Name: establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy
Uploaded: 2015-03-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy at JoVE.com

We gratefully acknowledge Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands) for the kind gift of TOPflash cells.
This project was supported in part by NIH-R01DK083325 (MAH); NIH P30 DK078392 (Digestive Health Center); NIH UL1RR026314 (CTSA).

NOT: Etik Açıklama: CCHMC bir IRB tarafından onaylanmıştır burada tarif edilen insan dokuları kullanılarak tüm deney (KİK # 2012-2858; # 2014-0427). Doku toplama, depolama ve numunelerin kullanımı için bilgilendirilmiş onam CCHMC de donörlerden elde edilmiştir. Kültür 1. Hazırlık NOT: Tüm reaktifler Tablo 1&#39;de verilmiştir. <ol><li> Aşağıdaki gibi, EDTA, bir stok çözelti hazırlayın: 0.5 M etilendiamin tetraasetik asit, son derece saf, H2O, 0.22 um filtre ile steril filtre pH 8 (EDTA) hazırlanması. İsteğe bağlı olarak, süresiz olarak oda sıcaklığında EDTA stok çözeltisi saklayın. </li><li> Aşağıdaki gibi kenetleme tamponu hazırlayın:% 2 arasında sorbitol,% 1 sükroz,% 1 sığır serum albümin fraksiyonu V (BSA) ile karıştırmak ve 1x Gentamisin / Dulbecco Fosfat Amfoterisin çözeltisi Ca olmadan tamponlu tuz + 2 ve Mg + 2 (DPBS), filtre ile sterilize 0.22 um&#39;lik bir filtre ile. Kenetleme buf hazırlayınfer taze. </li><li> Wnt-3A-koşullu ortam, üreticinin talimatlarına (ATCC CRL-2647) &#39;e göre hücre çizgisi L, Wnt-3A ile evde yapılan aşağıdaki gibidir: orta, Wnt-3A durumunu hazırlayın. 0.22 um filtre ile steril, 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin, 1, N2 ek, 1 B27 ek,% 1 BSA ve filtre ortamı Ek. NOT: Test TOPflash tahlili kullanılarak Wnt faaliyet için her parti. Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir Renilla lusiferaz deney kiti ile istikrarlı HEK293 TOPflash, hücre çizgisi (Hans Clevers laboratuar) kullanın. 100 ng / ml insan rekombinant Wnt-3A ile TOPflash deneyi normalize. Kontrole göre koşullu ortamın en azından bir 10 kat değiştirme aktivitesi kontrol edin. En fazla 6 ay süreyle -20 ° C&#39;de 15 ml konik tüp ve dondurularak 10 ml&#39;lik miktarlar halinde taze Wnt-3A-koşullandırılmış bir ortam bölün. Mağaza aktivite kaybı olmadan 4 ° C de 5 gün alikotları kadar çözülmüş. </li><li> Pr0.22 sterilize 2 mM glutamin, 10 mM HEPES, 100 U / mL penisilin, 100 ug / mL streptomisin, 1, N2 ek, 1 B27 takviyesi,% 1 BSA ve filtre ile Ek Gelişmiş DMEM / F12 ortamı aşağıdaki gibidir: İnsan minigut orta epare mikron filtre. Not: 3 aya kadar -20 ° C&#39;de 15 ml konik tüp ve dondurularak 10 ml&#39;lik miktarlar halinde taze insan minigut orta bölün. Mağaza aktivite kaybı olmadan 4 ° C de 5 gün alikotları kadar çözülmüş. </li><li> Aşağıdaki gibi tam bir insan minigut orta hazırlayın XXXII kültürü ya da% 50, Wnt-3A-koşullu ortam (bakınız 1.3), 1 ug / ml, R-spondin 1 (1 ile takviye edilmiş ortam değişikliklerin insan minigut ortamında (bakınız 1.4) önce taze hazırlayın: 1000 1 mg / ml stok), 100 ng / ml Noggin seyreltilmesi (1: 1,000, 100 g / ml stok), 50 ng / ml EGF (1 seyreltme: 500 ug / ml stok), 10.000 seyreltme, 500 nM A-83 -01: ​​10 uM SB202190 (1 1000 seyreltme 500 M stok) (1: 3000 seyreltme, 30 mM stoklar), 10 nM [Leu] 15-gastrin 1 (1: 100 uM 10,000 seyreltmestok), 10 mM Nikotinamid (1: 100 seyreltme 1 M stok) ve (1 1 mM N-Asetilsistein: 1,000 seyreltme 1 M stok). NOT: aktivite kaybı olmaksızın 4 ° C&#39;de 2 gün öncesine kadar saklayın tam insan minigut medya. </li></ol> Tüm Doku 2. Crypt İzolasyon NOT: doku toplama kaynaktan bu bölge tuz içerisinde örnek korumak için esastır. Bu taşıma esnasında buz üzerinde doku tutmak için tavsiye edilir. Kriptalarının izolasyonu için numune hazırlanması