Biz bir destekleyici ve coşkulu bir araştırma ortamı sağlamak için Rubenstein laboratuar mevcut ve eski üyeleri teşekkür ederiz. Biz protokol optimizasyonu konusunda yardım almak için Ryan T. Gibson teşekkür ederim. Biz maya suşları ve plazmidler Mark Hochstrasser (Yale Üniversitesi) ve Dieter Kurt (Universität Stuttgart) teşekkür ederim. Biz bu yazının netlik ve programı geliştirmeye yardım ettikleri için anonim yorumcular teşekkür ederiz. Bu çalışma SGW&#39;den Sigma Xi Ball State Üniversitesi bölümünden bir araştırma ödülü tarafından desteklenen, Ball State Üniversitesi Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri (R15 GM111713) EMR için, EMR bir Ball State Üniversitesi aspire araştırma ödülü ve fonlar Provost Ofisi ve Biyoloji Bölümü.

Protein Bozulması Arızalı Aday Mutantlarına tanımak 1. Maya Büyüme Deneyi <ol><li> Bir raportör metabolik enzim, çerçeve içinde, erimiş kararsız bir proteini kodlayan bir plasmid ile vahşi tip ve mutant maya hücreleri dönüştürmek. </li><li> Plazmid moleküllerini taşıyan hücreler için seçici olan sentetik tanımlı (SD) minimal ortam 5 ml transformantların inoküle. Döner, 30 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. </li><li> Her bir gece boyunca kültür, 600 nm&#39;de (OD600) &#39;deki optik yoğunluk ölçülür. NOT: Bir gece inkübe edildikten sonra, kültür içindeki hücreler, ya logaritmik veya sabit gelişme fazında olabilir, fakat en az bir OD 0.2 600 ulaşmış olmalıdır. Ampirik bir şekilde tespit gibi çok yavaş büyüyen maya cinsleri, hücrelerin daha fazla sayıda inkübasyon süresi daha uzun bir gece veya aşılama gerektirebilir. </li><li> Bir seyreltilmiş hücreleri ile başlayan, bir steril 96 oyuklu bir plaka içerisinde dönüştürülen maya hücrelerinin altı kat seri dilüsyonları hazırlanmasın, OD 0.2 600. 96 gözlü plaka içindeki farklı üst üste denenecek her biri maya transformant yerleştirin. <ol><li> Her bir transformant için, 200 ul nihai hacim içinde 0.2 OD 600 hücreleri sulandırmak için gerekli olan bir gece boyunca kültür hacmi hesaplamak. 200 ul hacmi getirmek için steril su içinde uygun miktarda Sütun 1&#39;de de karşılık gelen, gece boyunca bu kültür hacim. </li><li> Maya her satır için, Sütun 2, 3 ve 4 kuyulara steril su, 125 ul ilave edin. Not: ayrı paketlenmiş steril 96-yuvalı plakalar, steril kapaklar ile paketlenebilir. Kapaklar bu adımda dağıtılır, steril su için rezervuar olarak kullanılabilmektedir. Bu çok kanallı bir pipet ile belirli bir sütunda tüm oyuklara steril su eşzamanlı transferi sağlar. </li><li> Yukarı pipetleme ve bir çok kanallı pipet aşağı ilk sütuna (OD 0.2 600 seyreltilmiş maya) içeriğini karıştırın. </li><li> TransfBir çok kanallı pipet kullanarak sütun 2 Sütun 1 maya 25 ul, er. Yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. Aktarım Sütun 3 Sütun 2 25 ul ve sütun 3 den Sütun 4 25 ul (her adımda iyi karıştırma). </li></ol></li><li> Bir çok kanallı pipet ile her bir örnek karıştırın. En seyreltilmiş hareketle en uygun seçici ortamı içeren iki plakalar üzerine maya, pipet, her numunenin 4 ul sütunları sulandırmak için. Plazmid seçimi (bu plaka maya lekelenme ve büyüme kontrolü olarak hizmet vermektedir) korur ortamı ile bir tabak kullanın. Raportör enzime bağlı kararsız protein plazmid muhafaza ve ekspresyonu için seçim ortamı ile bir ikinci plaka kullanın. Maya hızla yerleşmek için, düzenli aralıklarla yukarı pipetleme ve aşağı hücreleri karıştırın. Not: Kurutucu plakalar daha kolay bir şekilde taze hazırlanmış plakalar daha sıvı absorbe edecek ve bu nedenle, bu deneyler için tavsiye edilir. Nemli plakalar lo oda sıcaklığında kuluçkalama ile kurutulabilirbir laminar akış başlığı içinde 2 gün ya da daha kısa bir inkubasyon - 1 ağırlık nem. Laminar hava akımı tezgah paralel ise Tabaklar dengesiz kuruyabilir. Bir şablonun kullanımı kolay düzenli