Name: growth-based determination and biochemical confirmation of genetic requirements for protein degradation in saccharomyces cerevisiae
Uploaded: 2015-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Biz bir destekleyici ve coşkulu bir araştırma ortamı sağlamak için Rubenstein laboratuar mevcut ve eski üyeleri teşekkür ederiz. Biz protokol optimizasyonu konusunda yardım almak için Ryan T. Gibson teşekkür ederim. Biz maya suşları ve plazmidler Mark Hochstrasser (Yale Üniversitesi) ve Dieter Kurt (Universität Stuttgart) teşekkür ederim. Biz bu yazının netlik ve programı geliştirmeye yardım ettikleri için anonim yorumcular teşekkür ederiz. Bu çalışma SGW&#39;den Sigma Xi Ball State Üniversitesi bölümünden bir araştırma ödülü tarafından desteklenen, Ball State Üniversitesi Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri (R15 GM111713) EMR için, EMR bir Ball State Üniversitesi aspire araştırma ödülü ve fonlar Provost Ofisi ve Biyoloji Bölümü.

Protein Bozulması Arızalı Aday Mutantlarına tanımak 1. Maya Büyüme Deneyi <ol><li> Bir raportör metabolik enzim, çerçeve içinde, erimiş kararsız bir proteini kodlayan bir plasmid ile vahşi tip ve mutant maya hücreleri dönüştürmek. </li><li> Plazmid moleküllerini taşıyan hücreler için seçici olan sentetik tanımlı (SD) minimal ortam 5 ml transformantların inoküle. Döner, 30 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. </li><li> Her bir gece boyunca kültür, 600 nm&#39;de (OD600) &#39;deki optik yoğunluk ölçülür. NOT: Bir gece inkübe edildikten sonra, kültür içindeki hücreler, ya logaritmik veya sabit gelişme fazında olabilir, fakat en az bir OD 0.2 600 ulaşmış olmalıdır. Ampirik bir şekilde tespit gibi çok yavaş büyüyen maya cinsleri, hücrelerin daha fazla sayıda inkübasyon süresi daha uzun bir gece veya aşılama gerektirebilir. </li><li> Bir seyreltilmiş hücreleri ile başlayan, bir steril 96 oyuklu bir plaka içerisinde dönüştürülen maya hücrelerinin altı kat seri dilüsyonları hazırlanmasın, OD 0.2 600. 96 gözlü plaka içindeki farklı üst üste denenecek her biri maya transformant yerleştirin. <ol><li> Her bir transformant için, 200 ul nihai hacim içinde 0.2 OD 600 hücreleri sulandırmak için gerekli olan bir gece boyunca kültür hacmi hesaplamak. 200 ul hacmi getirmek için steril su içinde uygun miktarda Sütun 1&#39;de de karşılık gelen, gece boyunca bu kültür hacim. </li><li> Maya her satır için, Sütun 2, 3 ve 4 kuyulara steril su, 125 ul ilave edin. Not: ayrı paketlenmiş steril 96-yuvalı plakalar, steril kapaklar ile paketlenebilir. Kapaklar bu adımda dağıtılır, steril su için rezervuar olarak kullanılabilmektedir. Bu çok kanallı bir pipet ile belirli bir sütunda tüm oyuklara steril su eşzamanlı transferi sağlar. </li><li> Yukarı pipetleme ve bir çok kanallı pipet aşağı ilk sütuna (OD 0.2 600 seyreltilmiş maya) içeriğini karıştırın. </li><li> TransfBir çok kanallı pipet kullanarak sütun 2 Sütun 1 maya 25 ul, er. Yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. Aktarım Sütun 3 Sütun 2 25 ul ve sütun 3 den Sütun 4 25 ul (her adımda iyi karıştırma). </li></ol></li><li> Bir çok kanallı pipet ile her bir örnek karıştırın. En seyreltilmiş hareketle en uygun seçici ortamı içeren iki plakalar üzerine maya, pipet, her numunenin 4 ul sütunları sulandırmak için. Plazmid seçimi (bu plaka maya lekelenme ve büyüme kontrolü olarak hizmet vermektedir) korur ortamı ile bir tabak kullanın. Raportör enzime bağlı kararsız protein plazmid muhafaza ve ekspresyonu için seçim ortamı ile bir ikinci plaka kullanın. Maya hızla yerleşmek için, düzenli aralıklarla yukarı pipetleme ve aşağı hücreleri karıştırın. Not: Kurutucu plakalar daha kolay bir şekilde taze hazırlanmış plakalar daha sıvı absorbe edecek ve bu nedenle, bu deneyler için tavsiye edilir. Nemli plakalar lo oda sıcaklığında kuluçkalama ile kurutulabilirbir laminar akış başlığı içinde 2 gün ya da daha kısa bir inkubasyon - 1 ağırlık nem. Laminar hava akımı tezgah paralel ise Tabaklar dengesiz kuruyabilir. Bir şablonun kullanımı kolay düzenli mesafelerde maya hücreleri görmenizi sağlar. İki örnek şablonlar, Şekil 1 &#39;de verilmiştir. Bu, baskılı üzerinden kesilir ve bir Petri kabı, kapağın iç tarafında olabilir. </li><li> Plakalar tezgah üstünde kurumaya bırakın. </li><li> 6 gün - 2, 30 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, her plaka fotoğraf. </li></ol><img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52428/52428fig1large.jpg" width="650" /> 100 mm agar plakaları üzerine maya hücreleri tespit için Şekil 1 şablonlar. Bu şablonlar, çok kanallı bir pipet ile düzenli aralıklarda maya tespit kolaylaştırmak için kullanılabilir. Şablonlar, baskılı kesip, ve bir Petri kabı kapağının içine yapıştırılmış olabilir. Büyüme ile Petri kabı yerleştirinşablon orta kapağının iç kısmına yapıştırılmıştır. Şablonlar yönünü izlemek için bir çentik ile işaretlenmiştir. Bu büyüme deneylerinde kullanılan plakalar Benzer yönünü izlemek için bir çentik ile işaretlenmiş olması tavsiye edilir. Dört (A) veya beş (B) maya hücrelerinin seri seyreltme sağlanır tespit için şablonlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52428/150126 Fig 1.pdf" target="_blank">100 mm şablonları ile bu rakamın bir yazdırılabilir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Maya Büyüme Testi 2. Biyokimyasal Onayı <ol><li> Maya Hücreleri ve Post-Alkali Protein Ekstraksiyon Büyüme (31 değiştirilmiş) <ol><li> Kararsız bir proteini kodlayan bir plasmid ile vahşi tip ve mutant maya hücreleri dönüştürmek. </li><li> Plazmid moleküllerini taşıyan hücreler için seçici olan SD ortamı 5 ml transformantların inoküle. Döner, 30 ° C&#39;de gece boyunca inkübe edin. </li><li> Her gecede cu OD 600 ölçünlture. NOT: Bir gece inkübe edildikten sonra hücreler, ya logaritmik veya sabit gelişme fazında olabilir, fakat 0.2 