mümkün olduğu kadar çabuk yapılması gerekir. NOT: Tüm reaktifler Tablo 1, araç, gereç listelenen ve sarf Tablo 2&#39;de listelenmiştir. <ol><li> Deney başlamadan önce tüm reaktifler hazırlayın. Buz üzerinde taban membran matrisi çözülme önceden kuluçkalayın 37 ° C&#39;de bir CO2 kuluçka makinesi içinde 24 oyuklu plaka. NOT: Alternatif iyi bir 24 merkezde / 15 ul kullanarak bazal membran matris ince bir katman yapmakeh plaka 37 ° C&#39;de bir CO2 inkübatör içinde koyun. Bu fakültatif aşama polimerizasyon sırasında bir damla olarak bazal membran matrisi tutar. </li><li> Ile doku yıkayın buz soğuk Dulbecco Fosfat Ca 2+ ve Mg 2+ (DPBS) olmadan tamponlu tuzlu. DPBS içeriği temizlenene kadar devam edin. </li><li> 0.2 mm çapında minutien işaretçilerini kullanılarak buz-soğuğu DPBS ile doldurulmuş bir silikon kaplı cam bir Petri tabağına doku sabitleyin. Gerin ve mukozal tarafı yukarı bakacak şekilde düz bir doku pin. </li><li> Bir mikroskop altında, mikro-diseksiyon makas ve ince nokta kavisli bir forseps kullanarak submukozaya ve bağ dokusundan örten mukozayı çıkarın (Şekil 2A, B). </li><li> Gerin ve mukozal tarafı yukarı bakacak şekilde silikon kaplı cam Petri kabı disseke mukoza düz pin. Kalan submukoza ve bağ dokusu atılır ya da başka deneylerde (Şekil 2C) için kullanılabilir. </li><li> Nazikçekavisli bir forseps ile mukoza yüzeyi kazıyın. Bu aşama, hazırlık kalitesini iyileştirmek için gereklidir. <ol><li> Ince bağırsakta için, yavaşça villus kaldırmak için mukoza kazıyın. </li><li> Kolon için, hafifçe mukoza ve enkaz kaldırmak için mukoza kazıyın. </li></ol></li><li> Villus ve enkaz kaldırmak için buz-soğuk şelasyon tamponu ile mukozayı 3-4 kez yıkayın. </li><li> (49.6 ml şelasyon tamponu 200 ul 0.5 M EDTA) taze hazırlanmış 2mM EDTA şelasyon tamponu ile mukozayı örtün. </li><li> Buz üzerinde bir Petri tabağına yerleştirin ve yatay orbital çalkalayıcı üzerinde 30 dakika boyunca yavaşça çalkalayın. </li><li> EDTA içermeyen doku buz ile soğutulmuş kenetleme tamponu ile 3-4 kez yıkayın. Yıkamadan sonra, buz soğukluğunda kenetleme tamponu içinde mukoza bırakın. </li><li> Kavisli ve ince forseps kullanarak bir mikroskop altında mukozayı işleyin. Yavaşça kavisli forseps kullanarak bağırsak crypts serbest bırakmak için mukoza kazıyın. </li><li> Yavaşça bir pi kullanarak petri mahzendeyken süspansiyon kaldırmakPette 50 ml konik tüp içine aktarın ve. NOT: Hemen hemen tüm kriptler mukozasından kaldırılmıştır emin olmak için doku kontrol edin. </li><li> 2 kez örgü 150 mikron ile kriptler süspansiyon Filtre. NOT: Bir mikroskop (Şekil 2B) kapsamında akış yoluyla crypt zenginleştirme için kontrol edin. </li><li> 50 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de kript süspansiyon 5 dakika santrifüj. Süpernatantı atın. </li><li> 5 ml buz gibi soğuk tampon maddesi içinde kenetleme pelletini. </li><li> Adım 2.15 den süspansiyon 10-ul damla başına kriptalarının sayısını. 5 ml&#39;lik yuvarlak tabanlı bir tüpe kaplama için gerekli kript sayısı aktarın. Enteroids veya colonoids kurmak için bir 24-çukurlu tabak oyuk başına 200-500 crypts kullanın. </li><li> Santrifüj 150 g de 10 dakika, 4 ° C, kript fraksiyonu. Süpernatantı. </li><li> Daha sonra kültür crypts kullanın. </li></ol> Biyopsi 3. Crypt İzolasyon <ol><li> Önce tüm reaktifler hazırlayınDeneyin başında. Buz üzerinde taban membran matrisi çözülme önceden kuluçkalayın 37 ° C&#39;de bir CO2 kuluçka makinesi içinde 24 oyuklu plaka. </li><li> Ile biyopsi yıkayın buz soğuk Dulbecco Fosfat Ca 2+ ve Mg 2+ (DPBS) olmadan tamponlu tuzlu. </li><li> 0.1 mm çapında minutien işaretçilerini kullanılarak buz-soğuğu DPBS ile doldurulmuş bir silikon kaplı cam bir Petri tabağına biyopsi