스럽게 최소 24 시간 동안 37 ℃ / 5 % CO 2 가습 인큐베이터 접시를 이동할 수있다. </li><li> 매일 문화 매체를 변경합니다. 조심스럽게 단층에서 소비 된 매체의 일부를 피펫 신선한 완전 배지로 교체합니다. 참고 : 증발하기 때문에, 더 볼륨을 꺼내어보다 추가해야합니다. 웰스 분석을위한 준비가되어있을 때조차, confl세포의 uent 층이 존재한다. 이 1~3일 초기 시딩 후 일반적이다. </li><li> 단계 1.4에서 설명하고 단일 층이 요구되는 경우 2 단계로 진행, 또는 단일 층에서 ECM 단백질을 추출 아래 1.13 단계 중 하나로 PBS로 가볍게 한 번 단층을 씻으십시오. </li><li> 완전 배지에서 0.5 % 트리톤 X (v / v)의 솔루션을 확인하고 각 웰에 30 μl를 추가합니다. 단분자막이어서, 2 분 동안 후드 다이제스트 전술 한 바와 같이 피펫 팅 완전 배지로 두 번 세척하자. 참고 : ECM 층은 광학 현미경 (그림 2)로 표시 될 수 있습니다. 바로 슬라이드를 사용하거나 1-2일의 가습 CO 2 배양기에서 완전한 매체에 보관하십시오. 우물이 건조 할 수 없습니다. </li></ol> 슬라이드에 미부착 된 T 세포의 침강 2. <ol><li> 미부착 된 세포 집단의 형광 이미징이 요구되는 경우, 이러한 CFSE, 셀 트랙커 레드 CMPTX 또는 eFluor 같은 중요한 형광 염료 미부착 된 세포 집단을, 레이블분석에 앞서 제조에서 1 시간 이상에 의해 제공된 프로토콜에 따라 670. 대안으로, 바이러스 벡터에 의해 코딩되는 형광 단백질을 발현하는 세포를 조작. </li><li> 상기 1.2에 기재된 바와 같이 오토 클레이브 파우치 셀 침강 매니 폴드를 압력솥. </li><li> 생물 안전 캐비닛의 보육과 장소에서 테프론 코팅 된 슬라이드를 포함하는 가습 실을 제거합니다. </li><li> 피펫 팅에 의해 1X PBS로 우물을 세척하고 아래로, 다음 10 % 이상 혈청을 포함하는 완전한 매체의 45 μl를 추가합니다. </li><li> 살균 봉투로부터 매니 폴드를 조심스럽게 제거하고 슬라이드 (도 1b)의 바닥에 닿을 매니 폴드의 끝에 &#39;후크&#39;까지 웰 위에 미끄러. </li><li> 배지는 각 채널에서 볼 수 있는지 확인하십시오. 아무 것도 볼 수없는 경우, 매니 폴드를 벗고 잘 대응에 더 많은 매체를 추가 한 다음 교체하고 다시 확인합니다. </li><li> 각 짱 단계를 반복 2.5에 채널 매니 폴드의, 또는 많은 우물을 위해 원하는대로. </li><li> 아니 이하 / 5 10 × 1.0 ~ 2.0보다 μL에서 비 부착 세포에 resuspend를 계산합니다. 세포의 1 μl를 작성하여 천천히 채널 (그림 1C)로 피펫. 물론 원하는 각각에 대해이 작업을 수행합니다. </li><li> 채널의 세포가 정착 할 수 있도록 20 ~ 30 분 동안 바이오 후드 안쪽 즉, 매니 폴드와 슬라이드 전체 셀로드 장치를, 두십시오. </li><li> 국소 적 우물 (그림 1D)의 중심에 놓는 세포를 방해하지 않도록 슬라이드에서 바로 들어 올려 부드럽게 양쪽 끝을 터치에 의해 매니 폴드를 제거합니다. </li><li> 비 접착 세포가 성공적으로 잘 매니 폴드 채널의 원주 내에 머무르는 중심 시딩 된되도록 각 웰을 검사한다. 