10 ml taze seçici ortam (aşama 2.1.4) OD 600 seyreltme izin verecek bir OD 600 ulaşmış olmalıdır. Ampirik bir şekilde tespit gibi çok yavaş büyüyen maya cinsleri, hücrelerin daha fazla sayıda inkübasyon süresi daha uzun bir gece veya aşılama gerektirebilir. </li><li> 0.2 10 ml taze seçici ortam içinde, bir OD 600 maya hücreleri seyreltin. </li><li> Kültürler (orta-logaritmik büyüme olan yani) 0.8 ve 1.2 arasında bir OD 600 ulaşıncaya kadar, döner veya çalkalama, 30 ° C&#39;de kuluçkalayın devam edin. Not: İlgili kararsız proteini, bir düzenlenebilir promoterin kontrolü altında ise, protein ifadesi ve hücre hasat indüksiyonu için en uygun zamanlama önceki çalışmalarda ya da deneysel gözlemlere göre değişebilir. </li><li> 15-ml&#39;lik konik kültür 2.5 OD 600 birimleri toplayınOda sıcaklığında 5 dakika boyunca 5000 x g&#39;de santrifüj ile ark tüpü. Pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı. Not: 600 birim 1.0 OD 600 kültürün 1 ml maya mevcut miktarı olarak tanımlanır bir OD. V = 2.5 OD 600 birim / Ölçülen OD 600: 2.5 OD 600 birim (V) hasat için gereklidir (ml) kültür hacmi, aşağıdaki denklem kullanılarak belirlenebilir </li><li> 1 ml tekrar süspansiyon hücreleri distile su. Bir mikrosantrifüj tüp askıya hücreleri aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında 30 saniye boyunca 6500 x g&#39;de santrifüj ile pelet hücreleri. Pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı. </li><li> 100 ul süspanse hücreleri aşağı veya yukarı vorteksleme pipetleme tarafından damıtılmış su ve 100 ul 0.2 M NaOH ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> 18.000 x santrifüj (henüz proteinleri serbest ve hala canlı olan değil çoğu) Pelet hücreleri5 dakika boyunca örn. Pipetle veya aspirasyon ile süpernatantı. </li><li> Yukarı ve aşağı pipetleme veya vorteks ile, hücreleri lize olacak 100 ul 1x Laemmli numune tamponu, - 50 süspanse pelet. Not: santrifüj ve Laemmli numune tampon maddesi içinde hücrelerin daha sonra yeniden süspansiyonu aşağıdaki alkali yüzer uzaklaştırılması bir Tris-glisin çalışan tamponu sistemi ve Batı lekeleme ile sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile uyumlu bir pH&#39;da proteinleri ayıklar. </li><li> Tam proteinleri denatüre etmek için 5 dakika boyunca 95 ° C &#39;de lizatları inkübe edin. Not: 95 ° C de inkübe toplama eğilimli proteinler (çok sayıda zar-ötesi bölümler ile, örneğin proteinler) çözünmez hale gelebilir. Bu nedenle, Lizatlar daha düşük sıcaklıklarda inkübe edilmelidir (örneğin, 37 ° C - 70 ° C), 10 - 30 dakika sonra gibi ampirik proteinlerin analizi için, tespit edilmiştir. </li><li> 5 dakika buz üzerine koyarak serin lizatları. </li><li> Oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 18,000 x g&#39;de santrifüjleyin lizatları çözünmeyen malzeme peletlendi. Önce, sonra Western blot analizi (kısım 2.2) SDS-PAGE ile süpernatant (çözünmüş ekstre protein), ayırın. Alternatif olarak, -20 ° C&#39;de mağaza lizatları. </li></ol></li><li> Örnek Western Blot Protokolü <ol><li> Bir SDS-PAGE jeli içinde lizatlarının ampirik bir biçimde tespit hacmi yükleyin. </li><li> Boya ön kadar 200 V jel çalıştırın jel alt ulaşmıştır. </li><li> 4 ° C&#39;de 90 dakika - 60 20 V ıslak transferi poliviniliden florür (PVDF) membrana jel proteinleri aktarın. </li><li> 4 ° C &#39;de bir gece boyunca, oda sıcaklığında 1 saat süre ile, sallanan ya Tris-tamponlu Tuzlu su (TBS) içinde% 5 yağsız süt içinde inkübe edilerek blok membran. </li><li> Çözüm engelleme Durusu. </li><li> Oda sıcaklığına 1 saat süre ile% 0.1 Tween-20 (TBS / T) ile TBS içinde% 1 yağsız süt içinde (ya da bunların epitop) başta ilgi konusu olan proteini için spesifik bir antikor ile membran inkübemperature, sallanan. </li><li> Antikor çözeltisi boşaltacaktır ve sallanan, oda sıcaklığında TBS / T ile membran 3 x 5 dk yıkayın. </li><li> Sallanan, oda sıcaklığında 1 saat süre ile TBS / T içinde% 1 yağsız süt uygun fluorofor-konjuge sekonder antikor ile membran inkübe edin. Not: flüoroforlar ışığa duyarlı olduğu için, florofor konjuge antikor seyreltileri karanlıkta hazırlanmalıdır. Buna ek olarak, florofor-konjuge antikor varlığında membran inkübasyon ışık geçirmeyen kaplarda gerçekleşmelidir. Bu alüminyum folyo ile inkübasyon tepsiler sarılarak yapılabilir. </li><li> Antikor çözeltisi boşaltacaktır ve sallanan, oda sıcaklığında TBS / T ile membran 3 x 5 dk yıkayın. </li><li> Üretici tavsiyelerine göre, Li-Cor Odyssey CLX kullanarak membran ve Görüntü Studio yazılımı (veya benzer görüntüleme cihazları ve yazılım) görüntü elde. </li><li> Membran görüntüleme sonra, bir yük için spesifik bir primer antikor ile membran inkübesallanan, oda sıcaklığında 1 saat süre ile TBS / T içinde% 1 yağsız süt kontrol proteini ing. </li><li> Antikor çözeltisi boşaltacaktır ve sallanan, oda sıcaklığında TBS / T ile membran 3 x 5 dk yıkayın. </li><li> Sallanan, oda sıcaklığında 1 saat süre ile TBS / T içinde% 1 yağsız süt uygun fluorofor-konjuge sekonder antikor ile membran inkübe edin. </li><li> Antikor çözeltisi boşaltacaktır ve sallanan, oda sıcaklığında TBS / T ile membran 3 x 5 dk yıkayın. </li><li> Üretici tavsiyelerine göre, Li-Cor Odyssey CLX kullanarak membran ve Görüntü Studio yazılımı (veya benzer görüntüleme cihazları ve yazılım) görüntü elde. </li></ol></li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Burada yer alan yöntem hızlı bir şekilde belirlenmesi ve maya hücrelerinde protein yıkımı genetik gereklerine biyokimyasal onay sağlar. Bu deneyler () (örn 41-44, taşıma, depolama ve maya hücreleri manipüle etmek için protokollerin maya biyoloji birkaç mükemmel değerlendirmeleri ve derlemeler organizmaya yeni müfettişler için mevcuttur) programı ve güç maya modeli ökaryotik organizma olarak vurgulayın. teknikler kolayca protein sınıflarının birçok degradasyonunu ve boll...