sabitleyin. Gerin ve mukozal tarafı (Şekil 2E) yukarı bakacak şekilde düz bir mukoza pin. </li><li> Yavaşça villus ve enkaz kaldırmak için kavisli bir forseps ile mukoza yüzeyi kazıyın. Bu aşama, hazırlık kalitesini iyileştirmek için gereklidir. </li><li> Villus ve enkaz kaldırmak için buz-soğuk şelasyon tamponu ile Biyopsiyi 3-4 kez yıkayın. </li><li> (49.8 ml şelasyon tamponu 200 ul 0.5 M EDTA) taze hazırlanmış 2mM EDTA şelasyon tamponu ile biyopsi örtün. </li><li> Buz üzerinde bir Petri tabağına yerleştirin ve yatay orbital çalkalayıcı üzerinde 30 dakika boyunca yavaşça çalkalayın. </li> &lt;li&gt; EDTA olmadan Biyopsiyi buz gibi soğuk şelasyon tamponu ile 3-4 kez yıkayın. Yıkamadan sonra, buz soğukluğunda kenetleme tamponu içinde biyopsi bırakın. </li><li> Kavisli ve ince forseps kullanarak bir mikroskop altında biyopsi işleyin. Yavaşça mukoza kavisli bir forseps kullanarak bağırsak crypts serbest kazıyın. </li><li> Yavaşça bir pipet kullanarak petri mahzendeyken süspansiyon çıkarın ve 50 ml konik tüp transfer. NOT: Hemen hemen tüm kriptler mukozasından kaldırılmıştır emin olmak için doku kontrol edin. </li><li> 150 mikron naylon ile crypt süspansiyon 2 kez örgü Filtre. NOT: Bir mikroskop altında akış yoluyla crypt zenginleştirme için kontrol edin. </li><li> 50 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de kript süspansiyon 5 dakika santrifüj. Süpernatantı atın. </li><li> 1 ml buz gibi soğuk tampon maddesi içinde kenetleme pelletini. 1.5 ml mikrofuge&#39;de tüp kript süspansiyon aktarın. </li><li> Santrifüj 150 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca kript fraksiyonu. Süpernatantı. &lt;/ Li&gt; <li> Daha sonra kültür crypts kullanın. </li></ol> Bodrum Membran Matrix 4. Crypt Kültür <ol><li> Önceden soğutulmuş pipetlemeyin ipuçları kullanarak, bazal membran matrisi (200 ile 500 kriptler / 50 ul bazal membran matris) olarak (adım 2.18 veya 3.15 den) kript pelletini. </li><li> Önceden ısıtılmış plaka üzerinde oyuk başına taban membran matrisi kript süspansiyonu 50 ul uygulanır. Yavaşça kuyunun ortasında bazal membran matris çıkarmak. </li><li> 30 dakika taban membran matrisi tam bir polimerizasyona olanak sağlamak için 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde 24 oyuklu plaka koyun. </li><li> 2.5 uM CHIR99021 ile desteklenmiş tam insan minigut ortamının 500 ul bazal membran matrisi Bindirme (1: 4000 seyreltme, 10 mM stoklar) ve 2.5 uM Thiazovivin (1: 4000 seyreltme, 10 mM stok). </li><li> 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde plaka inkübe edin. </li><li> Taze tam huma ile orta değiştirinN minigut ortam her 2 günde. </li></ol> Kültürlenmiş Enteroids ve Colonoids 5. pasaj. Not: Geçiş Enteroids ve Colonoids sonra ilk kaplama, her 7-10 gün. Genellikle, 3 ila 4 kuyulara iyi bir bölme. <ol><li> Deneyin başlamasından önce bütün reaktifleri hazırlayın. Buz üzerinde taban membran matrisi çözülme önceden kuluçkalayın 37 ° C&#39;de bir CO2 kuluçka makinesi içinde 24 oyuklu plaka. </li><li> Buz gibi soğuk DPBS 1 ml steril ipuçları ve bindirme kullanarak ortamı çıkarın. </li><li> Ileri geri 1.000 ul ucu ile Pipet. Yeni 15 ml&#39;lik konik tüp çözüm aktarın. </li><li> Ortam 1 ml% 5 FBS ile takviye edilmiş insan minigut orta 2 ml ilave edilir. </li><li> 50 x g&#39;de, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca çözelti santrifüjleyin. Süpernatantı atın. </li><li> (: 10 mM stoklar 1000 seyreltme 1), 10 uM-Y-27632 ile takviye edilmiş hücre ayrışma enzimin 2 ml pelletini. 