비 - 부착 세포는 이상적으로 약간 부드럽게 따라서 셀 PELLE 발생하지 않습니다 주위 슬라이드 이동, 단층 또는 ECM으로 서로 부착된다t은 분산합니다. 슬라이드를 밀다하지 마십시오. </li></ol> 3. 형광 현미경 <ol><li> 침강 확인 후 적절한 실험 장비, 영상을 수행합니다. 이상적으로, CO 2 및 습도 챔버가 장착되어 현미경을 사용합니다. 웰의 전체가 볼 수 있도록 여러 개의 이미지를 허용하는 낮은 전력, 즉 4X 또는 10X, 이미지에 더 큰 영역으로 채취한다. </li><li> 촬상 소프트웨어를 이용하여 디지털 이미지를 획득. 명 시야 및 / 또는 다 채널 형광 이미징을 수행한다. </li><li> 원하는 경우, 특정 영역에 서로 다른 채널의 이미지를 촬영하거나, 또는 가습 슬라이드를 유지하고 37 ° C / 5 % CO 2 배양기에서 수동으로 (원하는 시점에서 이미지에 그림을 취할 시간 경과를 설정 더 이상 시간 지점에 권장 1E &amp; F). </li></ol> 4. 분석 및 디스플레이 <ol><li> 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 광 및 FL 병합그래서 하나의 층에 여러 종류의 세포 및 마크로 uorescent 이미지는 동일한 이미지를 볼 수있다. 드래그 앤 각 개별 프로그램에 색상과 메시지가 표시되면, 여러 레이어와 이미지 파일을 만들 수있는 &#39;레이어를 추가&#39;옵션을 선택에 대한 이미지 파일을 삭제합니다. <ol><li> 높은 배율에서 취할 정렬하고 디지털 함께 잘에서 이미지 만들기. 두 이미지 사이의 보존 된 지역보고 완전한 그림이 생성 될 때까지 다른 상단에 하나의 이미지를 오버레이하여 파일을 맞 춥니 다. </li></ol></li><li> 각각의 세포가 마이그레이션 한 거리를 결정 캡처 소프트웨어를 사용하여 수집하는 동안 이미지 미크론 막대를 추가합니다. </li><li> 다양한 시간에 세포 이동을 결정 형광 T 세포 응집 또는 시간에 걸쳐 정량화, 즉 이미지 소프트웨어, ImageJ에 의해 표면 강도 형광을지도한다. <ol><li> 표면 플롯을 생성하는 단계 4.1 및 레이어 창에서 생성 된 레이어 이미지를 촬영하기 위해,원하는 채널에 해당하는 제외한 모든 레이어를 선택 취소합니다. 표면 그림이 EMD 발현을 시각화하고자하는 경우, 예를 들어,이 마커에 사용될 필터에 대응하는 전용 &quot;녹색&quot;층을 보여야한다. </li><li> 이미지를 평평하게하고 프로그램으로 이미지를 (예를 들어, .png를) 인식 할 수있는 파일 형식으로 저장 및로드합니다. 표면 플롯을 생성하기 위해, 8 비트에 이미지 형식을 변경 배경을 줄이기 위해 필요에 따라 밝기 / 명암을 변경하고 &#39;/ 표면 플롯 분석&#39;옵션을 선택합니다. 그림 5의 이미지는 &#39;그늘&#39;, &#39;축 그리기&#39;, &#39;하나의 다각형 당 선&#39;과 &#39;부드러운&#39;체크 박스를 선택하여 생성되었다. </li><li> 대안 적으로, 시간 제로 초점 셀로부터 입금 반경 또는 직경을 측정 할 그리고 상이한 시간 시점에서 최 세포에 비교한다. 테프론 웰의 직경은 6.0 mm이다. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors declare they have no competing financial interests.