mesafelerde maya hücreleri görmenizi sağlar. İki örnek şablonlar, Şekil 1 &#39;de verilmiştir. Bu, baskılı üzerinden kesilir ve bir Petri kabı, kapağın iç tarafında olabilir. </li><li> Plakalar tezgah üstünde kurumaya bırakın. </li><li> 6 gün - 2, 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, her plaka fotoğraf. </li></ol><img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52428/52428fig1large.jpg" width="650" /> 100 mm agar plakaları üzerine maya hücreleri tespit için Şekil 1 şablonlar. Bu şablonlar, çok kanallı bir pipet ile düzenli aralıklarda maya tespit kolaylaştırmak için kullanılabilir. Şablonlar, baskılı kesip, ve bir Petri kabı kapağının içine yapıştırılmış olabilir. Büyüme ile Petri kabı yerleştirinşablon orta kapağının iç kısmına yapıştırılmıştır. Şablonlar yönünü izlemek için bir çentik ile işaretlenmiştir. Bu büyüme deneylerinde kullanılan plakalar Benzer yönünü izlemek için bir çentik ile işaretlenmiş olması tavsiye edilir. Dört (A) veya beş (B) maya hücrelerinin seri seyreltme sağlanır tespit için şablonlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52428/150126 Fig 1.pdf" target="_blank">100 mm şablonları ile bu rakamın bir yazdırılabilir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Maya Büyüme Testi 2. Biyokimyasal Onayı <ol><li> Maya Hücreleri ve Post-Alkali Protein Ekstraksiyon Büyüme (31 değiştirilmiş) <ol><li> Kararsız bir proteini kodlayan bir plasmid ile vahşi tip ve mutant maya hücreleri dönüştürmek. </li><li> Plazmid moleküllerini taşıyan hücreler için seçici olan SD ortamı 5 ml transformantların inoküle. Döner, 30 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. </li><li> Her gecede cu OD 600 ölçünlture. NOT: Bir gece inkübe edildikten sonra hücreler, ya logaritmik veya sabit gelişme fazında olabilir, fakat 0.2 10 ml taze seçici ortam (aşama 2.1.4) OD 600 seyreltme izin verecek bir OD 600 ulaşmış olmalıdır. Ampirik bir şekilde tespit gibi çok yavaş büyüyen maya cinsleri, hücrelerin daha fazla sayıda inkübasyon süresi daha uzun bir gece veya aşılama gerektirebilir. </li><li> 0.2 10 ml taze seçici ortam içinde, bir OD 600 maya hücreleri seyreltin. </li><li> Kültürler (orta-logaritmik büyüme olan yani) 0.8 ve 1.2 arasında bir OD 600 ulaşıncaya kadar, döner veya çalkalama, 30 ° C&#39;de kuluçkalayın devam edin. Not: İlgili kararsız proteini, bir düzenlenebilir promoterin kontrolü altında ise, protein ifadesi ve hücre hasat indüksiyonu için en uygun zamanlama önceki çalışmalarda ya da deneysel gözlemlere göre değişebilir. </li><li> 15-ml&#39;lik konik kültür 2.5 OD 600 birimleri toplayınOda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5000 x g&#39;de santrifüj ile ark tüpü. Pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı. Not: 600 birim 1.0 OD 600 kültürün 1 ml maya mevcut miktarı olarak tanımlanır bir OD. V = 2.5 OD 600 birim / Ölçülen OD 600: 2.5 OD 600 birim (V) hasat için gereklidir (ml) kültür hacmi, aşağıdaki denklem kullanılarak belirlenebilir </li><li> 1 ml tekrar süspansiyon hücreleri distile su. Bir mikrosantrifüj tüp askıya hücreleri aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 6500 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. Pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı. </li><li> 100 ul süspanse hücreleri aşağı veya yukarı vorteksleme pipetleme tarafından damıtılmış su ve 100 ul 0.2 M NaOH ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 18.000 x santrifüj (henüz proteinleri serbest ve hala canlı olan değil çoğu) Pelet hücreleri5 dakika boyunca örn. Pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı. </li><li> Yukarı ve aşağı pipetleme veya vorteks ile, hücreleri lize olacak 100 ul 1x Laemmli numune tamponu, - 50 süspanse pelet. Not: santrifüj ve Laemmli numune tampon maddesi içinde hücrelerin daha sonra yeniden