5 m inkübeBir su banyosu içinde 37 ° C &#39;de de. </li><li> Bir 18-G dolgu / kör iğne ile donatılmış bir 3 mi Luer-Lock şırınga kullanılarak hücre kümeleri ayırmak. Yavaşça enjektörü 10 kez kullanarak ileri ve geri çözüm pipetle. </li><li> 500 xg, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca bir süspansiyon santrifüjleyin. Süpernatantı atın. </li><li> Önceden soğutulmuş pipetlemeyin ipuçları kullanarak, bazal membran matris içinde hücre pelletini. </li><li> Önceden ısıtılmış plaka üzerinde oyuk başına taban membran matrisi kript süspansiyonu 50 ul uygulanır. Yavaşça kuyunun ortasında bazal membran matris çıkarmak. </li><li> 20 dakika taban membran matrisi tam bir polimerizasyona olanak sağlamak için 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde 24 oyuklu plaka koyun. </li><li> (: 10 mM stoklar 1000 seyreltme 1), 10 uM-Y-27632 ile desteklenmiş tam insan minigut ortamının 500 ul bazal membran matrisi Bindirme. </li><li> 37 ° C,% 5 CO2 kuluçka makinesi içinde plaka inkübe edin. </li><li> 2 gün sonra,10 uM Y-27632 ile desteklenmiş taze tam bir insan minigut ortamı ile orta yerine (1: 1000 seyreltme, 10 mM stok). Bundan sonra, her gün taze olarak tam olan insan minigut ortamı ile orta yerine. </li></ol> Kültürlü Enteroids ve Colonoids 6. Donma NOT: Genellikle 2-3 cryovials içine bir kuyu dondurma. <ol><li> Tekrarlayın 5,1-5,8 adımları. </li><li> Soğuk dondurma ortamı ile pelletini. Transfer etiketli cryovial içine çözüm dondurma 1 ml. Izopropil alkol 500 ml ihtiva eden bir dondurma kap içinde dondurarak saklamaya uygun vialler yerleştirin. </li><li> Daha sonra sıvı azot depolama dondurarak saklamaya uygun vialler transferi, 24 saat süre ile 80 ° C&#39;de derin dondurucuda dondurma konteyneri aktarın. 1 yıla kadar Store Enteroids ve Colonoids: NOT. </li></ol>

<ol>
	<li>Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+development+and+differentiation.">Intestinal development and differentiation.</a> Exp Cell Res. 317 (19), 2702-2710 (2011).</li><li>Shroyer, N. F., Kocoshis, S., Hyams, J. R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pediatric Gastrointestinal and Liver Diseases. , 324-336 (2010).</li><li>Leushacke, M., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+the+intestinal+epithelium:+strategies+and+applications.">Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications.</a> Gut. , (2014).</li><li>Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+intestinal+epithelial+cell+differentiation.">In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation.</a> Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Mahe, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Gastrointestinal+Epithelial+Organoids.">Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 3, 217-240 (2013).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li><li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.">A nomenclature for intestinal in vitro cultures.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (12), G1359-G1363 (2012).</li><li>Ramalingam, S., Daughtridge, G. W., Johnston, M. J., Gracz, A. D., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+levels+of+Sox9+expression+mark+colon+epithelial+stem+cells+that+form+colonoids+in+culture.">Distinct levels of Sox9 expression mark colon epithelial stem cells that form colonoids in culture.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (1), G10-G20 (2012).</li><li>Furstenberg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+mouse+jejunal+epithelial+cells+with+CD24+yields+a+population+with+characteristics+of+intestinal+stem+cells.">Sorting mouse jejunal epithelial cells with CD24 yields a population with characteristics of intestinal stem cells.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (3), G409-G417 (2011).