Soutenu en partie par NIH R01 CA121258, CA125244 R01, R01 CA154256, NIH / RNTAC UCLA CTSI Grant Nombre UL1TR000124, USAMRMC W81XWH-08-1-0734, et le Fonds de recherche Joan S. Holmes Memorial. MJH et GCO reçus soutenus de la Joan S. Holmes Memorial postdoctorale à l&#39;UCLA. Le dispositif CSM a été obtenu à partir de Creative méthodes scientifiques: www.creative-sci.com. Le vecteur lentiviral a été reçue de la UCLA Vecteur de base, qui est soutenu par CURE / P30 DK041301.

1. Préparation de la lame <ol><li> Insérer des diapositives de Manifold cellule de sédimentation dans des sachets de stérilisation et sceller avec du ruban autoclave. La face avec revêtement téflon de la lame du côté papier de la poche pour éviter les dépôts de plastique sur les puits. </li><li> Sachets autoclave pendant 15 min à 121 ° C. </li><li> Sortir les lames du sachet de stérilisation à l&#39;intérieur d&#39;une enceinte de sécurité biologique et placer dans un 150 x 15 mm boîte de Petri stériles. Jusqu&#39;à quatre diapositives peut se adapter par plat. Placez un plat de 35 x 10 mm Petri à côté des diapositives. Ajouter 2-3 ml de H 2 O stérile pour procurer une humidification. </li><li> Diapositives pré-enduire les poly-D-lysine à 100 pg / ml en utilisant un volume suffisant pour bien couvrir l&#39;ensemble. Après une heure à température ambiante, aspirer la solution et rincer la surface du puits deux fois par du PBS 1x pipetage sur la surface des puits. </li><li> Eventuellement, ajoutez la fibronectine ou d&#39;autres composants de l&#39;ECM pour assurer plus forte adhésion des cellules tumorales. Ajouter à la fibronectine 5 ug / ml dans tha assez de volumet les puits ne sèche pas dans un court laps de temps à la température ambiante. <ol><li> Après 1 h, aspirer la solution restes et laver deux fois par pipetage de haut en bas avec 1x PBS. </li></ol></li><li> Gardez PBS sur les puits jusqu&#39;à ce que la tumeur est prêt pour le placage. Utilisation glisse le même jour. </li><li> Récolter un flacon confluent du type de cellules tumorales adhérentes souhaitée. Compter les cellules viables à l&#39;aide de bleu Trypan exclusion de colorant par microscopie optique et remettre en suspension à 5 x 10 6 cellules / ml en croissance par exemple de taille de manière adéquate tamponnée, milieu essentiel minimal de Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), L- glutamine et pyruvate de sodium. </li><li> Si l&#39;imagerie de fluorescence de la population de cellules adhérentes est souhaitée, l&#39;étiquette de la population de cellules adhérentes avec un colorant fluorescent ou un colorant vital de prolifération de cellules en suivant les protocoles fournis par le fabricant. </li><li> Pipette en douceur 10 pi de milieu complet dans chaque puits de la prise en charge de diapositives prendre pour éviter la formation de bulles dans le wells, car ils peuvent empêcher l&#39;adhérence uniforme des cellules tumorales. </li><li> Ajouter 2,5 à 5,0 x 10 4 cellules (5-10 ul de suspension cellulaire) dans le milieu dans chaque puits (figure 1A). Ajuster le nombre optimal selon le type de cellule tumorale et le nombre de jours de croissance souhaités. Cellules tumorales ou des cellules plus grandes croissance rapide peuvent exiger moins de cellules initialement. Amener le volume du puits à 40 pi par addition de milieu et de la pipette de haut en bas pour assurer une distribution uniforme de cellules. </li><li> Après tous les puits sont ensemencées, permettre aux cellules tumorales d&#39;adhérer à la température ambiante, puis placez le couvercle sur le plat 150 x 15 mm Petri et soigneusement déplacer le plat à un incubateur humidifié à 37 ° C / 5% de CO 2 pendant au moins 24 h. </li><li> Changer le milieu de culture quotidienne. Pipetter prudemment une partie du milieu usé de la monocouche et le remplacer par un milieu complet frais. NOTE: En raison de l&#39;évaporation, plus de volume devra être ajouté que ce qui était sorti. Wells sera prêt pour le dosage lorsqu&#39;un même, confluent couche de cellules est présent. Ce est typiquement de 1 à 3 jours après l&#39;ensemencement initial. </li><li> Lavez délicatement monocouche une fois avec PBS comme décrit dans l&#39;étape 1.4 et soit passer à l&#39;étape 2 si monocouches sont souhaitées, ou à l&#39;étape 1.13 ci-dessous pour extraire les protéines d&#39;ECM de la monocouche. </li><li> Ajouter un Triton-X (v / v) solution à 0,5% dans du milieu complet et ajouter 30 ul à chaque puits. Soit en monocouche digérer hotte pendant 2 min, puis laver deux fois avec du milieu complet par pipetage tel que décrit ci-dessus. NOTE: La couche d&#39;ECM peut être visible par microscopie optique (figure 2). Utilisez diapositives tout de suite, ou de garder dans un milieu complet dans le humidifié incubateur à CO 2 pendant 1-2 jours. Ne pas laisser sécher les puits. </li></ol> 2. La sédimentation des cellules T non adhérentes sur la glissière <ol><li> Si l&#39;imagerie de fluorescence de la population de cellules non-adhérentes est souhaitée, étiqueter les populations de cellules non-adhérentes avec un colorant fluorescent vitale, comme CFSE, Cell Tracker Rouge CMPTX ou eFluor670 en suivant les protocoles fournis par le fabricant au moins 1 heure avant l&#39;essai. Alternativement, manipuler des cellules pour exprimer des protéines fluorescentes codées par des vecteurs viraux. </li><li> Autoclave