Seçici protein yıkımı ökaryotik yaşam için gerekli olduğunu ve değiştirilmiş protein yıkımı, çeşitli kanser tipleri, nörodejeneratif hastalıklar, kardiyovasküler hastalıklar ve sistik fibrozis 1-5 dahil olmak üzere tıbbi koşullar, bir dizi katkıda bulunur. seçici protein degradasyonunu katalize ubikitin-proteazom sistemi (UPS), bu koşullar 6-10 için gelişmekte olan bir tedavi edici hedeftir. Ubikitin ligaz kovalent proteinler 11 76-amino asit ubikitinin polimerleri takın. Poliübikütin zincirleri ile işaretlenmiş proteinler tanınan ve ~ 2.5 megadalton 26S ile 12 proteazom proteolizlenmiş edilir. Model ökaryotik organizma Saccharomyces cerevisiae (çiçek mayası) başlatılan çalışmalar ökaryotik hücrelerde protein yıkımı mekanizmaların açıklanması, temel olmuştur. UPS ilk gösterdi fizyolojik substrat MATα2 13 maya transkripsiyon represörü oldu, UPS 14 ve çok sayıda yüksek derecede korunmuş bileşenler ilk olarak tespit edilmiştir ya da (örneğin, 15-26), maya ile karakterize edilir. Bu çok yönlü ve genetik uysal model organizma yapılan Keşifler ubikuitin-aracılı bozulması korunmuş mekanizmaları önemli açılımlar sağlamaya devam etmesi muhtemeldir. Çoğu UPS yüzeylerde tanınması ve yıkımı birden proteinlerin uyumlu eylem gerektirir. Bu nedenle, belirli bir kararsız proteinin düzenlenmiş bozulmasını karakterize önemli bir gol proteoliz genetik gereksinimlerini belirlemektir. Memeli ya da maya hücrelerinde protein degradasyonunu izlenmesi için klasik yaklaşımları (örneğin, darbe kovalayıcı ve sikloheksimid kovalayıcı deneyler, 27), zahmetli ve zaman alıcı bir iştir. Yöntem bu tür protein degradasyonunu tespit etmek için çok hassas bir araç temin ederken, protein parçalanması ya da büyük ölçekli bir screeni hızlı analizi için uygun değildirProtein bozulmasını önlemek mutasyonlar için ng. Burada, kararsız proteinlerin bozunması için genetik gereklerine hızlı tespit edilmesi için bir maya gelişimi bazlı analiz sunulmuştur. Protein degradasyonunu, ilgi (ya da bozulma sinyali) kararsız bir protein analiz etmek için maya gelişimi dayalı yöntemde, belirli koşullar altında maya büyümesi için gerekli olan bir proteine, çerçeve içinde, birleştirilir. Sonuç ilgi kararsız proteinin protein yıkımı genetik gereksinimlerini belirlemek için güçlü bir araç olarak hizmet edebilir yapay substrat. Uygun bir şekilde, en sık kullanılan laboratuar maya cinsleri, özellikle amino asitler ya da azotlu bazların (örneğin, 20,28-30) biyosentezinde yer alan metabolik enzimleri kodlayan genlerdeki mutasyonların bir panel barındırır. Bu enzimler, sentez enzimleri katılmak dışsal olarak sağlanan metabolitlerin yokluğunda hücre proliferasyonu için gereklidir. Böylekararsız proteinlerin bozunması için büyüme bazlı muhabir bağlı oldukları bağlı oldukları gibi metabolik enzimler ve böylece işlev görebilir. proteolizini engellemek mutasyonlar bozunma raportör barındıran hücreleri seçilen şartlar altında büyümeye izin verir çünkü protein yıkımı için genetik olarak gerekli gördükleri kolaylıkla açıklanacaktır edilebilir. Bir büyüme avantajı, belirli bir mutasyon ve ilgilenilen protein bolluğu arttırır dolaylı bir göstergesidir. Ancak, doğrudan biyokimyasal analiz mutasyon oldukça dolaylı ya da suni nedenler yoluyla daha artmış protein düzeyleri ile büyümeyi izin onaylamak için gereklidir. Protein miktarı hakkında bir mutasyonun etkisi yapabilecek ve özellikle mutasyonu olmayan hücrelerde kararlı durum proteini düzeylerinin Western blot analizleri ile teyit edilebilir. Uygun bir biçimde maya proteinleri hızlı ve etkili bir ekstraksiyon (sodyum hidroksit ve numune tampon maddesi ile maya hücrelerinin sıralı inkübasyonu) için bir yöntem olupwestern blotting ile analiz için de 31 gösterilmektedir. Birlikte, bu deneyler, protein yıkımı aday düzenleyicilerinin hızlı belirlenmesini kolaylaştırmaktadır.