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Intestinal+Stem+Cells+Based+on+Surface+Marker+Combinations+and+Colony-Formation+Assay.">Isolation and Characterization of Intestinal Stem Cells Based on Surface Marker Combinations and Colony-Formation Assay.</a> Gastroenterology. , (2013).</li><li>Yan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+stem+cell+markers+Bmi1+and+Lgr5+identify+two+functionally+distinct+populations.">The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (2), 466-471 (2012).</li><li>Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dll1++secretory+progenitor+cells+revert+to+stem+cells+upon+crypt+damage.">Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.</a> Nat Cell Biol. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li><li>Yui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+engraftment+of+colon+epithelium+expanded+in+vitro+from+a+single+adult+Lgr5(+)+stem+cell.">Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell.</a> Nat Med. 18 (4), 618-623 (2012).</li><li>Durand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+intestinal+stem+cells+after+Paneth+cell+ablation+induced+by+the+loss+of+transcription+factor+Math1+(Atoh1).">Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (23), 8965-8970 (2012).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts.">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).</li><li>Akcora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CSF-1+receptor+fashions+the+intestinal+stem+cell+niche.">The CSF-1 receptor fashions the intestinal stem cell niche.</a> Stem Cell Res. 10 (2), 203-212 (2013).</li><li>Farin, H. F., Van Es, J. H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+sources+of+Wnt+regulate+intestinal+stem+cells+and+promote+formation+of+Paneth+cells.">Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).</li><li>Rothenberg, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cKit(+)+colonic+crypt+base+secretory+cell+that+supports+Lgr5(+)+stem+cells+in+mice.">Identification of a cKit(+) colonic crypt base secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice.</a> Gastroenterology. 142 (5), 1195-1205 (2012).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer's+patch+M+cells+derived+from+Lgr5(+)+stem+cells+require+SpiB+and+are+induced+by+RankL+in+cultured+'miniguts.">Peyer's patch M cells derived from Lgr5(+) stem cells require SpiB and are induced by RankL in cultured 'miniguts.</a> Mol Cell Biol. 32 (18), 3639-3647 (2012).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Jung, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+expansion+of+human+colonic+stem+cells.">Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells.</a> Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays.">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. , (2014).</li><li>Fuller, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+stem+cells+remain+viable+after+prolonged+tissue+storage.">Intestinal stem cells remain viable after prolonged tissue storage.</a> Cell Tissue Res. 354 (2), 441-450 (2013).</li><li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche.">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).</li><li>Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt5a+potentiates+TGF-beta+signaling+to+promote+colonic+crypt+regeneration+after+tissue+injury.">Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury.</a> Science. 338 (6103), 108-113 (2012).</li><li>Koo, B. K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+Marked+by+the+R-Spondin+Receptor+Lgr5.">Stem Cells Marked by the R-Spondin Receptor Lgr5.</a> Gastroenterology. , (2014).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors.">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 16-19 (2009).