We gratefully acknowledge Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands) for the kind gift of TOPflash cells.
This project was supported in part by NIH-R01DK083325 (MAH); NIH P30 DK078392 (Digestive Health Center); NIH UL1RR026314 (CTSA).

<ol>
	<li>Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+development+and+differentiation.">Intestinal development and differentiation.</a> Exp Cell Res. 317 (19), 2702-2710 (2011).</li><li>Shroyer, N. F., Kocoshis, S., Hyams, J. R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pediatric Gastrointestinal and Liver Diseases. , 324-336 (2010).</li><li>Leushacke, M., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+the+intestinal+epithelium:+strategies+and+applications.">Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications.</a> Gut. , (2014).</li><li>Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+intestinal+epithelial+cell+differentiation.">In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation.</a> Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Mahe, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Gastrointestinal+Epithelial+Organoids.">Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 3, 217-240 (2013).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li><li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.">A nomenclature for intestinal in vitro cultures.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (12), G1359-G1363 (2012).</li><li>Ramalingam, S., Daughtridge, G. W., Johnston, M. J., Gracz, A. D., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+levels+of+Sox9+expression+mark+colon+epithelial+stem+cells+that+form+colonoids+in+culture.">Distinct levels of Sox9 expression mark colon epithelial stem cells that form colonoids in culture.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (1), G10-G20 (2012).</li><li>Furstenberg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+mouse+jejunal+epithelial+cells+with+CD24+yields+a+population+with+characteristics+of+intestinal+stem+cells.">Sorting mouse jejunal epithelial cells with CD24 yields a population with characteristics of intestinal stem cells.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (3), G409-G417 (2011).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Intestinal+Stem+Cells+Based+on+Surface+Marker+Combinations+and+Colony-Formation+Assay.">Isolation and Characterization of Intestinal Stem Cells Based on Surface Marker Combinations and Colony-Formation Assay.</a> Gastroenterology. , (2013).</li><li>Yan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+stem+cell+markers+Bmi1+and+Lgr5+identify+two+functionally+distinct+populations.">The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (2), 466-471 (2012).</li><li>Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dll1++secretory+progenitor+cells+revert+to+stem+cells+upon+crypt+damage.">Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.</a> Nat Cell Biol. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li><li>Yui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+engraftment+of+colon+epithelium+expanded+in+vitro+from+a+single+adult+Lgr5(+)+stem+cell.">Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell.</a> Nat Med. 18 (4), 618-623 (2012).</li><li>Durand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+intestinal+stem+cells+after+Paneth+cell+ablation+induced+by+the+loss+of+transcription+factor+Math1+(Atoh1).">Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (23), 8965-8970 (2012).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts.">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).</li><li>Akcora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CSF-1+receptor+fashions+the+intestinal+stem+cell+niche.">The CSF-1 receptor fashions the intestinal stem cell niche.</a> Stem Cell Res. 10 (2), 203-212 (2013).</li><li>Farin, H. F., Van Es, J. H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+sources+of+Wnt+regulate+intestinal+stem+cells+and+promote+formation+of+Paneth+cells.">Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).</li><li>Rothenberg, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cKit(+)+colonic+crypt+base+secretory+cell+that+supports+Lgr5(+)+stem+cells+in+mice.">Identification of a cKit(+) colonic crypt base secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice.</a> Gastroenterology. 142 (5), 1195-1205 (2012).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer's+patch+M+cells+derived+from+Lgr5(+)+stem+cells+require+SpiB+and+are+induced+by+RankL+in+cultured+'miniguts.">Peyer's patch M cells derived from Lgr5(+) stem cells require SpiB and are induced by RankL in cultured 'miniguts.</a> Mol Cell Biol. 32 (18), 3639-3647 (2012).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Jung, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+expansion+of+human+colonic+stem+cells.">Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells.</a> Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays.">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. , (2014).</li><li>Fuller, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+stem+cells+remain+viable+after+prolonged+tissue+storage.">Intestinal stem cells remain viable after prolonged tissue storage.</a> Cell Tissue Res. 354 (2), 441-450 (2013).</li><li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche.">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).</li><li>Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt5a+potentiates+TGF-beta+signaling+to+promote+colonic+crypt+regeneration+after+tissue+injury.">Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury.</a> Science. 338 (6103), 108-113 (2012).</li><li>Koo, B. K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+Marked+by+the+R-Spondin+Receptor+Lgr5.">Stem Cells Marked by the R-Spondin Receptor Lgr5.</a> Gastroenterology. , (2014).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors.">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 16-19 (2009).</li><li>Tojo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ALK-5+inhibitor+A-83-01+inhibits+Smad+signaling+and+epithelial-to-mesenchymal+transition+by+transforming+growth+factor-beta.">The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta.</a> Cancer Sci. 96 (11), 791-800 (2005).</li><li>Gafni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+novel+human+ground+state+naive+pluripotent+stem+cells.">Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells.</a> Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+CD24+and+CD44+mark+human+intestinal+epithelial+cell+populations+with+characteristics+of+active+and+facultative+stem+cells.">Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells.</a> Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Exp Biol Med (Maywood). , (2014).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Kovbasnjuk, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids:+preclinical+models+of+non-inflammatory+diarrhea.">Human enteroids: preclinical models of non-inflammatory diarrhea.</a> Stem Cell Res Ther. 4, S3 (2013).</li><li>Fujii, M., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+intestinal+stem+cells:+applications+for+colorectal+cancer+research.">Culturing intestinal stem cells: applications for colorectal cancer research.</a> Front Genet. 5, 169 (2014).</li><li>Koo, B. K., Sasselli, V., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+gene+expression+control+in+primary+organoid+cultures.">Retroviral gene expression control in primary organoid cultures.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 27 (Unit 5A), 6 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