süspansiyonu aşağıdaki alkali yüzer uzaklaştırılması bir Tris-glisin çalışan tamponu sistemi ve Batı lekeleme ile sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile uyumlu bir pH&#39;da proteinleri ayıklar. </li><li> Tam proteinleri denatüre etmek için 5 dakika boyunca 95 ° C &#39;de lizatları inkübe edin. Not: 95 ° C de inkübe toplama eğilimli proteinler (çok sayıda zar-ötesi bölümler ile, örneğin proteinler) çözünmez hale gelebilir. Bu nedenle, Lizatlar daha düşük sıcaklıklarda inkübe edilmelidir (örneğin, 37 ° C - 70 ° C), 10 - 30 dakika sonra gibi ampirik proteinlerin analizi için, tespit edilmiştir. </li><li> 5 dakika buz üzerine koyarak serin lizatları. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 18,000 x g&#39;de santrifüjleyin lizatları çözünmeyen malzeme peletlendi. Önce, sonra Western blot analizi (kısım 2.2) SDS-PAGE ile süpernatant (çözünmüş ekstre protein), ayırın. Alternatif olarak, -20 ° C&#39;de mağaza lizatları. </li></ol></li><li> Örnek Western Blot Protokolü <ol><li> Bir SDS-PAGE jeli içinde lizatlarının ampirik bir biçimde tespit hacmi yükleyin. </li><li> Boya ön kadar 200 V jel çalıştırın jel alt ulaşmıştır. </li><li> 4 ° C&#39;de 90 dakika - 60 20 V ıslak transferi poliviniliden florür (PVDF) membrana jel proteinleri aktarın. </li><li> 4 ° C &#39;de bir gece boyunca, oda sıcaklığında 1 saat süre ile, sallanan ya Tris-tamponlu Tuzlu su (TBS) içinde% 5 yağsız süt içinde inkübe edilerek blok membran. </li><li> Çözüm engelleme Durusu. </li><li> Oda sıcaklığına 1 saat süre ile% 0.1 Tween-20 (TBS / T) ile TBS içinde% 1 yağsız süt içinde (ya da bunların epitop) başta ilgi konusu olan proteini için spesifik bir antikor ile membran inkübemperature, sallanan. </li><li> Antikor çözeltisi boşaltacaktır ve sallanan, oda sıcaklığında TBS / T ile membran 3 x 5 dk yıkayın. </li><li> Sallanan, oda sıcaklığında 1 saat süre ile TBS / T içinde% 1 yağsız süt uygun fluorofor-konjuge sekonder antikor ile membran inkübe edin. Not: flüoroforlar ışığa duyarlı olduğu için, florofor konjuge antikor seyreltileri karanlıkta hazırlanmalıdır. Buna ek olarak, florofor-konjuge antikor varlığında membran inkübasyon ışık geçirmeyen kaplarda gerçekleşmelidir. Bu alüminyum folyo ile inkübasyon tepsiler sarılarak yapılabilir. </li><li> Antikor çözeltisi boşaltacaktır ve sallanan, oda sıcaklığında TBS / T ile membran 3 x 5 dk yıkayın. </li><li> Üretici tavsiyelerine göre, Li-Cor Odyssey CLX kullanarak membran ve Görüntü Studio yazılımı (veya benzer görüntüleme cihazları ve yazılım) görüntü elde. </li><li> Membran görüntüleme sonra, bir yük için spesifik bir primer antikor ile membran inkübesallanan, oda sıcaklığında 1 saat süre ile TBS / T içinde% 1 yağsız süt kontrol proteini ing. </li><li> Antikor çözeltisi boşaltacaktır ve sallanan, oda sıcaklığında TBS / T ile membran 3 x 5 dk yıkayın. </li><li> Sallanan, oda sıcaklığında 1 saat süre ile TBS / T içinde% 1 yağsız süt uygun fluorofor-konjuge sekonder antikor ile membran inkübe edin. </li><li> Antikor çözeltisi boşaltacaktır ve sallanan, oda sıcaklığında TBS / T ile membran 3 x 5 dk yıkayın. </li><li> Üretici tavsiyelerine göre, Li-Cor Odyssey CLX kullanarak membran ve Görüntü Studio yazılımı (veya benzer görüntüleme cihazları ve yazılım) görüntü elde. </li></ol></li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada yer alan yöntem hızlı bir şekilde belirlenmesi ve maya hücrelerinde protein yıkımı genetik gereklerine biyokimyasal onay sağlar. Bu deneyler () (örn 41-44, taşıma, depolama ve maya hücreleri manipüle etmek için protokollerin maya biyoloji birkaç mükemmel değerlendirmeleri ve derlemeler organizmaya yeni müfettişler için mevcuttur) programı ve güç maya modeli ökaryotik organizma olarak vurgulayın. teknikler kolayca protein sınıflarının birçok degradasyonunu ve boll...