</li><li>Tojo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ALK-5+inhibitor+A-83-01+inhibits+Smad+signaling+and+epithelial-to-mesenchymal+transition+by+transforming+growth+factor-beta.">The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta.</a> Cancer Sci. 96 (11), 791-800 (2005).</li><li>Gafni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+novel+human+ground+state+naive+pluripotent+stem+cells.">Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells.</a> Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+CD24+and+CD44+mark+human+intestinal+epithelial+cell+populations+with+characteristics+of+active+and+facultative+stem+cells.">Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells.</a> Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Exp Biol Med (Maywood). , (2014).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Kovbasnjuk, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids:+preclinical+models+of+non-inflammatory+diarrhea.">Human enteroids: preclinical models of non-inflammatory diarrhea.</a> Stem Cell Res Ther. 4, S3 (2013).</li><li>Fujii, M., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+intestinal+stem+cells:+applications+for+colorectal+cancer+research.">Culturing intestinal stem cells: applications for colorectal cancer research.</a> Front Genet. 5, 169 (2014).</li><li>Koo, B. K., Sasselli, V., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+gene+expression+control+in+primary+organoid+cultures.">Retroviral gene expression control in primary organoid cultures.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 27 (Unit 5A), 6 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Bu yöntem bağırsak epitel biyoloji okumak için yararlı bir araç teşkil bağırsak epitel soyları ve epitel dinamikleri üreyen bir tam sistem sağlar. Burada sunulan yöntem, verimli insan enteroids ve colonoids sonuçlanır Sato ve Clevers 22 orijinal kemirgen çalışmanın uyarlanmıştır. Burada, biz elle herhangi bir hücresel kirletici önlemek için mikrodiseksiyon ile crypts aldı. Bu yöntem crypts doğrudan görselleştirme sağlar ve &quot;sallama&quot; orjinal kript toplama göre tutarlılık mesai yol açar. Diğer gruplar, özellikle kollajenaz 25 EDTA ile şelasyon değiştirilmesi biraz farklı yaklaşımlar kullanılarak benzer teknikleri geliştirdi. Kript toplama farklılıkları yanında, bu teknik kültür 22 insan enteroids büyümesi için gerekli olan belirli bir ortamı kullanmaktadır. Crypt tohumlama büyüme verimliliğini artırmak için, biz (CHIR99021) bir GSK3 inhibitörü ekleyinİlk iki gün 12. doku veya biyopsi işleme önemlidir ve kript izolasyon kısa sürede doku laboratuarda geldiğinde yapılmalıdır. Ancak gecikmiş kript izolasyonu ve kültürü, doku toplama sonrası 24 saate kadar gerçekleştirilebilir olabilir, daha önce sıçangil doku 26 için tarif edildiği gibi (veri gösterilmemiştir). bağırsak dokusu bütünüyle doku bozulmasını önlemek ve 4 ° C &#39;de muhafaza edilmesi gerekir DPBS ile doldurulmuş bir konik bir tüp içinde yerleştirilmelidir. gecikmeli hazırlık doku nakliye için izin verir, ancak sıcaklık değişimi taşıma sırasında kaçınılmalıdır. İlk kript kaplama için gerekli olan toplam zaman izole ve kript plaka doku ve sonra 1 saat ila 2 işlem 15-30 dakika ile yaklaşık 2 saattir. doku mikrodissek- temiz bir crypt hazırlık kritik belirleyicisi ve önermedir. Ancak, çeşitli protokoller anlatıldığı gibi el-sallayarak crypt serbest mümkündür 22,23. Kemirgen enteroid (enteroids) sistemi ile benzerliklere rağmen, insan enteroids geliştirmek ve zaman içinde kendi büyümesini sürdürmek için belirli molekülleri gerektirir. büyüme faktörleri, EGF, Noggin, R spondin sıçangil epitel organoids için benzer şekilde kullanılır. Bununla birlikte, Wnt-3A