le collecteur de sédimentation des cellules dans un sachet en autoclave comme décrit au point 1.2 ci-dessus. </li><li> Retirer la chambre humidifié contenant des lamelles recouvertes de Teflon de l&#39;incubateur et le placer dans une enceinte de sécurité biologique. </li><li> Laver les puits avec PBS 1x par pipetage de haut en bas, puis ajouter 45 ul de milieu complet contenant au moins 10% de sérum. </li><li> Enlever le collecteur de l&#39;enveloppe de stérilisation et soigneusement coulisser dans les puits au cours jusqu&#39;à ce que le «crochet» à la fin de la rampe touche le fond de la glissière (figure 1B). </li><li> Se assurer que le milieu de culture est visible dans chacun des canaux. Si aucun ne est considéré, enlever le collecteur et ajouter plus de support pour le bien correspondant, puis remplacer et vérifier de nouveau. </li><li> Répétez l&#39;étape 2.5 pour chaque channel du collecteur, ou pour autant de puits désiré. </li><li> Compter les cellules non-adhérentes et remettre à pas moins de 1,0 à 2,0 x 10 5 / ul. Dresser une pi de cellules et de les introduire à la pipette dans le canal (figure 1C) lentement. Pour ce faire, pour chaque puits désiré. </li><li> Laisser l&#39;ensemble du dispositif chargé de la cellule, ce est-collecteur et glissière, l&#39;intérieur de la bio-hotte pendant 20-30 minutes pour permettre aux cellules dans le canal de se déposer. </li><li> Déposer le collecteur en touchant deux extrémités et doucement la soulevant de la lame afin de ne pas déranger les cellules focalement ensemencées dans le centre des puits (figure 1D). </li><li> Inspecter chaque puits pour se assurer que les cellules non adhérentes ont été ensemencées avec succès au centre du puits en respectant la circonférence du canal collecteur. Les cellules non adhérentes seront idéalement légèrement adhérer à la monocouche ou ECM et à l&#39;autre, donc déplacer doucement autour de la glissière ne entraînera pas la pelle cellulairet se disperser. Ne pas bousculer la diapositive. </li></ol> 3. Fluorescence Microscopy <ol><li> Avec un équipement expérimental approprié, effectuer l&#39;imagerie après la sédimentation est confirmée. Idéalement, utiliser un microscope équipé d&#39;une chambre de CO 2 et de l&#39;humidité. L&#39;image à faible puissance, ce est-4X ou 10X, afin de permettre plusieurs images à prendre une plus grande surface de telle sorte que la totalité du puits peut être vu. </li><li> Acquérir des images numériques en utilisant un logiciel de capture d&#39;image. Effectuer clair et / ou l&#39;imagerie de fluorescence multi-canal. </li><li> Si vous le souhaitez, mettre en place un time-lapse pour enregistrer des images de différents canaux sur une zone donnée, ou garder la diapositive humidifié et dans un / 5% de CO 2 incubateur à 37 ° C et manuellement prendre à l&#39;image aux points de temps souhaités (Figure 1E &amp; F, recommandée pour les points de temps plus longues). </li></ol> 4. Analyse et affichage <ol><li> En utilisant le logiciel de retouche d&#39;image, de fusionner la lumière et flimages fluorescents en types de cellules une couche de sorte que plusieurs marqueurs et peut être vu dans la même image. Glissez et déposez les fichiers d&#39;image pour chaque couleur dans le programme et, lorsque vous êtes invité, sélectionnez l&#39;option «Ajouter un calque&quot; pour créer un fichier d&#39;image avec de multiples couches. <ol><li> A plus fort grossissement, prendre, aligner et assembler des images sur le bien numérique. Alignez fichiers en regardant les régions conservées entre deux images et de superposer une image sur le dessus de l&#39;autre jusqu&#39;à ce qu&#39;une image complète est générée. </li></ol></li><li> Ajouter des barres de micron aux images lors de l&#39;acquisition en utilisant le logiciel de capture pour déterminer la distance des cellules individuelles ont migré. </li><li> Pour déterminer la migration des cellules à différents moments, faire des cartes de fluorescence d&#39;intensité de surface avec le logiciel d&#39;image, ce est à dire, ImageJ, de quantifier l&#39;agrégation des cellules T fluorescent ou étalée dans le temps. <ol><li> Pour générer des parcelles de surface, prendre une image en couches généré à l&#39;étape 4.1 et sous la fenêtre Calques,décochez toutes les couches sauf ceux correspondant à la chaîne souhaitée. Par exemple, si une parcelle de surface on souhaite visualiser l&#39;expression EMD, seules les couches «verts» correspondant au filtre utilisé pour ce marqueur doit être visible. </li><li> Aplatir l&#39;image et l&#39;enregistrer dans un format de fichier reconnu (par exemple, .png) et charger l&#39;image dans le programme. Pour générer le tracé de la surface, changer le type d&#39;image à 8 bits, modifier la luminosité / contraste nécessaire pour réduire fond, et sélectionnez l&#39;option «Analyser Terrain / Surface. Les images de la figure 5 ont été générés par la vérification de la &#39;Ombre&#39;, &#39;Dessiner Axe »,« un polygone par ligne », et des cases à cocher« lisse ». </li><li> Sinon, prendre des mesures en utilisant le rayon ou le diamètre du dépôt de la cellule focale au temps zéro et comparer aux cellules au point le plus extérieur à des moments différents. Le diamètre du puits est de Teflon 6,0 mm. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors declare they have no competing financial interests.