Seçici protein yıkımı ökaryotik yaşam için gerekli olduğunu ve değiştirilmiş protein yıkımı, çeşitli kanser tipleri, nörodejeneratif hastalıklar, kardiyovasküler hastalıklar ve sistik fibrozis 1-5 dahil olmak üzere tıbbi koşullar, bir dizi katkıda bulunur. seçici protein degradasyonunu katalize ubikitin-proteazom sistemi (UPS), bu koşullar 6-10 için gelişmekte olan bir tedavi edici hedeftir. Ubikitin ligaz kovalent proteinler 11 76-amino asit ubikitinin polimerleri takın. Poliübikütin zincirleri ile işaretlenmiş proteinler tanınan ve ~ 2.5 megadalton 26S ile 12 proteazom proteolizlenmiş edilir. Model ökaryotik organizma Saccharomyces cerevisiae (çiçek mayası) başlatılan çalışmalar ökaryotik hücrelerde protein yıkımı mekanizmaların açıklanması, temel olmuştur. UPS ilk gösterdi fizyolojik substrat MATα2 13 maya transkripsiyon represörü oldu, UPS 14 ve çok sayıda yüksek derecede korunmuş bileşenler ilk olarak tespit edilmiştir ya da (örneğin, 15-26), maya ile karakterize edilir. Bu çok yönlü ve genetik uysal model organizma yapılan Keşifler ubikuitin-aracılı bozulması korunmuş mekanizmaları önemli açılımlar sağlamaya devam etmesi muhtemeldir. Çoğu UPS yüzeylerde tanınması ve yıkımı birden proteinlerin uyumlu eylem gerektirir. Bu nedenle, belirli bir kararsız proteinin düzenlenmiş bozulmasını karakterize önemli bir gol proteoliz genetik gereksinimlerini belirlemektir. Memeli ya da maya hücrelerinde protein degradasyonunu izlenmesi için klasik yaklaşımları (örneğin, darbe kovalayıcı ve sikloheksimid kovalayıcı deneyler, 27), zahmetli ve zaman alıcı bir iştir. Yöntem bu tür protein degradasyonunu tespit etmek için çok hassas bir araç temin ederken, protein parçalanması ya da büyük ölçekli bir screeni hızlı analizi için uygun değildirProtein bozulmasını önlemek mutasyonlar için ng. Burada, kararsız proteinlerin bozunması için genetik gereklerine hızlı tespit edilmesi için bir maya gelişimi bazlı analiz sunulmuştur. Protein degradasyonunu, ilgi (ya da bozulma sinyali) kararsız bir protein analiz etmek için maya gelişimi dayalı yöntemde, belirli koşullar altında maya büyümesi için gerekli olan bir proteine, çerçeve içinde, birleştirilir. Sonuç ilgi kararsız proteinin protein yıkımı genetik gereksinimlerini belirlemek için güçlü bir araç olarak hizmet edebilir yapay substrat. Uygun bir şekilde, en sık kullanılan laboratuar maya cinsleri, özellikle amino asitler ya da azotlu bazların (örneğin, 20,28-30) biyosentezinde yer alan metabolik enzimleri kodlayan genlerdeki mutasyonların bir panel barındırır. Bu enzimler, sentez enzimleri katılmak dışsal olarak sağlanan metabolitlerin yokluğunda hücre proliferasyonu için gereklidir. Böylekararsız proteinlerin bozunması için büyüme bazlı muhabir bağlı oldukları bağlı oldukları gibi metabolik enzimler ve böylece işlev görebilir. proteolizini engellemek mutasyonlar bozunma raportör barındıran hücreleri seçilen şartlar altında büyümeye izin verir çünkü protein yıkımı için genetik olarak gerekli gördükleri kolaylıkla açıklanacaktır edilebilir. Bir büyüme avantajı, belirli bir mutasyon ve ilgilenilen protein bolluğu arttırır dolaylı bir göstergesidir. Ancak, doğrudan biyokimyasal analiz mutasyon oldukça dolaylı ya da suni nedenler yoluyla daha artmış protein düzeyleri ile büyümeyi izin onaylamak için gereklidir. Protein miktarı hakkında bir mutasyonun etkisi yapabilecek ve özellikle mutasyonu olmayan hücrelerde kararlı durum proteini düzeylerinin Western blot analizleri ile teyit edilebilir. Uygun bir biçimde maya proteinleri hızlı ve etkili bir ekstraksiyon (sodyum hidroksit ve numune tampon maddesi ile maya hücrelerinin sıralı inkübasyonu) için bir yöntem olupwestern blotting ile analiz için de 31 gösterilmektedir. Birlikte, bu deneyler, protein yıkımı aday düzenleyicilerinin hızlı belirlenmesini kolaylaştırmaktadır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator&#39;s laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (e.g. from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator&#39;s laboratory.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-amino-1H-1,2,4-triazole</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AC264571000</td>
			<td>Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endoglycosidase H (recombinant form from Streptomyces plicatus)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11088726001</td>
			<td>May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1X Laemmli sample buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable borosilicate glass tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-961-32</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-regulated incubator (e.g. Heratherm Incubator Model IMH180)</td>
			<td>Dot Scientific</td>
			<td>51028068</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>M1053-0450</td>
			<td>Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H</td>
			<td>New Brunswick</td>
			<td>M1053-4004</td>
			<td>For use with tube roller</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-2525</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1581.001</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &#956;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F14403</td>
			<td>Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetman Neo P8x20N, 2-20 &#956;l</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F14401</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plate imaging system (e.g. 
			Gel Doc XR+ System)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>170-8195</td>
			<td>A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5427 000.216&#160;</td>
			<td>Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 mL microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 mL Conical Tubes, 6-Place</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>F-35-6-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.205</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22364120</td>
			<td>Available from a variety of manufacturers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analog Dri-Bath Heater</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1172011AQ</td>
			<td>Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western blot imaging system (e.g. Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td>
			<td>Li-Cor</td>
			<td>9140-01</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>IPFL00010</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies (e.g. Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>459250</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies (e.g. Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A-21065</td>
			<td>Will vary by lab and application</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