kullanılması önemlidir. Biz oluşumu yanı sıra büyüme verimliliği insan rekombinant protein daha Wnt-3A klimalı ortam kullanılarak büyük olduğunu kaydetti. Bağlantılı olarak, biz glikojen sentaz kinaz 3 (CHIR99021) 12 inhibitörü ile geliştirilmiş bir kültür koşulları gösterdi. Rekombinant büyüme faktörleri, Wnt-3A, R spondin ve Noggin, koşullu ortam tarafından değiştirilebilir. Wnt-3A-ifade eden L-hücre hattı (ATCC), ticari olarak temin edilebilir. Diğer gruplar, R-spondin 1 23,27, Noggin- 19 geliştirilmiştir ve Wnt-3A / R spondin3 / Noggin- 28, hücre soyunun ifade var. İki küçük molekül inhibitörleri kültüründe kullanılan Benidia ve kültür 29 bakım için gereklidir. A 83-01 büyüme faktörü β ve aktivin / Düğüm reseptörleri dönüştürme seçici bir önleyicisidir (aktivin-benzeri kinaz 4, 5, 7) ve SB202190, bir p38 mitojen ile aktive edilmiş protein kinaz inhibitörleri (MAPK) &#39;dir. Her iki inhibitörleri insan uyarılmış pluripotent kök hücreler kendini yenileme sürdürmek ve insan naif pluripotent kök hücreleri 30-32 kurmak için sırasıyla kullanılmıştır. Aynı zamanda, nikotinamid, nikotinamid adenin dinükleotidinin bir ön-madde, uzun vadeli bir şekilde 22,29 içinde enteroids ve colonoids genişleme sağlamak için gereklidir. O crypt hazırlık verim belirler gibi EDTA şelasyon önemli bir adımdır. Biz 2 mM EDTA tedavisi ile başarılı olmuştur. Bununla birlikte, EDTA konsantrasyonu doku tipine ilişkin 15 mM 2 mM&#39;den değiştirilebilir. Bu durumda, inkübasyon süresi deneysel olarak tespit edilmelidir. İlk kaplama sonra, crypt yuvarlak-u olacaks ve en sonunda enteroids oluşturur. Ancak, enteroids veya colonoids genellikle hiçbir farklılaşmış hücrelere çok az olan küreler oluşturarak bir &quot;kök&quot; fenotip göstermektedir. Bu durumda, farklılaşma, Wnt-3A, nikotinamid ve p38 MAPK inhibitörü çekilmesi ile başlatılabilir. Böyle DAPT veya DBZ gibi Notch inhibitörü kullanımı enteroids 22 içinde farklılaşma artırılması yardımcı olur. Bu model, özümseme ve salgı farklılaşmış soy hem de içeren bir kök hücre bölmesinden kaynaklanan sürekli kript-tomurcuklanan olaylar yanı sıra villus benzeri epitel etki ile bağırsak fizyolojisi tartışıldı. İlginçtir, bu sistem herhangi bir mezenkimal hücreler içeren ve niş sinyal gereksinimlerini karşılamak için özel ortam koşulları kullanır. Kemirgen modeli gibi, insan enteroids kök hücresi gibi işlev için, bu hücrelerin kapasitesini test etmek için izole edilen bağırsak epitelial hücreler elde edilebilir. Several çalışmalar kök özellikleri 12,23,33 hücrelerin zenginleştirilmesi için farklılaşma markörünü (CD44, CD24 veya CD166) ile EPHB2&#39;ye pozitif hücrelerin küme kullandık. Bununla birlikte, bu çalışmalar stemness test etmek için, insan enteroids kültürlerinin kullanımı ortaya koyan. Diğer araştırmacılar, bulaşıcı ishalli hastalıklar, kistik fibroz, ya da kolorektal kanserler 22,34-37 gibi bağırsak hastalıkları araştırmak için bu modeli kullanıyor. Bu çalışmalar, insan enteroids kişiselleştirilmiş tarama doğru taşımak için bir olasılık ile güvenilir bir insan hastalık modeli oluşturduğunu göstermektedir. İnsan enteroids genetik viral parçacıkların 38 DNA transfeksiyon ya da enfeksiyon ile değiştirilebilir. Bu insan epitel organoids veya doğru genetik mutasyonlar içinde gen-özel işlevlerini incelemek için güçlü bir araç sağlar. Son zamanlarda, Schwank ve arkadaşları CFTR gen neden ac üzerinde mutasyon CRISPR / Cas9 sistemi ile genomu düzenlemek ve düzeltmek imkanı gösterdiystic fibroz 24. İnsan enteroids bağırsak kök-hücre ve epitel mukozal biyoloji çalışma, normal ve anormal hem de gastrointestinal fizyoloji incelemek için yeni bir deneysel sistemi olarak hizmet için değerli bir sistem oluştururlar.