Les cellules tumorales dans une suspension de cellules uniques ont été introduits à la pipette dans les puits d&#39;une lame de téflon masqué. Les cellules ont été laissées à adhérer et ensuite formé des monocouches dans un humidifiée à 5% de CO2, 37 ° C incubateur (figure 1A). Monocouches établies ou des protéines de la MEC dérivés de la monocouche peuvent être récoltées pour ces dosages (figure 1B). Lymphocytes T effecteurs marqués avec des colorants f...

Le dosage migration cellulaire Radial monocouche a été initialement développé pour mesurer les propriétés d&#39;infiltration de cellules tumorales adhérentes 1-4 sur des lames revêtues de la matrice extracellulaire (ECM) protéines 5-7 ou avec des composants ECM individuelles, telles que la fibronectine ou la laminine 1,2. La technique implique l&#39;ensemencement d&#39;une suspension cellulaire unique de cellules tumorales dans le centre du puits en utilisant un collecteur de cellules sédimentation en acier inoxydable (CSM). Après sédimentation, les cellules tumorales se conformer au fond du puits et de la variation dans le diamètre de la population initiale de cellules au cours du temps a été utilisée pour établir un taux de mobilité horizontale. Le dosage migration cellulaire Radial monocouche fourni un avantage visuel sur les autres méthodes existantes qui emploient transwell plaques pour doser les capacités migratoires in vitro de cellules; ces tests sont non-propice à l&#39;imagerie 8. En outre, il a également fourni une grande liberté dans le choix du timepoints lorsque la migration est évalué, sans aucune limite sur le nombre de points dans le temps un chercheur pourrait choisir d&#39;image après la sédimentation. Étant donné que la capacité de migrer est une fonctionnalité importante pour les cellules non adhérentes, en particulier dans le domaine de l&#39;immunothérapie ou où ils peuvent être utilisés comme véhicules de délivrance de vecteurs viraux, nous avons adapté l&#39;utilisation du CSM afin d&#39;évaluer la migration des cellules non-adhérentes types sur des monocouches de cellules tumorales, en plus des protéines de la MEC. L&#39;avantage supplémentaire de la visualisation au microscope la migration de cellules non-adhérentes sur des monocouches de cellules viables de la tumeur, sur ECM complexe isolé de la tumeur, ou sur des composants individuels de l&#39;ECM rend ce test polyvalent. Les dosages qui utilisent des puits revêtus avec une seule protéine extracellulaire ne reflètent pas de façon précise le substrat de tissu ou de tumeur ECM les cellules migrer à travers seraient in vivo. Ici, nous avons utilisé alloréactives lymphocytes T cytotoxiques (alloCTL), sensibilisés aux histocomp majeureatibility complexe (MHC) des protéines en utilisant des réactions de cellules tumorales de lymphocytes mixtes à une voie (MLTR) ou des réactions lymphocytaires mixtes (RLM) 9, comme notre type cellulaire non adhérente représentant. Nous avons testé les cellules d&#39;origine tant humaine et murine. Lorsque la migration a été mesurée sur des monocouches tumorales, les cellules tumorales employées étaient des cibles partiellement pertinentes, l&#39;affichage de certaines des mêmes protéines CMH trouvés sur la population de cellules utilisé pour sensibiliser les effecteurs, ou des cibles totalement pertinentes, avec un ensemble complet de molécules du CMH que le effecteurs avaient été sensibilisés envers. Dans certaines expériences, nous avons utilisé CellTracker fluorescent ou un colorant rouge CMPTX de prolifération cellulaire eFluor 670 pour différencier entre les cellules effectrices et cibles. Nous avons également utilisé transduction avec des vecteurs viraux codant pour des protéines fluorescentes comme un moyen supplémentaire pour visualiser les cellules. Pour certains essais, nous transduites l&#39;alloCTL avec des vecteurs de réplication rétroviraux (VRR) de codant pour Emerald Green (EMD) de la protéine fluorescente 10,11; pour OTHteurs, les cellules tumorales ont été transduites avec les vecteurs lentiviraux codant pour mStrawberry. Le alloCTL ont été ensemencées à travers un canal du collecteur dans le centre de soit des monocouches de cellules tumorales ou ECM récoltées à partir de monocouches de cellules tumorales. Les interactions des cellules adhérentes et non adhérentes ont