growth-based determination and biochemical confirmation of genetic requirements for protein degradation in saccharomyces cerevisiae

Düzenlenmiş protein yıkımı hemen hemen her hücresel fonksiyon için çok önemlidir. Moleküler mekanizmaları ve ökaryotik protein yıkımı için genetik gereksinimleri hakkında bildiklerimizin çoğu başlangıçta Saccharomyces cerevisiae kurulmuştur. Protein yıkımı Klasik analizleri biyokimyasal darbe-kovalamaca ve sikloheksimid-kovalamaca metodolojileri yararlanmıştır. Bu teknikler, protein degradasyonunu gözlemlemek için duyarlı araçlar sağlarken, zahmetli, zaman alıcı ve düşük verimlilik bulunmaktadır. Bu yaklaşımlar, protein bozulmasını önlemek mutasyonlar için hızlı veya büyük ölçekli tarama için uygun değildir. Burada, protein parçalanması için genetik gereksinimleri kolay tanımlama için bir maya gelişimi tabanlı deney tarif edilecektir. Bu testte, özgül seçici koşullar altında büyüme için gerekli bir raportör enzim kararsız bir proteine ​​kaynaştırılır. Hücreler, endojen raportör enzim eksik olan fakat füzyon proteini sele altında büyüyebilir ifadeFüzyon proteini stabilize yalnızca ktif koşulları (örneğin, protein yıkımı uyuşmazlık olduğunda). Burada tarif edilen büyüme deneyinde, vahşi tipten ve bir füzyon proteinini kodlayan bir plazmid mutant maya hücreleri seri seyreltme seçici ve seçici olmayan ortam üzerine tespit edilir. Seçici koşullar altında büyüme, belirli bir mutasyon ile bozunma bozukluğu ile tutarlıdır. Artan protein bolluğu biyokimyasal teyit edilmelidir. Elektroforez ve Western blot için müsait bir biçimde maya proteinleri hızlı bir şekilde çıkarılması için bir yöntem olup, aynı zamanda gösterilmiştir. Biyokimyasal analizi için protein çıkarılması için basit bir protokol ile birlikte protein istikrarı için bir büyüme temelli okuma, protein parçalanması için genetik gereksinimleri hızlı belirlenmesini kolaylaştırır. Bu teknikler, kısa ömürlü bir çok protein degradasyonunu izlemek için adapte edilebilir. Verilen örnekte, histidin biyosentezi için gerekli olan His3 enzim kaynaştırıldıbu anormal endoplazmik retikulum translokon yürütmektedir sonra Deg1 için -Sec62. Deg1 -Sec62 bozulması için hedeflenmiştir. Deg1 -Sec62-HIS3 barındıran hücreler proteini kararlı hale geldiğinde, seçici koşullar altında büyüyebilir mümkün.