يوفر هذا الأسلوب نظام كامل استنساخ الأنساب الظهارية في الأمعاء وديناميكية الظهارية التي تشكل أداة مفيدة لدراسة البيولوجيا الظهارية في الأمعاء. تم تعديل طريقة المقدمة في هذه الوثيقة من دراسة الفئران الأصلية التي كتبها ساتو وكليفرز 22 الذي ينتج بكفاءة في enteroids البشرية وcolonoids. هنا، اخترنا يدويا الخبايا التي كتبها تسليخ مجهري لتجنب أي ملوثات الخلوية. يسمح هذا الأسلوب التصور المباشر من الخبايا ويؤدي إلى العمل الإضافي الاتساق مقارنة جمع سرداب الأصلي &quot;الهز&quot;. وضعت مجموعات أخرى مماثلة التقنيات باستخدام أساليب مختلفة قليلا خصوصا استبدال عملية إزالة معدن ثقيل من EDTA مع كولاجيناز 25. وبالإضافة إلى الاختلافات في جمع سرداب، تلك التقنيات استخدام وسائل الإعلام تعريف ما هو مطلوب لزراعة enteroids الإنسان في الثقافة 22. لزيادة كفاءة النمو في سرداب البذر، ونضيف إلى مثبط GSK3 (CHIR99021)لأول يومين 12. التعامل مع الأنسجة أو الخزعات مهم ويجب أن يتم تنفيذ العزل سرداب بمجرد وصول الأنسجة في المختبر. ومع ذلك، يمكن أن يؤديها تأخر العزلة سرداب والثقافة ما يصل إلى 24 ساعة بعد جمع الأنسجة (لا تظهر البيانات) كما هو موضح سابقا للأنسجة الفئران 26. يجب وضع الأنسجة المعوية في أنبوب مخروطي شغل تماما مع DPBS لتجنب انقطاع الأنسجة وينبغي الحفاظ على 4 درجات مئوية. إعداد تأخر يسمح للشحن الأنسجة ولكن ينبغي تجنب اختلاف درجة الحرارة أثناء النقل. الوقت الكلي اللازم لتصفيح سرداب الأولي حوالي 2 ساعة مع 15 إلى 30 دقيقة لمعالجة الأنسجة و1 إلى 2 ساعة لعزل وصفيحة سرداب. وتسليخ مجهري من النسيج هو المحدد الحاسم والمسند من إعداد سرداب نظيفة. ومع ذلك، وإطلاق سراح سرداب باليد يهز كما هو موضح في مختلف البروتوكولات ممكن 22،23. وعلى الرغم من التشابه مع نظام enteroid الفئران (enteroids)، وenteroids البشرية تتطلب جزيئات محددة لتعزيز ودعم نموها مع مرور الوقت. عوامل النمو، وتستخدم EGF، رأس، R-spondin على غرار organoids الظهارية الفئران. ومع ذلك، فإن استخدام WNT-3A أمر بالغ الأهمية. لاحظنا أن تشكيل فضلا عن كفاءة نمو أكبر باستخدام وسيلة مكيفة WNT-3A من البروتين المؤتلف البشري. وفي الوقت نفسه، أثبتنا تحسين ظروف التربية باستخدام المانع من كيناز الجليكوجين سينسيز 3 (CHIR99021) 12. يمكن الاستعاضة عوامل النمو المؤتلف من قبل WNT-3A، R-spondin، ورأس مكيفة وسائل الاعلام. خط L-خلية معربا عن WNT-3A-متاح تجاريا (آي تي ​​سي سي). وقد وضعت مجموعات أخرى R-spondin 1- 23،27، Noggin- 19، وWNT-3A / R-spondin3 / 28 Noggin- يعبرون عن خطوط الخلايا. وتستخدم اثنين من مثبطات جزيء صغير في الثقافة ليهي ديا وضروري للحفاظ على ثقافة 29. A-83-01 هو المانع الانتقائي للتحويل β عامل نمو وActivin / مستقبلات العقدية (activin مثل كيناز 4، 5، 7) وSB202190 هو تنشيط mitogen-P38 بروتين كيناز المانع (MAPK). وقد استخدمت كل من مثبطات على التوالي للحفاظ البشرية الناجمة عن الخلايا الجذعية المحفزة التجديد الذاتي وإنشاء الخلايا المحفزة ساذجة الإنسان الجذعية 30-32. أيضا، نيكوتيناميد، تمهيدا لثنائي النوكليوتيد الأدينين نيكوتيناميد، مطلوب للحفاظ على enteroids والتوسع colonoids بطريقة طويلة الأجل 22،29. وعملية إزالة معدن ثقيل EDTA خطوة هامة كما أنه يحدد العائد من إعداد سرداب. وقد نجحنا مع 2 العلاج ملي EDTA. ومع ذلك، والتركيز EDTA يمكن تعديلها من 2 مم إلى 15 مم فيما يتعلق بنوع من الأنسجة. في هذه الحالة، والوقت من الحضانة يجب أن تحدد تجريبيا. بعد الطلاء الأولي، فإن سرداب ذهابا وشp و في نهاية المطاف تشكل enteroids. ومع ذلك، فإن enteroids أو colonoids غالبا ما يبرهن على وجود &quot;وقف&quot; النمط الظاهري من خلال تشكيل المجالات مع قليل من أي خلايا متباينة. في هذه الحالة، يمكن البدء التمايز من خلال سحب WNT-3A، نيكوتيناميد والمانع P38 MAPK. استخدام الشق المانع مثل DAPT أو DBZ يساعد على تعزيز التمايز داخل enteroids 22. هذا النموذج يلخص علم وظائف الأعضاء في الأمعاء مع الأحداث في مهدها سرداب المستمرة الناشئة عن حجرة الخلايا الجذعية وكذلك المجالات الظهارية مثل زغابة التي تحتوي على حد سواء الاستيعابية وإفرازية متباينة الأنساب. ومن المثير للاهتمام، وهذا النظام لا يحتوي على أية خلايا اللحمة المتوسطة ويستخدم وسائل الاعلام الظروف المحددة لتلبية متطلبات إشارة المتخصصة. مثل نموذج الفئران، يمكن أن تتولد enteroids الإنسان من الخلايا الظهارية المعوية المعزولة لاختبار قدرة هذه الخلايا لتكون بمثابة الخلايا الجذعية. سفوقد استخدمت الدراسات راؤول مجموعة من علامات التمايز (CD44، CD24 أو CD166) والخلايا إيجابية EPHB2 لإثراء للخلايا الجذعية مع خصائص 12،23،33. معا، وهذه الدراسات تظهر فائدة enteroids البشرية الثقافات لاختبار stemness. باحثون آخرون يستخدمون هذا النموذج للتحقيق في الأمراض المعوية مثل الإسهال والأمراض المعدية، والتليف الكيسي، أو سرطان القولون والمستقيم 22،34-37. وتبين هذه الدراسات أن enteroids البشرية تشكل نموذجا الأمراض التي تصيب البشر يمكن الاعتماد عليها مع وجود إمكانية للتحرك نحو فحص شخصية. enteroids الإنسان يمكن تعديلها وراثيا باستخدام ترنسفكأيشن DNA أو العدوى مع الجسيمات الفيروسية 38. وهذا يوفر أداة قوية لدراسة وظائف الجينات المحددة ضمن organoids الظهاري البشري أو الطفرات الوراثية الصحيحة. مؤخرا، أظهرت شوانك وزملاؤه إمكانية لتحرير الجينوم مع كريسبر / نظام Cas9 وتصحيح طفرة على ميلان تسبب CFTR الجينالتليف ystic 24. enteroids الإنسان تشكل نظاما قيما لدراسة المعوية الجذعية خلايا الظهارية المخاطية والبيولوجيا، ويكون بمثابة نظام تجريبي جديد لدراسة علم وظائف الأعضاء الهضمي على حد سواء طبيعية وغير طبيعية.

