الأمعاء هي أجهزة أعضاء ثلاثية الأبعاد مشتقة من الخلايا الظهارية المعوية. فهي مثالية لدراسة التفاعلات الفسيولوجية المعقدة ، وإشارات الخلايا ، والدفاع الممرض المضيف. يصف بروتوكولنا كيفية زراعة الأمعاء البشرية بعد عزل الخلايا الجذعية المعوية من المرضى الذين يخضعون لعملية استئصال الأمعاء.
الإدارة المشتركة للدهون الدهنية في وسائل الإعلام ثقافتنا يسبب استجابة التهابية في المعوي مما يؤدي إلى الهستوولوجي، والوراثة، والبروتين التعديلات التعبير مماثلة لتلك التي شوهدت في التهاب القولون المعوي نخر الإنسان. وبالنظر إلى أن دراسة التهاب الأمعاء القولون النخري والعوامل العلاجية المحتملة تشكل تحديا أخلاقيا في البشر، وخاصة الأطفال، فمن المرغوب فيه للغاية الاستفادة من هذا النموذج البيوئي الرواية ذات الصلة بيولوجيا من التهاب الأمعاء القولون النخري باستخدام أنسجة حديثي الولادة البشرية. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن الأمعاء قادرة على تلخيص أنواع الخلايا المتعددة من ظهارة الأمعاء البشرية وقادرة على التغلب على القيود المعترف بها من النماذج الحيوانية والنظم القائمة على الخلايا.
المساعدة في إثبات الإجراء سيكون كريستي بونباني، وهي مقيمة جراحية، وكاري يوان، فني مختبر من مختبرنا. في وقت جمع في جناح المنطوق، ووضع عينة الأنسجة المعوية الصغيرة الإنسان في DPBS الباردة. اغسل العينة في DPBS الباردة حتى تكون واضحة من الدم والبراز.
تخزين العينة في RPMI 1640 المتوسطة في أربع درجات مئوية حتى جاهزة لعزل سرداب. عندما تكون جاهزة للمضي قدما، تحقق مرة أخرى أن العينة واضحة من البراز والدم. باستخدام مقص تشريح حساسة إزالة أي الدهون الزائدة أو لقطات الجراحية والمواد الغذائية.
وزن العينة والهدف لقطعة التي هي ما يقرب من 0.75 إلى 2.5 غرام. بعد ذلك ، قطع الأنسجة إلى قطع 0.5 سنتيمتر ووضعها في أنبوب يحتوي على 30 ملليلتر من الحاجز المؤقت رقم واحد. هز بسرعة منخفضة لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية.
ثم، تصفية الأنسجة من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرومتر والتخلص من تدفق من خلال. إضافة الأنسجة المصفاة إلى أنبوب يحتوي على 30 ملليلتر من chelating العازلة رقم اثنين. هز بسرعة منخفضة لمدة 15 دقيقة في أربع درجات مئوية.
تصفية الأنسجة من خلال مرشح 100 ميكرومتر والتخلص من تدفق من خلال. بعد ذلك، ذوبان 500 ميكرولترات من مصفوفة غشاء الطابق السفلي على الجليد لاستخدامها في وقت لاحق. إضافة بعض الأنسجة إلى 10 ملليلتر من DMEM الباردة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر ويهز بقوة باليد لمدة 10 ثانية.
تصفية هذا التعليق من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرومتر وجمع تدفق من خلال. أبق هذا الأنبوب على الجليد إضافة بعض الأنسجة إلى آخر 10 ملليلتر من DMEM الباردة في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر منفصلة ويهز بقوة باليد لمدة 10 ثانية.
تصفية هذا التعليق من خلال مصفاة الخلية 100 ميكرومتر وجمع تدفق من خلال. كرر العملية مرتين إضافية حتى يكون هناك أربعة أنابيب المخروطية التي تحتوي على تدفق من خلال واحد المسمى من خلال أربعة. ثم، تصفية الحل في أنبوب رقم واحد من خلال مصفاة الخلية ميكرومتر 100 ونقل تدفق من خلال إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر أيضا المسمى رقم واحد.
كرر هذه العملية للأنابيب من 2 إلى 4. أجهزة الطرد المركزي أنابيب 15 ملليلتر في 200 مرة G و4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. في غطاء محرك التدفق الفاتن، إزالة ناظر من كل أنبوب وتجاهله.