단일 세포 현탁액 중의 종양 세포는 테프론 마스크 슬라이드의 웰에 피펫 팅 하였다. 세포가 접착 가능하고 가습 된 5 % CO 2, 37 ℃ 배양기 (도 1a)에 단분자층을 형성 하였다. 단일 층에서 파생 설립 된 단일 층 또는 ECM 단백질은 이러한 분석 (그림 1B) 수확 할 수있다. EMD를 코딩하는 벡터로 중요한 형광 염료로 표지 또는 형질 이펙터 T 림프구 웰을 사용 CSM의 중심으?...

방사형 단층 세포 이동 분석은 원래 세포 외 기질 (ECM) 단백질 5-7 또는 피브로넥틴 또는 라미닌 1,2- 개별 ECM 성분으로 코팅 된 슬라이드 부착 성 종양 세포의 1-4 침윤성 특성을 측정하기 위해 개발되었다. 기술은 스테인레스 스틸 셀 침강 매니 폴드 (CSM)을 사용하여 웰의 중심에 종양 세포의 단일 세포 현탁액을 시딩 관여. 침전 후, 종양 세포는 수평 운동의 속도를 설정하는 데 사용 된 시간과 웰 위에 초기 세포 집단의 직경 변화의 하단에 부착된다. 방사형 단층 세포 이동 분석은 세포의 체외 철새 능력을 분석하는 트랜스 웰 플레이트를 채용 기존의 방법에 비해 시각적 인 장점을 제공; 이러한 분석은 촬상 8 비 이바지. 뿐만 아니라, 또한 평가시기를 선택하는 자유도 다량 구비마이그레이션, 평가된다 시점들의 수에 제한이없는 연구자가 침전 후 이미지를 선택할 수있을 때에요. 이동하는 능력이 특히 그들은 바이러스 벡터에 대한 전달 비히클로서 사용될 수있다 면역 또는 여기서의 영역에서, 비 - 부착 세포에 중요한 기능을하기 때문에, 우리는 미부착 된 세포의 이동을 평가하기 CSM의 사용을 채택 종양 세포 단층상의 종류, ECM 단백질 이외에. 현미경, 또는 개별 ECM 구성 요소에 종양에서 고립 복잡한 ECM에, 가능한 종양 세포 단일 층에 비 부착 세포의 이동을 시각화의 추가 혜택이 분​​석은 다양한 있습니다. 하나의 세포 외 단백질로 코팅 우물을 사용하는 분석은 정확하게 세포가 생체 내에서를 통해 마이그레이션 것 ECM 조직 기판 또는 종양을 반영하지 않습니다. 여기서 우리는 주요 histocomp 민감 alloreactive 세포 독성 T 림프구 (alloCTL)를 사용우리의 대표적인 비 - 부착 세포 유형으로, 단방향 혼합 림프구 종양 세포 반응 (MLTR) 또는 혼합 림프구 반응 (MLR)을 사용하여 구 atibility 복합체 (MHC) 단백질. 우리는 모두 인간과 쥐 기원의 세포를 시험했다. 마이그레이션 종양 단층을 측정 한 결과, 고용 종양 세포가 부분적으로 관련 대상 MHC 분자의 전체 세트와 이펙터, 또는 완전히 관련 목표를 감작하는 데 사용되는 세포 집단에서 발견 동일한 MHC 단백질의 일부​​를 표시되었는지 이펙터를 향해 민감했다. 일부 실험에서, 우리는 이펙터와 대상 세포를 구분하는 형광 CellTracker 레드 CMPTX 또는 세포 증식 염료 eFluor (670)을 사용했다. 또한 세포를 시각화하는 추가적인 방법으로 형광 단백질 바이러스 벡터로 형질 도입 인코딩을 사용했다. 특정 분석을 위해, 우리는 에메랄드 그린 (EMD) 형광 단백질 (10, 11)을 코딩하는 레트로 바이러스 복제 벡터 (RRV)로 alloCTL를 형질 도입; OTH에 대한ERS 종양 세포 mStrawberry 코딩하는 렌티 바이러스 벡터로 형질 도입 하였다. alloCTL 종양 세포 단층에서 수확 종양 세포 단층 또는 ECM 하나의 중심으로 매니 폴드의 채널을 통해 접종 하였다. 점착성 및 비 점착성 세포 상호 작용에 의해 빛 및 / 또는 시간에 따른 형광 현미경에 의해 가시화 하였다. 고전력 파편과 핵 저전력 종양 세포 단일 층 붕괴, 또는 종양 세포는 각각 분해 및 아폽토시스에 의한 세포 손상의 지표였다. 우리는 디지털 단층 배양 위에 미부착 된 형광 T 세포의 이동을 나타내는 표면 형광 세기 맵을 생성. 우리는 또한 세포 독성이 포개어 미부착 alloCTL의 클러스터 형성 후 부착 신경 교종 세포 단층에 생기게 언급. 뿐만 아니라, 신경 교종 단층에 alloCTL에서 RRV-EMD의 수평 전달이 관찰되었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:239px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:312px;">Teflon-masked microscope slides</td>
			<td style="width:203px;">Creative Scientific Methods</td>
			<td style="width:239px;">CSM002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:312px;">Cell Sedimentation Manifold</td>
			<td style="width:203px;">Creative Scientific Methods</td>
			<td style="width:239px;">CSM001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Petri Dish, 150mm</td>
			<td style="width:203px;">Corning</td>
			<td style="width:239px;">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Petri Dish, 35mm</td>
			<td style="width:203px;">Corning</td>
			<td style="width:239px;">430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">21-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">20 &#956;L Pipetman</td>
			<td style="width:203px;">Gilson</td>
			<td style="width:239px;">F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">200 &#956;L Pipetman</td>
			<td style="width:203px;">Gilson</td>
			<td style="width:239px;">F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">200 &#956;L pipette tips</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:239px;">89003-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Distilled, deionized water (sterile)</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">25-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Trypsin</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">25-054-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Celltracker Red CMPTX</td>
			<td style="width:203px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:239px;">C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">TrypLE Express (optional)</td>
			<td style="width:203px;">Gibco</td>
			<td style="width:239px;">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Tumor cell culture media (e.g. DMEM)</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">10-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">AIM-V serum-free media</td>
			<td style="width:203px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:239px;">12055-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:203px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:239px;">FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">SPOT Advanced</td>
			<td style="width:203px;">Diagnostic Instruments</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:203px;">Millipore</td>
			<td style="width:239px;">A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:203px;">BD</td>
			<td style="width:239px;">354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">31/2 x 51/4 Autoclave Pouches</td>
			<td style="width:203px;">Crosstex</td>
			<td style="width:239px;">SCXS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Cell Proliferation eFluor 670</td>
			<td style="width:203px;">eBioscience</td>
			<td style="width:239px;">65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">ImageJ</td>
			<td style="width:203px;">NIH</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radial mobility and cytotoxic function of retroviral replicating vector transduced, non-adherent alloresponsive t lymphocytes