<table><tbody><tr><td>Desired yeast strains, plasmids, standard medium and buffer components</td><td></td><td></td><td>Yeast strains with desired mutations may be generated in the investigator&#039;s laboratory. Wild-type yeast and a variety of mutants are also commercially available (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; from GE Healthcare). Plasmids encoding fusion proteins may be generated in the investigator&#039;s laboratory.</td></tr><tr><td>3-amino-1&lt;em&gt;H&lt;/em&gt;-1,2,4-triazole</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC264571000</td><td>Competitive inhibitor of His3 enzyme. May be included in medium to increase stringency of growth assay using His3 reporter constructs.</td></tr><tr><td>Endoglycosidase H (recombinant form from &lt;em&gt;Streptomyces plicatus&lt;/em&gt;)</td><td>Roche</td><td>11088726001</td><td>May be used to assess N-glycosylation of proteins; compatible with SDS and beta-mercaptoethanol concentrations found in 1x Laemmli sample buffer.</td></tr><tr><td>Disposable borosilicate glass tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-32</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Temperature-regulated incubator (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Heratherm Incubator Model IMH180)</td><td>Dot Scientific</td><td>51028068</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>New Brunswick Interchangeable Drum for 18 mm tubes (tube roller)</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-0450</td><td>Tube roller is recommended to maintain overnight yeast starter cultures of yeast cells in suspension. A platform shaker or tube roller may be used to maintain larger cultures in suspension.</td></tr><tr><td>New Brunswick TC-7 Roller Drum 120V 50/60 H</td><td>New Brunswick</td><td>M1053-4004</td><td>For use with tube roller</td></tr><tr><td>SmartSpec Plus Spectrophotometer</td><td>Bio-Rad</td><td>170-2525</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Sterile 96-well flat bottom microtest plates with lid individually wrapped</td><td>Sarstedt</td><td>82.1581.001</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x20N, 2-20 &amp;mu;l</td><td>Gilson</td><td>F14401</td><td>Available from a variety of manufacturers&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Pipetman Neo P8x200N, 20-200 &amp;mu;l</td><td>Gilson</td><td>F14403</td><td>Single-channel and multichannel pipettors are used at various stages of the protocol. While multichannel pipettors reduce the pipetting burden at several steps, single-channel pipettors may be used throughout the entire protocol. Available from a variety of manufacturers.</td></tr><tr><td>Centrifuge 5430</td><td>Eppendorf</td><td>5427 000.216</td><td>Rotor that is sold with unit holds 1.5 and 2.0 ml microcentrifuge tubes. Rotor may be swapped for one that holds 15 ml and 50 ml conical tubes.</td></tr><tr><td>Plate imaging system (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Gel Doc XR+ System)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8195</td><td>A variety of systems may be used to image plates, including sophisticated imaging systems, computer scanners, and camera phones.</td></tr><tr><td>Fixed-Angle Rotor F-35-6-30 with Lid and Adapters for Centrifuge Model 5430/R, 15/50 ml Conical Tubes, 6-Place</td><td>Eppendorf</td><td>F-35-6-30</td><td></td></tr><tr><td>15 ml screen printed screw cap tube 17 x 20 mm conical, polypropylene</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>1.5 ml flex-tube, PCR clean, Natural microcentrifuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td>22364120</td><td>Available from a variety of manufacturers</td></tr><tr><td>Analog Dri-Bath Heater</td><td>Fisher Scientific</td><td>1172011AQ</td><td>Boiling water bath with hot plate may also be used to denature proteins</td></tr><tr><td>SDS-PAGE running and transfer apparatuses, power supplies, and imaging equipment or darkrooms for SDS-PAGE and transfer to membrane</td><td></td><td></td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Western blot imaging system (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Li-Cor Odyssey CLx scanner and Image Studio Software)</td><td>Li-Cor</td><td>9140-01</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer Membranes</td><td>Fisher Scientific</td><td>IPFL00010</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Primary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Phosphoglycerate Kinase (Pgk1) Monoclonal antibody, mouse (clone 22C5D8))</td><td>Life Technologies</td><td>459250</td><td>Will vary by lab and application</td></tr><tr><td>Secondary antibodies (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H+L))</td><td>Life Technologies</td><td>A-21065</td><td>Will vary by lab and application</td></tr></tbody></table>