ظهارة بطانة القناة الهضمية هي في التجديد المستمر. يتم تشغيل هذه العملية من خلال انتشار الخلايا الجذعية المعوية (ISCS) التي تنتج ذرية باستمرار ليحل محل بسرعة ظهارة الأمعاء كما أنه يقلب. يقتصر مقصورة التكاثري تضم ISCS إلى الجزء السفلي من الخبايا. وISCS تثير ذرية والتي تفرق في نهاية المطاف إلى الاستيعابية أو الأنساب إفرازية. الخروج من سرداب وعلى زغابة أو سطح البشرة، والخلايا تفرق تدريجيا كما تهاجر صعودا قبل تقشير في التجويف 1. ISCS تؤدي إلى كل أنواع الخلايا الظهارية المعوية بما في ذلك المعوية وخلايا microfold، وخلايا enteroendocrine، والخلايا الكأسية، وخلايا خصل والخلايا بانيت. ويتميز القولون عن طريق أقبية ممدود تتألف في معظمها من colonocytes والخلايا الكأسية، مع enteroendocrine متناثرة والخلايا خصل 2. فيفو السابقين طريق مسدودتشكل أنظمة البنية أداة واعدة لدراسة صيانة ISC وتوازن الأنسجة المعوية. ومع ذلك، فمن الصعب الاعتماد على تقنيات زراعة الأنسجة لا ترد الظروف الفسيولوجية بالكامل والمكروية الظهارية في كثير من الأحيان تغيير 3،4. وكان تقدما كبيرا في مجال ISC إنشاء تقنيات زراعة الأنسجة للحفاظ على وتوسيع ISCS الفئران الفردية باستخدام عوامل النمو المحددة لاستبدال الإشارات المتخصصة المعوية العادية. وقد وصفت الظروف الثقافة على المدى الطويل عن طريق ساتو وآخرون، التي أقبية واحدة أو الخلايا الجذعية المعزولة من ظهارة الأمعاء تنمو لتشكيل هياكل الظهارية 3-الأبعاد بما في ذلك تشبه سرداب متعددة المجالات 5-7. هذه الهياكل ثلاثي الأبعاد تخضع الأحداث الانشطار لتوسيع باستمرار. ومن المثير للاهتمام، وجميع أنواع الخلايا المعوية محددة لالأنسجة المنشأ ويتم إنتاج وكذلك تنبثق في التجويف 8. عن طريق إدخال تعديلات على هذا النظام، الظهاريةيمكن أن تتولد organoids من المعدة والأمعاء الدقيقة والقولون. وبشكل أكثر تحديدا، organoids الظهاري من الأمعاء الدقيقة وenteroids 9، وتلك من القولون هي colonoids 9،10. وقد استخدمت هذه الأنظمة الثقافة عضي الظهارية لاختبار قدرة الخلايا وحيدة معزولة لتكون بمثابة الخلايا الجذعية في المختبر، وبالتالي اختبار &quot;stemness&quot; من الخلايا المعزولة 5،6،10-15. وقد استخدم باحثون آخرون كلا enteroids وcolonoids لدراسة وظيفة الخلايا الظهارية الفردية 16-21. وهكذا، والثقافات enteroid وcolonoid يمكن استخدامها لتقييم كل الجذعية والخلايا الجذعية غير وظائف وإعطاء نظرة جديدة في التفاعلات الخلوية الأساسية داخل الأمعاء. في عام 2011، ولدت ساتو وزملاؤه الثقافة على المدى الطويل organoids الظهارية المستمدة من الأمعاء الدقيقة والقولون البشري 22،23. وإلى جانب الاختلافات في تكوين وسائل الإعلام، وenteroids الظهارية البشريةوcolonoids يحمل نفس خصائص نظيرتها الفئران. وعلاوة على ذلك، فإنها يمكن أن تتولد من الأنسجة المريضة مثل المريء والورم الحميد باريت أو غدية، والتليف الكيسي 22،24. enteroids الإنسان تشكل نظاما قيما لدراسة المعوية الجذعية خلايا الظهارية المخاطية والبيولوجيا، ويكون بمثابة نظام تجريبي جديد لدراسة علم وظائف الأعضاء الهضمي على حد سواء طبيعية وغير طبيعية 3. نحن هنا وصف الأساليب لإنشاء enteroids وcolonoids من الأمعاء الدقيقة البشرية والخبايا القولون (الشكل 1). في هذا الاستعراض المنهجي، فإننا نؤكد على جمع سرداب من النسيج كله والخزعات. نحن ألخص طرائق الثقافة التي هي ضرورية لنمو ناجح وصيانة enteroids وcolonoids البشرية والاستراتيجيات الممكنة التجريبية التي قام بها هذا النموذج.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="803">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:480px;">Name of Reagent</td>
			<td style="width:195px;">Company</td>
			<td style="width:129px;">Catalog Number</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate buffered saline Ca2+, Mg2+ free (DPBS)</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>431788</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorbitol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP439-500</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sucrose</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP220-1</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1600-100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Gzntamycin/Amphotericin B solution</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>R-015-10</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wnt-3A conditionned medium</td>
			<td>in house</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>12634-028</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES 1M</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GlutaMAX (glutamine)</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>15140-148</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N2 Supplement</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>17502-048</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">B27 Supplement</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9165-5G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nicotidamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0636</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>356231</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human recombinant Noggin</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>6057-NG/CF</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human recombinant R-Spondin</td>
			<td>Preprotech</td>
			<td>120-38</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human recombinant EGF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E9644-.2MG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Y-27632</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Y0503-1MG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">A-83-01</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2939</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SB202190</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7067-5MG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human [Leu]15-Gastrin 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9145-.1MG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CHIR99021</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0004</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thiazovivin</td>
			<td>Stemgent</td>
			<td>04-0017</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme)</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>12605-010</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>10082-147</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium)</td>
			<td>Life technologies; Gibco</td>
			<td>A13713-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L Wnt-3A cell line</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2647</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Renilla luciferase assay</td>
			<td>Promega</td>
			<td>E2710</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human recombinant Wnt-3A</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>5036-WN/CF</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">HEK293 TOPflash cell line</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