été visualisées par lumière et / ou par microscopie de fluorescence au cours du temps. Perturbation dans la monocouche de cellules tumorales à faible puissance, ou les cellules tumorales avec des noyaux fragmentés à forte puissance étaient indicateurs de dommage cellulaire par lyse et l&#39;apoptose, respectivement. Nous numériquement créé cartes fluorescentes d&#39;intensité de surface montrant la migration des cellules T fluorescent non-adhérentes sur les cultures en monocouche. Nous avons également noté la cytotoxicité engendré à la monocouche cellulaire de gliome adhérente après la formation du groupe de l&#39;alloCTL non adhérente superposée. En outre, la transduction horizontal de RRV-EMD de la alloCTL à la monocouche de gliome a été observée.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="920">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:203px;">Company</td>
			<td style="width:239px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:312px;">Teflon-masked microscope slides</td>
			<td style="width:203px;">Creative Scientific Methods</td>
			<td style="width:239px;">CSM002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:312px;">Cell Sedimentation Manifold</td>
			<td style="width:203px;">Creative Scientific Methods</td>
			<td style="width:239px;">CSM001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Petri Dish, 150mm</td>
			<td style="width:203px;">Corning</td>
			<td style="width:239px;">430597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Petri Dish, 35mm</td>
			<td style="width:203px;">Corning</td>
			<td style="width:239px;">430588</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">21-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">20 &#956;L Pipetman</td>
			<td style="width:203px;">Gilson</td>
			<td style="width:239px;">F123600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">200 &#956;L Pipetman</td>
			<td style="width:203px;">Gilson</td>
			<td style="width:239px;">F123601</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">200 &#956;L pipette tips</td>
			<td style="width:203px;">VWR</td>
			<td style="width:239px;">89003-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Distilled, deionized water (sterile)</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">25-055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Trypsin</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">25-054-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Celltracker Red CMPTX</td>
			<td style="width:203px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:239px;">C34552</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">TrypLE Express (optional)</td>
			<td style="width:203px;">Gibco</td>
			<td style="width:239px;">12604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Tumor cell culture media (e.g. DMEM)</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">10-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">AIM-V serum-free media</td>
			<td style="width:203px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:239px;">12055-083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td style="width:203px;">Omega Scientific</td>
			<td style="width:239px;">FB-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:203px;"></td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">SPOT Advanced</td>
			<td style="width:203px;">Diagnostic Instruments</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Poly-D-Lysine</td>
			<td style="width:203px;">Millipore</td>
			<td style="width:239px;">A-003-E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:203px;">BD</td>
			<td style="width:239px;">354008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:312px;">31/2 x 51/4 Autoclave Pouches</td>
			<td style="width:203px;">Crosstex</td>
			<td style="width:239px;">SCXS2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Trypan Blue</td>
			<td style="width:203px;">Mediatech</td>
			<td style="width:239px;">25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">Cell Proliferation eFluor 670</td>
			<td style="width:203px;">eBioscience</td>
			<td style="width:239px;">65-0840-85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:312px;">ImageJ</td>
			<td style="width:203px;">NIH</td>
			<td style="width:239px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