growth-based determination and biochemical confirmation of genetic requirements for protein degradation in saccharomyces cerevisiae

Düzenlenmiş protein yıkımı hemen hemen her hücresel fonksiyon için çok önemlidir. Moleküler mekanizmaları ve ökaryotik protein yıkımı için genetik gereksinimleri hakkında bildiklerimizin çoğu başlangıçta Saccharomyces cerevisiae kurulmuştur. Protein yıkımı Klasik analizleri biyokimyasal darbe-kovalamaca ve sikloheksimid-kovalamaca metodolojileri yararlanmıştır. Bu teknikler, protein degradasyonunu gözlemlemek için duyarlı araçlar sağlarken, zahmetli, zaman alıcı ve düşük verimlilik bulunmaktadır. Bu yaklaşımlar, protein bozulmasını önlemek mutasyonlar için hızlı veya büyük ölçekli tarama için uygun değildir. Burada, protein parçalanması için genetik gereksinimleri kolay tanımlama için bir maya gelişimi tabanlı deney tarif edilecektir. Bu testte, özgül seçici koşullar altında büyüme için gerekli bir raportör enzim kararsız bir proteine ​​kaynaştırılır. Hücreler, endojen raportör enzim eksik olan fakat füzyon proteini sele altında büyüyebilir ifadeFüzyon proteini stabilize yalnızca ktif koşulları (örneğin, protein yıkımı uyuşmazlık olduğunda). Burada tarif edilen büyüme deneyinde, vahşi tipten ve bir füzyon proteinini kodlayan bir plazmid mutant maya hücreleri seri seyreltme seçici ve seçici olmayan ortam üzerine tespit edilir. Seçici koşullar altında büyüme, belirli bir mutasyon ile bozunma bozukluğu ile tutarlıdır. Artan protein bolluğu biyokimyasal teyit edilmelidir. Elektroforez ve Western blot için müsait bir biçimde maya proteinleri hızlı bir şekilde çıkarılması için bir yöntem olup, aynı zamanda gösterilmiştir. Biyokimyasal analizi için protein çıkarılması için basit bir protokol ile birlikte protein istikrarı için bir büyüme temelli okuma, protein parçalanması için genetik gereksinimleri hızlı belirlenmesini kolaylaştırır. Bu teknikler, kısa ömürlü bir çok protein degradasyonunu izlemek için adapte edilebilir. Verilen örnekte, histidin biyosentezi için gerekli olan His3 enzim kaynaştırıldıbu anormal endoplazmik retikulum translokon yürütmektedir sonra Deg1 için -Sec62. Deg1 -Sec62 bozulması için hedeflenmiştir. Deg1 -Sec62-HIS3 barındıran hücreler proteini kararlı hale geldiğinde, seçici koşullar altında büyüyebilir mümkün.

Bu yöntem göstermek için, His3 enzim modeli endoplazmik retikulum (ER) enzimi yüksek yoğunluklu lipoproteinlerde bozulması karboksi-terminaline kaynaştırılmış olduğu (ERAD) alt-tabaka, Deg1 -Sec62 (Şekil 2A) Deg1 -Sec62-HIS3 oluşturmak için (Şekil 3) . Deg1 -Sec62 translokon ile kalıcı, anormal bir ilişki aşağıdaki hedeflenen ERAD alt tabakalar yeni bir sınıfının kurucu elemanını temsil ER zar 32-34 arasında proteinlerin...