ويبين الشكل 2D مثال نموذجي من أقبية المعزولة حديثا من النسيج كله (الشكل 2D). عدد أقبية معزولة عن الخزعة هو أقل منه في الأنسجة كلها. باستخدام معيار ملقط الخزعة القدرة مع إبرة، ونحن عادة أداء اثنين من لدغات الخزعة على مسار واحد. كل النتائج دغة خزعة في سطح 10 مم 2 بمتوسط ​​50 إلى 100 ​​الأقبية في خزعة (الشكل 2F). بعد الثقافة في مصفوفة الغشاء القاعدي، الخبايا تعتقل لتشكيل enterospheres للالأمعاء الدقيقة والقولون colonospheres ل. سرداب في مهدها عادة ما يحدث في غضون 5 إلى 6 أيام، بعد البذر. ومع ذلك فإنه ليس من غير المألوف أن نرى إما enteroids (enteroids) أو colonoids (colonoids) تشكيل المجالات في مصفوفة الغشاء القاعدي (الشكل 3A-C، فيلم 1). ويمكن أن يتم الركض بعد 7 أيام، اعتمادا على حجم enteroids. وenteroids أو colonoids أنشأناished من الخزعات الخضوع لنفس التطور في الثقافة. لكن، وكما كثافة سرداب في البذر أقل، وعادة ما يتم القيام به على الركض بعد 10 إلى 12 يوما في الثقافة (الشكل 4A، ب). Enteroids وcolonoids الثقافات توسيع بطريقة استنساخه. كلا enteroids وcolonoids تقديم الجانب اللمعية وتصطف مع ظهارة (الشكل 5A، B). ويمكن ملاحظة خلايا التكاثري داخل enteroids وتقع ضمن نصائح برعم (الشكل 5C، D). التصوير متحد البؤر من enteroids ملطخة-E كادهيرين (ECAD) يدل على الخلايا الظهارية (الشكل 5E). يمكن أن تنشأ على حد سواء enteroids وcolonoids من الأنسجة التي تم الحصول عليها من المرضى الذين يعانون من / الاضطرابات الخلقية الوراثية الشكل 6 معارض enteroids ممثل المتزايد من مريض يعانون من التليف الكيسي (الشكل 6A) والأمعاء تلمم بسبب طفرة الخلقية في الإعلان الخلايا الظهاريةالجينات جزيء hesion (EpCAM) (الشكل 6B). بجانب خلل جيني، وenteroids لا يحمل الاختلافات في حالة القاعدية. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig1highres.jpg" /> يتم عزل الشكل 1. سير العمل من أقبية التفكك وجيل من enteroids البشرية وcolonoids في الثقافة. الأقبية (من الأمعاء الدقيقة أو القولون البشري) من خلال EDTA عملية إزالة معدن ثقيل. أقبية مثقف تشكل enteroids للالأمعاء الدقيقة وcolonoids لالقولون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig2highres.jpg" /> الشكل 2. عملية تشريح لعزل سرداب. (A) وspecime الأمعاء الصغيرةويمتد ن ويعلق شقة في طبق بتري المغلفة السيليكون. يتم فصل (ب) الغشاء المخاطي من تحت المخاطية الأساسية. ويمتد (C) والغشاء المخاطي تشريح ويعلق شقة في طبق بتري المغلفة السيليكون. (D) بعد EDTA عملية إزالة معدن ثقيل، يتم عزل الخبايا من الأنسجة. ويمتد (E) واحدة خزعة ويعلق شقة في طبق بتري المغلفة السيليكون. (F) بعد EDTA عملية إزالة معدن ثقيل، يتم عزل الأقبية من الخزعة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig3highres.jpg" /> الشكل 3. ثقافة القبو وenteroid البشرية والجيل colonoid من الأنسجة كلها. (A) أقبية صائمية مطلي في مصفوفة الغشاء القاعدي بعد عزلة. الخبايا ويغلق مرتفعا بعد 3 إلى 4 ساعات والبدء في بالون حتى تشكيل enterospheres بعد هذا الوقت. في 7 أيام، وشكلت enteroids صائمي. (B) بعد العزلة والثقافة، وأقبية اللفائفية تتصرف مثل الخبايا صائمية وتشكل enteroids لفائفي. ومطلي (C) أقبية القولون في مصفوفة الغشاء القاعدي بعد العزلة. الخبايا colonoids وثيقة والنموذج بعد 7 أيام (أشرطة مقياس: 100 ميكرون). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig4highres.jpg" /> الشكل 4. الثقافة القبو وenteroid البشرية والجيل colonoid من الخزعة. (A) أقبية الاثني عشر مطلي في مصفوفة الغشاء القاعدي بعد العزلة. الخبايا ويغلق مرتفعا بعد 3 إلى 4 ساعات والبدء في بالون يصل beyoالثانية هذا الوقت لتشكيل enterospheres. في 7 أيام، وشكلت enteroids. (B) بعد العزلة والثقافة، ومطلي أقبية القولون في مصفوفة الغشاء القاعدي. الخبايا عن قرب لتشكيل colonospheres ثم colonoids بعد 7 أيام (أشرطة مقياس: 100 ميكرون). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig5highres.jpg" /> الشكل 5. الأنساب المعوية من enteroids البشرية. (A) enteroid الإنسان بعد 6 أيام في الثقافة. (B) أقسام الهيماتوكسيلين يوزين من enteroids في (A) تدليل على الطلائية المبطنة (أشرطة مقياس: 100 ميكرون). (CD) التصوير متحد البؤر من enteroids بعد EDU تلطيخ (البنفسجي) يدل على وجود خلايا التكاثري. (E </strاونج&gt;) التصوير متحد البؤر من enteroids يوضح وجود: E-كادهيرين للخلايا الظهارية (ECAD والأخضر) (شريط مقياس: 50 ميكرون) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig6highres.jpg" /> الشكل 6. الثقافة القبو وتوليد enteroid الإنسان من الأنسجة المريضة. (A) Enteroids أنشئت من عينة التليف الكيسي. (B) Enteroids أنشئت من عينة الخلقية تلمم الأمعاء (أشرطة مقياس: 100 ميكرون). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> الفيلم 1. Enterosphere تشكيل enteroid الإنسان في الثقافة. 32 ساعة الوقت فاتويظهر الفيلم على البريد enterosphere أنشئت من الأمعاء الدقيقة البشري التراجع لتشكيل enteroid في الثقافة. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/Movie1_v2.mp4" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف </td><td> شركة </td><td> عدد كتالوج </td><td> مذيب </td><td> الأسهم تركيز </td><td> تركيز النهائي </td><td> تعليق </td></tr><tr><td> الفوسفات Dulbecco ومخزنة المالحة الكالسيوم 2+، والمغنيسيوم 2+ مجانا (DPBS) </td><td> تقنيات الحياة؛ GIBCO </td><td> 14190-144 </td><td> - </td><td> - </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> الإيثيلين حمض tetraacetic (EDTA) </td><td> سيغما الدريتش </td><td> 431788 </td><td> عالى النقاء درهم 2 O </td><tد&gt; 0.5 M </td><td> 2 مم </td><td></td></tr><tr><td> السوربيتول </td><td> فيشر العلمي </td><td> BP439-500 </td><td> DPBS </td><td> مسحوق </td><td> 2٪ </td><td></td></tr><tr><td> سكر القصب </td><td> فيشر العلمي </td><td> BP220-1 </td><td> DPBS </td><td> مسحوق </td><td> 1٪ </td><td></td></tr><tr><td> ألبومين المصل البقري (BSA) جزء V </td><td> فيشر العلمي </td><td> BP1600-100 </td><td> DPBS </td><td> مسحوق </td><td> 1٪ </td><td></td></tr><tr><td> Gzntamycin / الامفوتريسين B الحل </td><td> تقنيات الحياة؛ GIBCO </td><td> R-015-10 </td><td> - </td><td> 500X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> WNT-3A conditionned المتوسطة </td><td> في المنزل </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> المتقدم DMEM / F12 </td><td> تقنيات الحياة؛ GIBCO </td><td> 12634-028 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> تقنيات الحياة؛ GIBCO </td><td> 15630-080 </td><td> - </td><td> 1 M </td><td> 10 ملي </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX (الجلوتامين) </td><td> تقنيات الحياة؛ GIBCO </td><td> 35050-061 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> البنسلين، الستربتوميسين (10،000 U / مل) </td><td> تقنيات الحياة؛ GIBCO </td><td> 15140-148 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> الملحق N2 </td><td> تقنيات الحياة؛ GIBCO </td><td> 17502-048 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> الملحق B27 </td><td> تقنيات الحياة؛ GIBCO </td><td> 17504-044 </td><td> - </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> N-أسيتيل </td><td> سيغما الدريتش </td><td> A9165-5G </td><td> DPBS </td><td> 1 M </td><td> 1 ملم </td><td> &lt;/ td&gt; </tr><tr><td> Nicotidamide </td><td> سيغما الدريتش </td><td> N0636 </td><td> DPBS </td><td> 1 M </td><td> 10 ملي </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel، GFR، الفينول (مصفوفة الغشاء القاعدي) مجانا </td><td> كورنينج </td><td> 356231 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> مطلوب </td></tr><tr><td> رأس المؤتلف الإنسان </td><td> R &amp; D </td><td> 6057-NG / CF </td><td> DPBS </td><td> 100 ميكروغرام / مل </td><td> 100 نانوغرام / مل </td><td rowspan="3"> موردين آخرين: R &amp; D، Anaspec وPreprotech </td></tr><tr><td> الإنسان المؤتلف R-Spondin </td><td> Preprotech </td><td> 120-38 </td><td> DPBS </td><td> 1 ملغ / مل </td><td> 1 ميكروغرام / مل </td></tr><tr><td> EGF المؤتلف الإنسان </td><td> سيغما الدريتش </td><td> E9644-.2MG </td><td> DBPS </td><td> 500 ميكروغرام / مل </td><td> 50 نانوغرام / مل </td></tr><tr><td> Y-27632 </td><td> سيغما الدريتش </td><td> Y0503-1MG </td><td> DPBS </td><td> 10 ملي </td><td> 10 ميكرومتر </td><td></td></tr><tr><td> A-83-01 </td><td> Tocris </td><td> 2939 </td><td> DMSO </td><td> 500 ميكرومتر </td><td> 500 نانومتر </td><td></td></tr><tr><td> SB202190 </td><td> سيغما الدريتش </td><td> S7067-5MG </td><td> DMSO </td><td> 30 ملي </td><td> 10 ميكرومتر </td><td></td></tr><tr><td> الإنسان [لوي] 15 الغاسترين 1 </td><td> سيغما الدريتش </td><td> G9145-.1MG </td><td> DPBS </td><td> 100 ميكرومتر </td><td> 10 نانومتر </td><td></td></tr><tr><td> CHIR99021 </td><td> Stemgent </td><td> 04-0004 </td><td> DMSO </td><td> 10 ملي </td><td> 2.5 ميكرومتر </td><td></td></tr><tr><td> Thiazovivin </td><td> Stemgent </td><td> 04-0017 </td><td> DMSO </td><td> 10 ملي </td><td> 2.5 ميكرومتر </td><td></td></tr><tr><td> TrypLE اكسبرس أنزيم (1X)، الفينول الأحمر (خلية انزيم تفارق) </td><td> تقنيات الحياة؛ GIBCO </td><td> 12605-010 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> لالركض </td></tr><tr><td> مصل بقري جنيني </td><td> تقنيات الحياة؛ GIBCO </td><td> 10082-147 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> لالركض </td></tr><tr><td> CTS المركب واحد في تجميد (تجميد المتوسطة) المتوسطة </td><td> تقنيات الحياة؛ GIBCO </td><td> A13713-01 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> لتجميد </td></tr><tr><td> L WNT-3A خط الخلية </td><td> ATCC </td><td> CRL-2647 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> WNT-3A conditionned الإنتاج الإعلامي </td></tr><tr><td> Renilla luciferase المراسل الفحص </td><td> PROMEGA </td><td> E2710 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> WNT-3A conditionned النشاط الإعلامي </td></tr><tr><td> البشري المؤتلف WNT-3A </td><td> R &amp; D </td><td> 5036-WN / CF </td><td> DPBS </td><td> 100 ميكروغرام / مل </td><td> 100 نانوغرام / مل </td><td&gt; النشاط الإعلامي WNT-3A conditionned </td></tr><tr><td> خط الخلية HEK293 TOPflash </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> WNT-3A conditionned النشاط الإعلامي. هدية من هانز كليفرز المختبر </td></tr></tbody></table> الجدول 1. قائمة كاشف مفصل مع الشركة المصنعة المفضل ورقم الكتالوج. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> معدات </td><td> مستهلكات </td><td> أدوات </td></tr><tr><td> غطاء تدفق الصفحي </td><td> 15- و 50 مل أنابيب مخروطية </td><td> دومون # 5 ملقط القياسية (FST؛ # 11251-20) </td></tr><tr><td> CO حاضنة 2 </td><td> أنابيب microfuge </td><td> دومون # 7، ملقط غرامة منحني (FST؛ # 11274-20) </td></tr><tr><td> ستيريو المجهر </td><td> 24 لوحات جيدا </td><td> مقص الدقيقة (FST؛ # 14060-09) </td></tr><tص&gt; <td> نبذ </td><td> 0.22 ميكرون مرشحات (سارتوريوس) </td><td> مقص الربيع Vannas (FST؛ # 15018-10) </td></tr><tr><td> شاكر المداري </td><td> الماصات المصلية </td><td> قطر minutien دبابيس 0.2 ملم (FST؛ # 26002-20) </td></tr><tr><td> حاوية التجمد (Nalgene) </td><td> نصائح ممص مكروى </td><td> قطر minutien دبابيس 0.1 ملم (FST؛ # 26002-10) </td></tr><tr><td> Sylgard 184 سيليكون (داو كورنينج) </td><td> 150 ميكرون فتحات شبكة، وفحص النايلون (الديناميكي أكوا العرض) </td><td></td></tr><tr><td> صحن من الزجاج بيتري </td><td> 5 مل أنابيب البولي بروبلين جولة القاع (فالكون) </td><td></td></tr><tr><td> pipettor المصلية </td><td> 18G التعبئة حادة إبرة (BD) </td><td></td></tr><tr><td> ممص مكروى </td><td> 3 مل lsyringes مع نصائح لور-لوك (BD) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Cryovials </td><td></td></tr></tbody></table><sترونج&gt; الجدول 2. تفصيلية المواد الاستهلاكية والأدوات والمعدات اللازمة لعزل سرداب والثقافة.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy at JoVE.com