تجنب تعطيل سحابة من الأنسجة مباشرة فوق بيليه، حتى لو كان ذلك يعني ترك بعض متجاوز وراء. في كل أنبوب، ماصة صعودا وهبوطا ببطء لخلط بيليه مع بقايا supernatant. نقل الخليط من كل أنبوب إلى أنبوب واحد مخروطي ملليلتر وطاردة مركزية في 200 مرة G وعلى أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
بعد هذا، وإزالة عظمى و resuspend بيليه في 500 ميكرولترات من مصفوفة غشاء الطابق السفلي قبل ذوبانها. استخدام طرف ماصة مبردة لتطبيق 50 ميكرولترات من هذا التعليق إلى مركز بئر في 24 لوحة جيدا. يجب أن تظهر هذه العينة على شكل قبة.
كرر عملية الطلب هذه تسع مرات لملء 10 آبار إجمالية. نقل 24 لوحة البئر إلى حاضنة 5٪ ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح البلمرة. ثم، إضافة 500 ميكرولترات من وسائل الإعلام المصغرة الإنسان كاملة إلى كل بئر.
مواصلة احتضان تحت نفس الظروف، مع التأكد من استبدال هذه الوسائط كل يومين. أولاً، إضافة 10 ميكرولترات من LPS بتركيز خمسة ملليغرام لكل ملليلتر إلى 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام المصغرة البشرية كاملة في كل بئر من لوحة في اليوم صفر. مواصلة احتضان في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون واستبدال وسائل الإعلام المكملة كل يومين حتى جمع.
للتحضير للparffin embedding ، أولا إزالة بلطف وسائل الإعلام ، إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني ، والماصات بلطف صعودا وهبوطا إلى حل مصفوفة غشاء الطابق السفلي في حين يجري الحرص على عدم التحلل من الـ المعوي. أجهزة الطرد المركزي بسرعة أقل من 300 مرة G لمدة خمس دقائق ل بيليه ثم إزالة برنامج تلفزيوني. إضافة 4٪ paraformaldehyde وتوضع أنبوب جانبا لمدة ساعة واحدة لإصلاح في درجة حرارة الغرفة.
أجهزة الطرد المركزي بسرعة أقل من 300 مرة G لمدة خمس دقائق ل بيليه ثم إزالة شبه شكلي. اغسل بلطف مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني وطاردة مركزية بسرعة أقل من 300 مرة G لمدة خمس دقائق. ثم إزالة برنامج تلفزيوني.
كرر عملية الغسيل هذه مع برنامج تلفزيوني مرة واحدة. ضع الكمية المطلوبة من هلام معالجة الأنسجة في أنبوب مخروطي وتدفئه في حاضنة حمام جاف عند 65 درجة مئوية لمدة ثلاث إلى 10 دقائق حتى يصبح سائلًا. بعد ذلك، إضافة هلام معالجة الأنسجة الذائبة إلى بيليه ومزيج بلطف.
ضع حلقة استنساخ صغيرة في غطاء. مازيت هلام معالجة الأنسجة والخليط المعوي في حلقة الاستنساخ التي يتم تركيبها على غطاء. السماح لجل معالجة الأنسجة والخليط المعوي لتتوطد عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة واحدة.
ثم غمر حلقة الاستنساخ مع الخليط المترسخ في 70٪ الإيثانول للتحضير embedding البارافين. مباشرة بعد الطلاء، و سرداب الأمعاء المعزولة حديثا تظهر كقضبان ممدود. في غضون ساعات سوف تأخذ الoidoids على مظهر مستدير.
على مدى الأيام القليلة القادمة سوف تبدأ الـoidoids في تشكيل المجالات. يجب أن يحدث في مهدها بين خمسة إلى 10 أيام، وهو عندما يجب أن تحدث جمع البايoid. كما تظهر الـ"الـ"بياتويد" المتنامية قطبية، تحتوي على تجويف مركزي، وحدود بيضوية، ومجال الريحانية.
الـ (1) تظهر أيضاً السلامة الهيكلية التي يمثلها هيكل قوي للكتّيل الكيسي. بعد عدة أيام في الثقافة، والـ LBS المعالجة الoidoids تجربة أكثر المبرمج وناقلة من مجموعة التحكم. كما رأينا في NEC الإنسان في نماذج مورين من NEC، تم العثور على تعبير زيادة من حصيلة مثل مستقبلات أربعة في الـ LPS المعالجة المعوية مقارنة بالضوابط.
ويمكن أيضا أن يتم جمع البايويدات ل الحمض النووي الريبي والبروتين استخراج باستخدام راسخة qRT-PCR وتقنيات النشاف الغربية التعبير الجيني وعزل البروتين يمكن أن يؤديها.