Watch this Scientific Journal Video about Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae at JoVE.com

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulated protein degradation is crucial for virtually every cellular function. Much of what is known about the molecular mechanisms and genetic ...

growth-based-determination-biochemical-confirmation-genetic

Research

JoVE Journal

Biology

Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

9.7K Görüntüleme.  Ball State University. This article describes a yeast growth-based assay for the determination of genetic requirements for protein degradation. It also demonstrates a method for rapid extraction of yeast proteins, suitable for western blotting to biochemically confirm degradation requirements. These techniques can be adapted to monitor degradation of a variety of proteins.

Video: Growth-based Determination and Biochemical Confirmation of Genetic Requirements for Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Identification of protein complexes with quantitative proteomics in S. cerevisiae

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as important intracellular signalling molecules. However, unlike proteins, lipids are small hydrophobic molecules that traffic primarily by poorly described nonvesicular routes, which are hypothesized to occur at membrane contact sites (MCSs). MCSs are regions where the endoplasmic reticulum (ER) makes direct physical contact with a partnering organelle, e.g., plasma membrane (PM). The ER portion of ER-PM MCSs is enriched in lipid-synthesizing enzymes, suggesting that lipid synthesis is directed to these sites and implying that MCSs are important for lipid traffic. Yeast is an ideal model to study ER-PM MCSs because of their abundance, with over 1000 contacts per cell, and their conserved nature in all eukaryotes. Uncovering the proteins that constitute MCSs is critical to understanding how lipids traffic is accomplished in cells, and how they act as signaling molecules. We have found that an ER called Scs2p localize to ER-PM MCSs and is important for their formation. We are focused on uncovering the molecular partners of Scs2p. Identification of protein complexes traditionally relies on first resolving purified protein samples by gel electrophoresis, followed by in-gel digestion of protein bands and analysis of peptides by mass spectrometry. This often limits the study to a small subset of proteins. Also, protein complexes are exposed to denaturing or non-physiological conditions during the procedure. To circumvent these problems, we have implemented a large-scale quantitative proteomics technique to extract unbiased and quantified data. We use stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) to incorporate staple isotope nuclei in proteins in an untagged control strain. Equal volumes of tagged culture and untagged, SILAC-labeled culture are mixed together and lysed by grinding in liquid nitrogen. We then carry out an affinity purification procedure to pull down protein complexes. Finally, we precipitate the protein sample, which is ready for analysis by high-performance liquid chromatography/ tandem mass spectrometry. Most importantly, proteins in the control strain are labeled by the heavy isotope and will produce a mass/ charge shift that can be quantified against the unlabeled proteins in the bait strain. Therefore, contaminants, or unspecific binding can be easily eliminated. By using this approach, we have identified several novel proteins that localize to ER-PM MCSs. Here we present a detailed description of our approach. 

Here we describe a new quantitative proteomics technique for identifying protein complexes in Saccharomyces cerevisiae. In this study, we have used the SILAC method together with affinity purification followed by tandem mass spectrometry to identify with high specificity the binding partners of an ER protein, Scs2p.

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Lipids are the building blocks of cellular membranes that function as barriers and in compartmentalization of cellular processes, and recently, as ...

Biyoloji

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins remains elusive. Here, we describe a robust and effective method for determining the suborganellar localization of yeast mitochondrial proteins, which is considered a fundamental step during mitochondrial protein function elucidation. This method involves an initial step that consists of obtaining highly pure intact mitochondria. These mitochondrial preparations are then subjected to a subfractionation protocol consisting of hypotonic shock (swelling) and incubation with proteinase K (protease). During swelling, the outer mitochondrial membrane is selectively disrupted, allowing the proteinase K to digest proteins of the intermembrane space compartment. In parallel, to obtain information about the topology of membrane proteins, the mitochondrial preparations are initially sonicated, and then subjected to alkaline extraction with sodium carbonate. Finally, after centrifugation, the pellet and supernatant fractions from these different treatments are analyzed by SDS-PAGE and western blot. The submitochondrial localization as well as the membrane topology of the protein of interest is obtained by comparing its western blot profile with known standards.

Assessment of Submitochondrial Protein Localization in Budding Yeast Saccharomyces cerevisiae

Despite recent advances, many yeast mitochondrial proteins still remain with their functions completely unknown. This protocol provides a simple and reliable method to determine the submitochondrial localization of proteins, which has been fundamental for the elucidation of their molecular functions.

Tomurcuklanan Maya Sakkaromices cerevisiae'de Submitochondrial Protein Lokalizasyonunun Değerlendirilmesi

Despite recent advances in the characterization of yeast mitochondrial proteome, the submitochondrial localization of a significant number of proteins ...

Biyokimya

Tuning Degradation to Achieve Specific and Efficient Protein Depletion

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting them for degradation. This system is exploited in many non-plant eukaryotes, such that a target protein, tagged with the AID motif, is degraded upon auxin addition. The level of TIR1 expression is critical; excessive expression leads to degradation of the AID-tagged protein even in the absence of auxin, whereas low expression leads to slow depletion. A &#946;-estradiol-inducible AID system was created, with expression of TIR1 under the control of a &#946;-estradiol inducible promoter. The level of TIR1 is tunable by changing the time of incubation with &#946;-estradiol before auxin addition. This protocol describes how to rapidly deplete a target protein using the AID system. The appropriate &#946;-estradiol incubation time depends on the abundance of the target protein. Therefore, efficient depletion depends on optimal timing that also minimizes auxin-independent depletion.