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

إنشاء الإنسان الظهارية Enteroids وColonoids من الأنسجة كامل وخزعة

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

establishment-human-epithelial-enteroids-colonoids-from-whole-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

34.4K Views.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Video: Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

إنشاء والدعوة للأورام الشبكية الإنسان في الفئران أن نقص المناعة

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Real-time Cytotoxicity Assays in Human Whole Blood

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with high-throughput cell positioning technology. The targeted tumor cell populations are first preprogrammed to immobilization into an array format, and labeled with green fluorescent cytosolic dyes. Following the cell array formation, antibody drugs are added in combination with human whole blood. Propidium iodide (PI) is then added to assess cell death. The cell array is analyzed with an automatic imaging system. While cytosolic dye labels the targeted tumor cell populations, PI labels the dead tumor cell populations. Thus, the percentage of target cancer cell killing can be quantified by calculating the number of surviving targeted cells to the number of dead targeted cells. With this method, researchers are able to access time-dependent and dose-dependent cell cytotoxicity information. Remarkably, no hazardous radiochemicals are used. The WCA presented here has been tested with lymphoma, leukemia, and solid tumor cell lines. Therefore, WCA allows researchers to assess drug efficacy in a highly relevant ex&#160;vivo condition.

The whole blood cytotoxicity assay (WCA) is a cytotoxicity assay developed by incorporating high-throughput cell positioning technology with fluorescence microscopy and automated image processing. Here, we describe how lymphoma cells treated with an anti-CD20 antibody can be analyzed real-time in human whole blood to provide quantitative cellular cytotoxicity analysis.

في الوقت الحقيقي السمسة فحوصات في الدم الكامل بالبشر

A live cell-based whole blood cytotoxicity assay (WCA) that allows access to temporal information of the overall cell cytotoxicity is developed with ...

Isolation and Immortalization of Patient-derived Cell Lines from Muscle Biopsy for Disease Modeling

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected from skin or muscle biopsy tissue available during the patient&#8217;s diagnostic workup. In this protocol, we describe a technique for live cell isolation from small amounts of muscle or skin tissue for primary cell culture. Additionally, we provide a technique for the immortalization of myogenic cell lines and fibroblast cell lines from primary cells. Once cell lines are immortalized, substantial expansion of patient-derived cells can be achieved. Immortalized cells are amenable to many downstream applications, including drug screening and in vitro correction of the genetic mutation. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

This protocol describes techniques for live cell isolation and primary culture of myogenic and fibroblast cell lines from muscle or skin tissue. A technique for the immortalization of these cell lines is also described. Altogether, these protocols provide a reliable tool to generate and preserve patient-derived cells for downstream applications.

العزلة وتخليد خطوط الخلايا المشتقة من المريض من خزعة العضلات لمرض النمذجة

The generation of patient-specific cell lines represents an invaluable tool for diagnostic or translational research, and these cells can be collected ...

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

تقييم إعداد وRespirometric من الميتوكوندريا المعزولة من الأنسجة العضلية الهيكلية التي تحصل عليها عن طريق الجلد إبرة الخزعة

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and well tolerated technique. The Weil-Blakesley conchotome has a sharp biting tip with a 4 - 6 mm wide hollow. It is inserted through a 5 - 10 mm skin incision and can be maneuvered for controlled tissue penetration. The tip is opened and closed within the tissue and then rotated through 90 -180&#176; to cut the muscle. The amount of muscle obtained following repeated sampling can vary from 20 mg to 290 mg which can be processed for both histology and molecular studies. The wound needs to be kept dry and vigorous physical activity kept to a minimum for approximately 72 hr although normal levels of activity can restart immediately following the procedure. This procedure is safe and effective when close attention is paid to the selection of subjects, full asepsis and post procedure care. &#160;Both right and left vastus lateralis are suitable for biopsy dependent on participant preference.

Human Vastus Lateralis Skeletal Muscle Biopsy Using the Weil-Blakesley Conchotome

This video demonstrates the technique of percutaneous muscle biopsy of the human vastus lateralis using the Weil-Blakesley conchotome.

الانسان<em&gt; المتسعة الوحشية</em&gt; الهيكل العظمي خزعة العضلات باستخدام ويل Blakesley مبضع المحارات

Percutaneous muscle biopsy using the Weil-Blakesley conchotome is well established in both clinical and research practice. It is a safe, effective and ...

3D Whole-heart Myocardial Tissue Analysis

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other biologicals that enhance angio- or vasculogenesis into the infarct border zone (IBZ), tissue perfusion is improved, and the myocardium can be protected from further damage. For maximum therapeutic effect, it is hypothesized that the regenerative substance is best delivered to the IBZ. This requires accurate injections and has led to the development of new injection techniques. To validate these new techniques, we have designed a validation protocol based on myocardial tissue analysis. This protocol includes whole-heart myocardial tissue processing that enables detailed two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) analysis of the cardiac anatomy and intramyocardial injections. In a pig, myocardial infarction was created by a 90-min occlusion of the left anterior descending coronary artery. Four weeks later, a mixture of a hydrogel with superparamagnetic iron oxide particles (SPIOs) and fluorescent beads was injected in the IBZ using a minimally-invasive endocardial approach. 1 h after the injection procedure, the pig was euthanized, and the heart was excised and embedded in agarose (agar). After the solidification of the agar, magnetic resonance imaging (MRI), slicing of the heart, and fluorescence imaging were performed. After image post-processing, 3D analysis was performed to assess the IBZ targeting accuracy. This protocol provides a structured and reproducible method for the assessment of the targeting accuracy of intramyocardial injections into the IBZ. The protocol can be easily used when the processing of scar tissue and/or validation of the injection accuracy of the whole heart is desired.

This protocol describes a novel method for the 3D comparison of whole-heart myocardial tissue with MRI. This is designed for the accurate assessment of intramyocardial injections in the infarct border zone of a chronic porcine model of myocardial infarction.

3D الجامع القلب تحليل الأنسجة عضلة القلب

Cardiac regenerative therapies aim to protect and repair the injured heart in patients with ischemic heart disease. By injecting stem cells or other ...