Bu yöntem göstermek için, His3 enzim modeli endoplazmik retikulum (ER) enzimi yüksek yoğunluklu lipoproteinlerde bozulması karboksi-terminaline kaynaştırılmış olduğu (ERAD) alt-tabaka, Deg1 -Sec62 (Şekil 2A) Deg1 -Sec62-HIS3 oluşturmak için (Şekil 3) . Deg1 -Sec62 translokon ile kalıcı, anormal bir ilişki aşağıdaki hedeflenen ERAD alt tabakalar yeni bir sınıfının kurucu elemanını temsil ER zar 32-34 arasında proteinlerin...

Watch this Scientific Journal Video about Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

growth-based-determination-biochemical-confirmation-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

9.7K Görüntüleme.  Ball State University. This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Video: Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae exists in either a haploid or diploid state. The ability to combine alleles from two haploids and the ability to introduce modifications to the genome requires the production and dissection of asci. Asci production from haploid cells begins with the mating of two yeast haploid strains with compatible mating types to produce a diploid strain. This can be accomplished in a number of ways either on solid medium or in liquid. It is advantageous to select for the diploids in medium that selectively promotes their growth compared to either of the haploid strains. The diploids are then allowed to sporulate on nutrient-poor medium to form asci, a bundle of four haploid daughter cells resulting from meiotic reproduction of the diploid. A mixture of vegetative cells and asci is then treated with the enzyme zymolyase to digest away the membrane sac surrounding the ascospores of the asci. Using micromanipulation with a microneedle under a dissection microscope one can pick up individual asci and separate and relocate the four ascopores. Dissected asci are grown for several days and tested for the markers or alleles of interest by replica plating onto appropriate selective media.