Here, we present a protocol to effectively and specifically deplete a protein of interest in the yeast Saccharomyces cerevisiae using the &#946;-est AID system.

Belirli ve verimli protein tükenmesi elde etmek için bozulma ayarlama

The plant auxin binding receptor, TIR1, recognizes proteins containing a specific auxin-inducible degron (AID) motif in the presence of auxin, targeting ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Reporter-based Growth Assay for Systematic Analysis of Protein Degradation

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard approach to determining intracellular protein degradation relies on biochemical assays for following the kinetics of protein decline. Such methods are often laborious and time consuming and therefore not amenable to experiments aimed at assessing multiple substrates and degradation conditions. As an alternative, cell growth-based assays have been developed, that are, in their conventional format, end-point assays that cannot quantitatively determine relative changes in protein levels.
Here we describe a method that faithfully determines changes in protein degradation rates by coupling them to yeast cell-growth kinetics. The method is based on an established selection system where uracil auxotrophy of URA3-deleted yeast cells is rescued by an exogenously expressed reporter protein, comprised of a fusion between the essential URA3 gene and a degradation determinant (degron). The reporter protein is designed so that its synthesis rate is constant whilst its degradation rate is determined by the degron. As cell growth in uracil-deficient medium is proportional to the relative levels of Ura3, growth kinetics are entirely dependent on the reporter protein degradation.
This method accurately measures changes in intracellular protein degradation kinetics. It was applied to: (a) Assessing the relative contribution of known ubiquitin-conjugating factors to proteolysis (b) E2 conjugating enzyme structure-function analyses (c) Identification and characterization of novel degrons. Application of the degron-URA3-based system transcends the protein degradation field, as it can also be adapted to monitoring changes of protein levels associated with functions of other cellular pathways.

Here we describe a robust biological assay for quantifying the relative rate of proteolysis by the ubiquitin-proteasome system. The assay readout is yeast growth rate in liquid culture, which is dependent on the cellular levels of a reporter protein comprising a degradation signal fused to an essential metabolic marker.

Protein Parçalanabilirliklerinin Sistematik Analizi muhabiri tabanlı Büyüme Deneyi

Protein degradation by the ubiquitin-proteasome system (UPS) is a major regulatory mechanism for protein homeostasis in all eukaryotes. The standard ...

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. Saccharomyces cerevisiae, or budding yeast, is a model eukaryote for which a complete collection of ~6,000 gene deletion mutants and hypomorphic essential gene mutants are commercially available. These collections of mutants can be used to systematically detect chemical-gene interactions, i.e. genes necessary to tolerate a chemical. This information, in turn, reports on the likely mode of action of the compound. Here we describe a protocol for the rapid identification of chemical-genetic interactions in budding yeast. We demonstrate the method using the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil (5-FU), which has a well-defined mechanism of action. Our results show that the nuclear TRAMP RNA exosome and DNA repair enzymes are needed for proliferation in the presence of 5-FU, which is consistent with previous microarray based bar-coding chemical genetic approaches and the knowledge that 5-FU adversely affects both RNA and DNA metabolism. The required validation protocols of these high-throughput screens are also described.

Rapid Identification of Chemical Genetic Interactions in Saccharomyces cerevisiae

Here we present a cost-effective method for defining chemical-genetic interactions in budding yeast. The approach is built on fundamental techniques in yeast molecular biology and is well suited for the mechanistic interrogation of small to medium collections of chemicals and other media environments.

Kimyasal Genetik Etkileşimleri Hızlı Kimlik<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Determining the mode of action of bioactive chemicals is of interest to a broad range of academic, pharmaceutical, and industrial scientists. ...

Protein Purification Technique that Allows Detection of Sumoylation and Ubiquitination of Budding Yeast Kinetochore Proteins Ndc10 and Ndc80

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular function of many proteins. PTMs of kinetochore proteins that associate with centromeric DNA mediate faithful chromosome segregation to maintain genome stability. Biochemical approaches such as mass spectrometry and western blot analysis are most commonly used for identification of PTMs. Here, a protein purification method is described that allows the detection of both sumoylation and ubiquitination of the kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in Saccharomyces cerevisiae. A strain that expresses polyhistidine-Flag-tagged Smt3 (HF-Smt3) and Myc-tagged Ndc10 or Ndc80 was constructed and used for our studies. For detection of sumoylation, we devised a protocol to affinity purify His-tagged sumoylated proteins by using nickel beads and used western blot analysis with anti-Myc antibody to detect sumoylated Ndc10 and Ndc80. For detection of ubiquitination, we devised a protocol for immunoprecipitation of Myc-tagged proteins and used western blot analysis with anti-Ub antibody to show that Ndc10 and Ndc80 are ubiquitinated. Our results show that epitope tagged-protein of interest in the His-Flag tagged Smt3 strain facilitates the detection of multiple PTMs. Future studies should allow exploitation of this technique to identify and characterize protein interactions that are dependent on a specific PTM.