우리는 먼저 형광 표지 된, 비 - 부착 인간 또는 뮤린 효과기 면역 세포의 운동성을 측정하기 위해, 세포 외 기질 단백질에 부착 된 종양 세포의 반경 방향 이동을 측정하는 것으로보고, 방사형 단층 세포 이동 분석법 신규 적응을보고한다. 이 기술은 스테인리스 매니 폴드 10 웰 테플론 슬라이드 국소 적 융합 성 종양 세포 단층 또는 세포 외 기질 단백질로 제조 중 웰로 미부착 된 T 세포를 증착하기 위해 사용한다. 광 및 / 또는 다 채널 형광 현미경은 시간이 지남에 이펙터 세포의 이동 및 동작을 추적하는 데 사용된다. 형광 염료 및 / 또는 형광 유전자에 대한 코드가 차등 이미징 세포 유형에 라벨을 사용하는 바이러스 벡터. 이 방법은 슬라이드 챔버, 한천 또는 트랜스 웰 플레이트를 이용하여 수평 또는 수직 마이그레이션 / 침략을 추적 체외 분석에서 비슷한 유형 구별된다. 분석은 상세한 영상 데이터가 ㄱ 할 수 있습니다특정 형광 마커에 의해 구별 다른 종류의 세포로 수집 된 전자; 세포의 경우에도 특정 하위 집단 (즉, nontransduced / 형질)을 모니터링 할 수 있습니다. 표면 강도 형광 플롯 이주 셀 타입에 대응하는 특정 형광 채널을 이용하여 생성된다. 이것은 특정 시간에 비 부착 면역 세포 이동의 더 나은 시각화 할 수 있습니다. 그것은뿐만 아니라, 세포를 대상으로 같은 세포 독성 또는 이펙터에서 바이러스 벡터의 전송과 같은 다른 이펙터 세포 기능의 증거를 수집 할 수 있습니다. 따라서,이 방법은 연구자들이 다양한 유형의 미시적 부착 세포 차분 적 표지 된, 비 - 부착의 세포 간 상호 작용을 기록 할 수있다. 이러한 정보는 기능의 시각적 증거가 암 치료를위한 이들의 사용 전에 종양 표적 세포에 요구되는 생물학적 활성 또는 조작 면역 세포 유형의 평가에 특히 적합 할 수있다.

형광 단백질 코딩하는 바이러스 벡터는, 또는 그 대신에 형광 염료의에 더하여 사용될 수있다. 바이러스 형질 도입은 운동성 분석에 앞서 수행되어야한다. 두 점착성 및 비 점착성 세포 유형 차등하게 표지 될 수있다. 전달을위한 프로토콜을 이용할 벡터의 종류에 따라 달라질 것이다. 여기서, 우리는 (12)을 설명하는 프로토콜을 사용하는 분석에 앞서도 RRV EMD-3, 5, 6,</str...

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Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.

레이디 얼 이동성 및 레트로 바이러스 복제 벡터 형질 도입, 비 접착 Alloresponsive T 림프구의 세포 독성 기능

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

radial-mobility-cytotoxic-function-retroviral-replicating-vector

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.7K 조회수.  UCLA David Geffen School of Medicine. We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality. 

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

연구

면역학 및 감염병학

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

준비 및 사용 HIV - 1 차 감염된 CD4 + 대상 세포로 T 세포 자연 킬러 세포 세포 독성 Assays에서

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

세포 독성 T Lymphocytes에 의해 베타 세포 죽음의 중재를 평가하는 방법

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

탯줄 혈액에서 세포 독성 T 림프구 확장이 대상 사이토 메갈로 바이러스, 엡스타인 - 바 바이러스, 그리고 아데노 바이러스

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

T Lymphocytes쪽으로 유도 Pluripotent 줄기 세포의 분화 감독

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

분리 및 나이브 CD4 T 림프구의 TH17 분화

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

T 림프구에있는 인테그린 활성화의 연구에 대한 정적 접착 분석

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

인간 팔라티노 편도선에서 B와 T 림프구에 대한 효율적인 분리 프로토콜

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

생성<em&gt; 드 노보</em&gt; 중심 Hemichain의 레트로 바이러스 형질 도입에 의해 항원 특이 적 인간 T 세포 수용체

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...