radial mobility and cytotoxic function of retroviral replicating vector transduced, non-adherent alloresponsive t lymphocytes

Nous rapportons une nouvelle adaptation du dosage Cell Migration radiale monocouche, d&#39;abord rapporté pour mesurer la migration radiale des cellules tumorales adhérentes sur les protéines de la matrice extracellulaire, pour la mesure de la motilité de cellules immunitaires marquées par fluorescence, les droits non adhérente ou effectrices murin. Cette technique utilise un collecteur en acier inoxydable et lame de Téflon 10 puits à déposer focalement cellules T non adhérentes dans des puits préparés soit avec des monocouches de cellules tumorales confluentes ou des protéines de la matrice extracellulaire. La microscopie par fluorescence de lumière et / ou multi-canal est utilisé pour suivre le mouvement et le comportement des cellules effectrices dans le temps. Les colorants fluorescents et / ou des vecteurs viraux qui codent pour des transgènes fluorescents sont utilisés pour marquer de manière différentielle les types de cellules pour l&#39;imagerie. Cette méthode est distincte de type semblable dans des essais in vitro qui suivent horizontale ou verticale migration / invasion utilisant des chambres de diapositives, l&#39;agar ou transwell plaques. Le test permet aux données d&#39;imagerie détaillées à Be recueillies avec différents types de cellules qui se distinguent par des marqueurs fluorescents spécifiques; même sous-populations spécifiques de cellules (ce est à dire, une transduction / nontransduced) peuvent être surveillés. Surface parcelles de fluorescence d&#39;intensité sont générées en utilisant des canaux de fluorescence spécifiques qui correspondent au type de cellule en cours de migration. Cela permet une meilleure visualisation de la mobilité immunitaire non-adhérent cellulaire à des moments précis. Il est possible de recueillir des preuves d&#39;autres fonctions des cellules effectrices, telles que la cytotoxicité ou le transfert des vecteurs viraux de l&#39;effecteur aux cellules cibles, aussi bien. Ainsi, le procédé permet aux chercheurs de documenter les interactions de microscope marqués de façon différentielle, non adhérente de cellule à cellule avec les cellules adhérentes de différents types. Ces informations peuvent être particulièrement pertinent dans l&#39;évaluation de types de cellules immunitaires biologiquement actif ou manipulées, où une preuve visuelle de la fonctionnalité est recherchée avec les cellules cibles de tumeur avant leur utilisation pour le traitement du cancer.