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Micromanipulation of yeast cells is needed for meiotic genetic analysis or to select diploid zygotes. These micromanipulations are carried out using the microneedle of a dissection microscope. The microneedle is used to relocate cells and is controlled by a micromanipulator which are available with various degrees of automation.

Diseksiyonu Saccharomyces cerevisiae Asci

Yeast is a highly tractable model system that is used to study many different cellular processes. The common laboratory strain Saccharomyces cerevisiae ...

Biyoloji

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground using a cryolysis procedure in a ball mill grinder and the resulting grindate brought into solution by urea solubilization. This procedure allows for the lysis of the cells in a metabolically inactive state, preserving phosphorylation and preventing reorientation of the phosphoproteome during cell lysis.  Following reduction, alkylation, trypsin digestion of the proteins, the samples are desalted on C18 columns and the sample complexity reduced by fractionation using hydrophilic interaction chromatography (HILIC). HILIC columns preferentially retain hydrophilic molecules which is well suited for phosphoproteomics.  Phosphorylated peptides tend to elute later in the chromatographic profile than the non phosphorylated counterparts. After fractionation, phosphopeptides are enriched using immobilized metal chromatography, which relies on charge-based affinities for phosphopeptide enrichment. At the end of this procedure the samples are ready to be quantitatively analyzed by mass spectrometry.

Quantitative Phosphoproteomics in Fatty Acid Stimulated Saccharomyces cerevisiae

Description of a quantitative phosphorylation procedure using cryolysis, urea solubilziation, HILIC fractionation and IMAC enrichment of phosphorylated peptides.

Yağ Asidi Kantitatif Phosphoproteomics Uyarılmış Saccharomyces cerevisiae</em

This protocol describes the growth and stimulation, with the fatty acid oleate, of isotopically heavy and light S. cerevisiae cells. Cells are ground ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Mikroarray Analizi için Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a quality control mechanism that can target and selectively degrade cellular material including organelles1-4. For example, damaged or redundant mitochondria (Fig. 1), not disposed of by autophagy, can represent a threat to cellular homeostasis and cell survival. In the yeast, Saccharomyces cerevisiae, nutrient deprivation (e.g., nitrogen starvation) or damage can promote selective turnover of mitochondria by autophagy in a process termed mitophagy 5-9.
We describe a simple fluorescence microscopy approach to assess autophagy. For clarity we restrict our description here to show how the approach can be used to monitor mitophagy in yeast cells. The assay makes use of a fluorescent reporter, Rosella, which is a dual-emission biosensor comprising a relatively pH-stable red fluorescent protein linked to a pH-sensitive green fluorescent protein. The operation of this reporter relies on differences in pH between the vacuole (pH ~ 5.0-5.5) and mitochondria (pH ~ 8.2) in living cells. Under growing conditions, wild type cells exhibit both red and green fluorescence distributed in a manner characteristic of the mitochondria. Fluorescence emission is not associated with the vacuole. When subjected to nitrogen starvation, a condition which induces mitophagy, in addition to red and green fluorescence labeling the mitochondria, cells exhibit the accumulation of red, but not green fluorescence, in the acidic vacuolar lumen representing the delivery of mitochondria to the vacuole. Scoring cells with red, but not green fluorescent vacuoles can be used as a measure of mitophagic activity in cells5,10-12.

A Fluorescence Microscopy Assay for Monitoring Mitophagy in the Yeast Saccharomyces cerevisiae

A robust approach to monitor the delivery of organelles to the acidic lumen of the yeast vacuole for degradation and recycling is described. The method relies on the specific labeling of target organelles with a genetically encoded dual-emission fluorescence pH-biosensor, and visualization of individual cells using fluorescence microscopy.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Autophagy is important for turnover of cellular components under a range of different conditions. It serves an essential homeostatic function as well as a ...