This manuscript describes the detection of sumoylation and ubiquitination of kinetochore proteins, Ndc10 and Ndc80, in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Sumoylation ve geliştirici Maya Kinetokor Proteinler Ndc10 ve Ndc80 ve ubikuitinasyomınun Tespiti verir Protein Saflaştırma Tekniği

Post-translational Modifications (PTMs), such as phosphorylation, methylation, acetylation, ubiquitination, and sumoylation, regulate the cellular ...

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that involves the construction, cloning and expression of mutant libraries, coupled to high frequency homologous DNA recombination in vivo. Here, we present a protocol to create and screen mutant libraries in yeast based on the example of a fungal aryl-alcohol oxidase (AAO) to enhance its total activity. Two protein segments were subjected to focused-directed evolution by random mutagenesis and in vivo DNA recombination. Overhangs of ~50 bp flanking each segment allowed the correct reassembly of the AAO-fusion gene in a linearized vector giving rise to a full autonomously replicating plasmid. Mutant libraries enriched with functional AAO variants were screened in S. cerevisiae supernatants with a sensitive high-throughput assay based on the Fenton reaction. The general process of library construction in S. cerevisiae described here can be readily applied to evolve many other eukaryotic genes, avoiding extra PCR reactions, in vitro DNA recombination and ligation steps.

Directed Evolution Method in Saccharomyces cerevisiae: Mutant Library Creation and Screening

We present a detailed protocol to construct and screen mutant libraries for directed evolution campaigns in Saccharomyces cerevisiae.

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Directed evolution in Saccharomyces cerevisiae offers many attractive advantages when designing enzymes for biotechnological applications, a process that ...

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein synthesis and protein degradation. Many assays reporting on protein abundance (e.g., single-time point western blotting, flow cytometry, fluorescence microscopy, or growth-based reporter assays) do not allow discrimination of the relative effects of translation and proteolysis on protein levels. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to specifically analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast). In this procedure, yeast cells are incubated in the presence of the translational inhibitor cycloheximide. Aliquots of cells are collected immediately after and at specific time points following addition of cycloheximide. Cells are lysed, and the lysates are separated by polyacrylamide gel electrophoresis for western blot analysis of protein abundance at each time point. The cycloheximide chase procedure permits visualization of the degradation kinetics of the steady state population of a variety of cellular proteins. The procedure may be used to investigate the genetic requirements for and environmental influences on protein degradation.

Cycloheximide Chase Analysis of Protein Degradation in Saccharomyces cerevisiae

Protein abundance reflects the rates of both protein synthesis and protein degradation. This article describes the use of cycloheximide chase followed by western blotting to analyze protein degradation in the model unicellular eukaryote, Saccharomyces cerevisiae (budding yeast).

Protein Bozulması ve Siklohekzimid Chase Analizi<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Regulation of protein abundance is crucial to virtually every cellular process. Protein abundance reflects the integration of the rates of protein ...

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

The encoding of biological information that is accessible to future generations is generally achieved via changes to the DNA sequence. Long-lived inheritance encoded in protein conformation (rather than sequence) has long been viewed as paradigm-shifting but rare. The best characterized examples of such epigenetic elements are prions, which possess a self-assembling behavior that can drive the heritable manifestation of new phenotypes. Many archetypal prions display a striking N/Q-rich sequence bias and assemble into an amyloid fold. These unusual features have informed most screening efforts to identify new prion proteins. However, at least three known prions (including the founding prion, PrPSc) do not harbor these biochemical characteristics. We therefore developed an alternative method to probe the scope of protein-based inheritance based on a property of mass action: the transient overexpression of prion proteins increases the frequency at which they acquire a self-templating conformation. This paper describes a method for analyzing the capacity of the yeast ORFeome to elicit protein-based inheritance. Using this strategy, we previously found that &gt;1% of yeast proteins could fuel the emergence of biological traits that were long-lived, stable, and arose more frequently than genetic mutation. This approach can be employed in high throughput across entire ORFeomes or as a targeted screening paradigm for specific genetic networks or environmental stimuli. Just as forward genetic screens define numerous developmental and signaling pathways, these techniques provide a methodology to investigate the influence of protein-based inheritance in biological processes.

High-throughput Screening for Protein-based Inheritance in S. cerevisiae

This protocol describes a high-throughput methodology to functionally screen for protein-based inheritance in S. cerevisiae.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

S. cerevisiae, kantitatif proteomik protein kompleksleri tanımlanması

Tomurcuklanan Maya Sakkaromices cerevisiae'de Submitochondrial Protein Lokalizasyonunun Değerlendirilmesi

Belirli ve verimli protein tükenmesi elde etmek için bozulma ayarlama

İzlenmesi protein refolding için birleştiğinde Tahliller

Protein Parçalanabilirliklerinin Sistematik Analizi muhabiri tabanlı Büyüme Deneyi

Kimyasal Genetik Etkileşimleri Hızlı Kimlik

Sumoylation ve geliştirici Maya Kinetokor Proteinler Ndc10 ve Ndc80 ve ubikuitinasyomınun Tespiti verir Protein Saflaştırma Tekniği

Evrim Yöntemi yönettiği

Protein Bozulması ve Siklohekzimid Chase Analizi

S. cerevisiae Protein bazlı miras için yüksek üretilen iş tarama