Les vecteurs viraux codant pour des protéines fluorescentes peuvent être utilisées en plus ou à la place de, un colorant fluorescent. Transduction virale doit être effectuée à l&#39;avance de l&#39;essai de motilité. Les deux types de cellules adhérentes et non adhérentes peuvent être différentiellement étiquetés. Le protocole de transduction dépendra du type de vecteur utilisé. Ici, nous transduites l&#39;alloCTL dans les figures 3, 5 et 6 avec RRV-EMD au moins deux jou...

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Radial Mobility and Cytotoxic Function of Retroviral Replicating Vector Transduced, Non-adherent Alloresponsive T Lymphocytes

We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality.

Radial Mobilité et cytotoxiques fonction de réplication rétrovirale Vector transduits, non-adhérent Alloresponsive lymphocytes T

We report a novel adaptation of the Radial Monolayer Cell Migration assay, first reported to measure the radial migration of adherent tumor cells on ...

radial-mobility-cytotoxic-function-retroviral-replicating-vector

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.7K vues.  UCLA David Geffen School of Medicine. We describe a protocol to monitor radial mobility of non-adherent immune cells in vitro using a cell sedimentation manifold/slide apparatus. Cell migration is tracked on monolayers of tumor cells or on extracellular matrix proteins. Examination by light and fluorescence microscopy allows for observation of cell mobility and cytotoxic functionality. 

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

Transduction rétrovirale des récepteurs de cellules T dans les lymphocytes T de souris

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Recherche

Immunologie et infection

Preparation and Use of HIV-1 Infected Primary CD4+ T-Cells as Target Cells in Natural Killer Cell Cytotoxic Assays

Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK cells to recognize and lyse HIV-1 infected cells because identifying any aberrancy in NK cell function against HIV-infected cells could potentially lead to therapies that would enhance their cytolytic activity. There is a need to use HIV-infected primary T-cell blasts as target cells rather then infected-T-cell lines in the cytotoxicity assays. T-cell lines, even without infection, are quite susceptible to NK cell lysis. Furthermore, it is necessary to use autologous primary cells to prevent major histocompatibility complex class I mismatches between the target and effector cell that will result in lysis. Early studies evaluating NK cell cytolytic responses to primary HIV-infected cells failed to show significant killing of the infected cells 1,2. However, using HIV-1 infected primary T-cells as target cells in NK cell functional assays has been difficult due the presence of contaminating uninfected cells 3. This inconsistent infected cell to uninfected cell ratio will result in variation in NK cell killing between samples that may not be due to variability in donor NK cell function. Thus, it would be beneficial to work with a purified infected cell population in order to standardize the effector to target cell ratios between experiments 3,4. Here we demonstrate the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected cells by taking advantage of HIV-1's ability to down-modulate CD4 on infected cells and the availability of commercial kits to remove dead or dying cells 3-6. The purified infected primary T-cell blasts can then be used as targets in either a degranulation or cytotoxic assay with purified NK cells as the effector population 5-7. Use of NK cells as effectors in a degranulation assay evaluates the ability of an NK cell to release the lytic contents of specialized lysosomes 8 called "cytolytic granules". By staining with a fluorochrome conjugated antibody against CD107a, a lysosomal membrane protein that becomes expressed on the NK cell surface when the cytolytic granules fuse to the plasma membrane, we can determine what percentage of NK cells degranulate in response to target cell recognition. Alternatively, NK cell lytic activity can be evaluated in a cytotoxic assay that allows for the determination of the percentage of target cells lysed by release of 51Cr from within the target cell in the presence of NK cells.