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in humans.There is therefore considerable interest in this protein, but efforts to study its structure and activity have been hampered by the difficulty of expressing and purifying sufficient amounts of the protein1-3. Like many 'difficult' eukaryotic membrane proteins, expression in a fast-growing organism is desirable, but challenging, and in the yeast S. cerevisiae, so far low amounts were obtained and rapid degradation of the recombinant protein was observed 4-9. Proteins involved in the processing of recombinant CFTR in yeast have been described6-9 .In this report we describe a methodology for expression of CFTR in yeast and its purification in significant amounts. The protocol describes how the earlier proteolysis problems can be overcome and how expression levels of CFTR can be greatly improved by modifying the cell growth conditions and by controlling the induction conditions, in particular the time period prior to cell harvesting. The reagants associated with this protocol (murine CFTR-expressing yeast cells or yeast plasmids) will be distributed via the US Cystic Fibrosis Foundation, which has sponsored the research. An article describing the design and synthesis of the CFTR construct employed in this report will be published separately (Urbatsch, I.; Thibodeau, P. et al., unpublished). In this article we will explain our method beginning with the transformation of the yeast cells with the CFTR construct - containing yeast plasmid (Fig. 1). The construct has a green fluorescent protein (GFP) sequence fused to CFTR at its C-terminus and follows the system developed by Drew et al. (2008)10. The GFP allows the expression and purification of CFTR to be followed relatively easily. The JoVE visualized protocol finishes after the preparation of microsomes from the yeast cells, although we include some suggestions for purification of the protein from the microsomes. Readers may wish to add their own modifications to the microsome purification procedure, dependent on the final experiments to be carried out with the protein and the local equipment available to them. The yeast-expressed CFTR protein can be partially purified using metal ion affinity chromatography, using an intrinsic polyhistidine purification tag. Subsequent size-exclusion chromatography yields a protein that appears to be &gt;90% pure, as judged by SDS-PAGE and Coomassie-staining of the gel.

Expression and Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein in Saccharomyces cerevisiae

Attempts to express the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in Saccharomyces cerevisiae have, until now, yielded relatively low amounts of protein. This protocol and the associated reagents distributed via the Cystic Fibrosis Foundation should allow the preparation of milligram amounts of this 'difficult' eukaryotic membrane protein.

Yılında Kistik Fibrozis Transmembran İletkenlik Regülatörü Protein İfadesi ve Arıtma Saccharomyces cerevisiae

The  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a chloride  channel, that when mutated, can give rise to cystic fibrosis in  ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Fat Kütle Biyokimyasal ve Yüksek Verimli Mikroskobik Değerlendirme<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Floresan kullanarak mRNA Moleküllerin Görselleştirme ve Analiz<em&gt; Yerinde</emIn&gt; Hibridizasyon<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that currently limits the average life expectancy of sufferers to &#60;40 years of age. The development of novel drug molecules to restore the activity of CFTR is an important goal in the treatment CF, and the isolation of functionally active CFTR is a useful step towards achieving this goal.
We describe two methods for the purification of CFTR from a eukaryotic heterologous expression system, S. cerevisiae. Like prokaryotic systems, S. cerevisiae can be rapidly grown in the lab at low cost, but can also traffic and posttranslationally modify large membrane proteins. The selection of detergents for solubilization and purification is a critical step in the purification of any membrane protein. Having screened for the solubility of CFTR in several detergents, we have chosen two contrasting detergents for use in the purification that allow the final CFTR preparation to be tailored to the subsequently planned experiments.
In this method, we provide comparison of the purification of CFTR in dodecyl-&#946;-D-maltoside (DDM) and 1-tetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol) (LPG-14). Protein purified in DDM by this method shows ATPase activity in functional assays. Protein purified in LPG-14 shows high purity and yield, can be employed to study post-translational modifications, and can be used for structural methods such as small-angle X-ray scattering and electron microscopy. However it displays significantly lower ATPase activity.

Purification of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein Expressed in Saccharomyces cerevisiae

Heterologous expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are significant challenges and limiting factors in the development of drug therapies for cystic fibrosis. This protocol describes two methods for the isolation of milligram quantities of CFTR suitable for functional and structural studies.&#160;

Olarak ifade edilmiştir kistik fibroz transmembran kondüktans regülatörü Protein Saflaştırılması<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Defects in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) protein cause cystic fibrosis (CF), an autosomal recessive disease that ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.