A Technique for Subcutaneous Abdominal Adipose Tissue Biopsy via a Non-diathermy Method

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To obtain subcutaneous adipose tissue biopsies in the abdominal area, researchers and physicians use either a surgical or a needle-based technique. However, surgical subcutaneous fat biopsies can offer tissue samples that may provide a more comprehensive overview of the complexities of biological indices in white adipose tissue. Usually, a surgical adipose tissue biopsy includes a diathermy treatment for cauterizing blood vessels to prevent excessive bleeding. Nevertheless, side effects, such as flash fires and skin lesions in the tissue, have been reported after diathermy. Therefore, we aimed to standardize a surgical abdominal adipose tissue biopsy performed under local anesthesia using a non-diathermy method. We conducted 115 subcutaneous adipose tissue biopsies in healthy men using a non-diathermy abdominal surgical biopsy method. Our results showed three cases of excessive post-operation bleeding out of 115 operations (2.61%).In conclusion, our standardized subcutaneous abdominal adipose tissue surgical biopsy using a non-diathermy method can be safely applied to healthy men at the bedside, with minimal side effects.

We standardized an abdominal adipose tissue biopsy using a non-diathermy method performed under local anesthesia. Three cases of excessive post-operation bleeding out of 115 operations (2.61%) occurred.We conclude that an abdominal adipose tissue surgical biopsy using a non-diathermy method can be safely applied to healthy men.

تقنية للأنسجة الدهنية تحت الجلد للبطن خزعة عبر أسلوب غير النافذة

Adipose tissue biopsies offer tissue samples that, upon analysis, may provide insightful overviews of mechanisms relating to metabolism and disease. To ...

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to expend energy has made it a potential target for novel therapies to ameliorate obesity and associated metabolic disorders in humans. Though this tissue has been well studied in small animals, BAT&#39;s thermogenic capacity in humans remains largely unknown due to the difficulties of measuring its volume, activity, and distribution. Identifying and quantifying active human BAT is commonly performed using 18F-Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) positron emission tomography and computed tomography (PET/CT) scans following cold-exposure or pharmacological activation. Here we describe a detailed image-analysis approach to quantify total-body human BAT from 18F-FDG PET/CT scans using an open-source software. We demonstrate the drawing of user-specified regions of interest to identify metabolically active adipose tissue while avoiding common non-BAT tissues, to measure BAT volume and activity, and to further characterize its anatomical distribution. Although this rigorous approach is time-consuming, we believe it will ultimately provide a foundation to develop future automated BAT quantification algorithms.

Whole Body and Regional Quantification of Active Human Brown Adipose Tissue Using 18F-FDG PET/CT

Using free, open-source software, we have developed an analytical approach to quantify total and regional brown adipose tissue (BAT) volume and metabolic activity of BAT using 18F-FDG PET/CT.

الجسم كله والإقليمية الكمي لنشاط الإنسان براون الأنسجة الدهنية باستخدام 18وفدج PET/CT

In endothermic animals, brown adipose tissue (BAT) is activated to produce heat for defending body temperature in response to cold. BAT&#39;s ability to ...

Culture and Imaging of Human Nasal Epithelial Organoids

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator (CFTR) activity and restoration from small molecule compounds. Our group recently focused on establishing a well-differentiated organoid model directly derived from primary human nasal epithelial cells (HNE). Histology of sectioned organoids, whole-mount immunofluorescent staining, and imaging (using confocal microscopy, immunofluorescent microscopy, and bright field) are essential to characterize organoids and confirm epithelial differentiation in preparation for functional assays. Furthermore, HNE organoids produce lumens of varying sizes that correlate with CFTR activity, distinguishing between CF and non-CF organoids. In this manuscript, the methodology for culturing HNE organoids are described in detail, focusing on the assessment of differentiation using the imaging modalities, including the measurement of baseline lumen area (a method of CFTR activity measurement in organoids that any laboratory with a microscope can employ) as well as the developed automated approach to a functional assay (which requires more specialized equipment).

A detailed protocol is presented here to describe an in vitro organoid model from human nasal epithelial cells. The protocol has options for measurements requiring standard laboratory equipment, with additional possibilities for specialized equipment and software.

زراعة وتصوير المواد العضوية الظهارية الأنفية البشرية

Individualized therapy for cystic fibrosis (CF) patients can be achieved with an in vitro disease model to understand baseline Cystic Fibrosis ...

Testing Epithelial Permeability in Fetal Tissue-Derived Enteroids

Human fetal tissue-derived enteroids are emerging as a promising in vitro model to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids exhibit polarity, consisting of a lumen with an apical border, tight junctions, and a basolateral outer layer exposed to growth media. The consequences of intestinal injuries include mucosal inflammation and increased permeability. Testing intestinal permeability in vulnerable preterm human subjects is often not feasible. Thus, an in vitro fetal tissue-derived intestinal model is needed to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids can be used to test changes in epithelial permeability regulated by tight junction proteins. In enteroids, intestinal stem cells differentiate into all epithelial cell types and form a three-dimensional structure on a basement membrane matrix secreted by mouse sarcoma cells. In this article, we describe the methods used for establishing enteroids from fetal intestinal tissue, characterizing the enteroid tight junction proteins with immunofluorescent imaging, and testing epithelial permeability. As gram-negative dominant bacterial dysbiosis is a known risk factor for intestinal injury, we used lipopolysaccharide (LPS), an endotoxin produced by gram-negative bacteria, to induce permeability in the enteroids. Fluorescein-labeled dextran was microinjected into the enteroid lumen, and serial dextran concentrations leaked into the culture media were measured to quantify the changes in paracellular permeability. The experiment showed that apical exposure to LPS induces epithelial permeability in a concentration-dependent manner. These findings support the hypothesis that gram-negative dominant dysbiosis contributes to the mechanism of intestinal injury in preterm infants.

This protocol details the establishment of enteroids, a three-dimensional intestinal model, from fetal intestinal tissue. Immunofluorescent imaging of epithelial biomarkers was used for model characterization. Apical exposure of lipopolysaccharides, a bacterial endotoxin, using microinjection technique induced epithelial permeability in a dose-dependent manner measured by the leakage of fluorescent dextran.