Cytotoxicity assays to measure natural killer cell lytic responses to HIV-infected cells is limited by the purity of the target cells. We demonstrate here the isolation of a highly purified population of HIV-1 infected primary T-cell blasts by taking advantage of HIV-1 s ability to down-modulate CD4.

Préparation et utilisation de VIH-1 primaires CD4 + T-cellules comme cellules cibles dans des cellules tueuses naturelles Tests cytotoxiques

 Natural killer (NK) cells are a vital component of the innate immune response to virus-infected cells. It is important to understand the ability of NK ...

Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

Méthodes d&#39;évaluation bêta Mediated la mort cellulaire par les lymphocytes T cytotoxiques

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

L&#39;expansion des lymphocytes T cytotoxiques à partir de sang de cordon ombilical qui cytomégalovirus cible, le virus Epstein-Barr Virus et Adénovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

Différenciation dirigée des cellules souches pluripotentes induites à l&#39;égard des lymphocytes T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

L&#39;isolement et la différenciation Th17 de Naïve CD4 des lymphocytes T

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Statique Essai d&#39;adhésion pour l&#39;étude de l&#39;intégrine activation dans les lymphocytes T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

Protocole d&#39;isolation efficace pour B et les lymphocytes T à partir des amygdales palatines humaines

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively. The vast array of TCRs proves studying a specific antigenic response difficult. Therefore, TCR transgenic mice were made to study positive and negative selection in the thymus as well as peripheral T cell activation, proliferation and tolerance. However, relatively few TCR transgenic mice have been generated specific to any given antigen. Thus, studies involving TCRs of varying affinities for the same antigenic peptide have been lacking. The generation of a new TCR transgenic line can take six or more months. Additionally, any specific backcrosses can take an additional six months. In order to allow faster generation and screening of multiple TCRs, a protocol for retroviral transduction of bone marrow was established with stoichiometric expression of the TCR&#945; and TCR&#946; chains and the generation of retrogenic mice. Each retrogenic mouse is essentially a founder, virtually negating a founder effect, while the length of time to generate a TCR retrogenic is cut from six months to approximately six weeks. Here we present a rapid and flexible alternative to TCR transgenic mice that can be expressed on any chosen background with any particular TCR.

We present a rapid and flexible protocol for a single T cell receptor (TCR) retroviral-based in vivo expression system. Retroviral vectors are used to transduce bone marrow progenitor cells to study T cell development and function of a single TCR in vivo as an alternative to TCR transgenic mice.

Rétrovirale transduction des cellules progénitrices de la moelle osseuse pour générer des cellules T Receptor Retrogenic Souris

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, cloning TCRs specific for various tumor-associated antigens has been the goal of many studies. To elicit an effective T cell response, the TCR must recognize the target antigen with optimal affinity. However, cloning such TCRs has been a challenge and many available TCRs possess sub-optimal affinity for the cognate antigen. In this protocol, we describe a method of cloning de novo high affinity antigen-specific TCRs using existing TCRs by exploiting hemichain centricity. It is known that for some TCRs, each TCR&#945; or TCR&#946; hemichain do not contribute equally to antigen recognition, and the dominant hemichain is referred to as the centric hemichain. We have shown that by pairing the centric hemichain with counter-chains differing from the original counter-chain, we are able to maintain the antigen specificity, while modulating its interaction strength for the cognate antigen. Thus, the therapeutic potential of a given TCR can be improved by optimizing the pairing between the centric and counter hemichains.

Generating De Novo Antigen-specific Human T Cell Receptors by Retroviral Transduction of Centric Hemichain

Herein we describe a novel method to generate antigen-specific T cell receptors (TCRs) by pairing the TCR&#945; or TCR&#946; of an existing TCR, possessing the antigen-specificity of interest, with complementary hemichain of the peripheral T cell receptor repertoire. The de novo generated TCRs retain antigen-specificity with varying affinity.

Générateur<em&gt; De Novo</em&gt; Spécifiques de l&#39;antigène T Human cellulaires Receptors par rétrovirale transduction de Centric Hemichain

T cell receptors (TCRs) are used clinically to direct the specificity of T cells to target tumors as a promising modality of immunotherapy. Therefore, ...