gastrointestinal astar epiteli sürekli yenilenmesi olduğunu. Bu süreç sürekli olarak devrediyor hızla bağırsak epitel yerine döl üreten bağırsak kök hücrelerin (ISCs) çoğalması ile tetiklenir. ISCs içeren proliferatif bölmesi kript alt sınırlıdır. ISCs sonunda emici ya da salgı soy içine ayırt döl verirler. Onlar lümen 1 içine pul pul dökülme önce yukarı doğru göç gibi crypt dışarı ve villus veya yüzey epiteli üzerine hareketli, hücreler giderek ayırt. ISCs enterocytes microfold hücreleri enteroendokrin hücreler, goblet hücreleri, püskül hücreleri ve Paneth hücreleri dahil olmak üzere tüm bağırsak epitel hücre türlerine neden olmaktadır. kolon dağınık enteroendokrin ve püskül hücreleri 2 çoğunlukla kolonisitler ve goblet hücre oluşan uzatılmış kriptler ile karakterizedir. Ex vivo culTure sistemleri ISC bakım ve bağırsak dokusu hemostazını çalışmak için umut verici bir araç oluşturmaktadır. Fizyolojik koşullar tamamen çoğaltılamaz ve epitel mikroçevresinin genellikle 3,4 değişmiş değil gibi Ancak, doku kültürü teknolojileri güvenmek zordur. ISC alanında büyük bir ilerleme sağlamak ve normal bağırsak niş sinyalleri yerine tanımlanan büyüme faktörleri kullanarak bireysel kemirgen ISCs genişletmek için doku kültürü teknikleri kurulması oldu. Uzun süreli bir kültür koşulları Sato ve diğerleri tarafından tarif edilmiştir., Burada tek bir kript veya intestinal epitelden izole kök hücreler birden fazla kript-benzeri bölgeler 5-7 de dahil olmak üzere 3 boyutlu epitel yapıların oluşturulması için büyür. Bu üç boyutlu yapılar sürekli genişletmek için fisyon olayları tabi. İlginç bir şekilde, kökenli dokuya özgü tüm bağırsak hücre tipleri üretilir ve aynı zamanda bir lümen 8 içine ekstrüde edilir. Bu sistemin modifikasyonlarını kullanılarak, epitelorganoids mide, ince bağırsak ve kolon elde edilebilir. Daha özel olarak ise, ince bağırsak epitel organoids enteroids 9, ve kolondan bu colonoids 9,10 bulunmaktadır. Bu epitel organoid kültür sistemleri Bu şekilde izole edilen hücreler 5,6,10-15 yorum &quot;stemness&quot; test, in vitro olarak, kök hücreler olarak işlev görme izole edilmiş tek hücrelerin kabiliyetini test etmek için kullanılmıştır. Diğer araştırmacılar bireysel epitel hücrelerinin 16-21 işlevini incelemek için enteroids ve colonoids hem kullanmışlardır. Böylece, enteroid ve colonoid kültürler hem kök ve dışı kök hücre fonksiyonlarını değerlendirmek ve bağırsakların içindeki temel hücresel etkileşimleri yeni bir fikir vermek için kullanılabilir. 2011, Şato ve arkadaşları, insan ince bağırsak ve kolon 22,23 türetilmiş epitelyal organoids uzun süreli bir kültür oluşturulur. Medyum kompozisyonu, insan epitel enteroids farklılıkları yanındave colonoids onların kemirgen meslektaşı ile aynı özelliklere sahip. Ayrıca, bu tür Barrett yemek borusu, adenom veya adenokarsinom, ve kistik fibroz 22,24 gibi hastalıklı dokulardan elde edilebilir. İnsan enteroids bağırsak kök-hücre ve epitel mukozal biyoloji çalışma, normal ve anormal hem de gastrointestinal fizyoloji 3 incelemek için yeni bir deneysel sistemi olarak hizmet için değerli bir sistem oluştururlar. Burada, insan ince bağırsak ve kolon kript (Şekil 1) gelen enteroids ve colonoids kurmak için yöntemleri tarif eder. Bu metodolojik derlemede, biz bütün doku ve biyopsi mahzendeyken koleksiyonu vurgulamak. Biz başarılı büyüme ve insan enteroids ve colonoids ve bu modele göre gerçekleştirilmiştir olası deneysel stratejiler bakımı için gerekli olan kültür yöntemleri özetlemek.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate buffered saline Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;free (DPBS)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP439-500</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Gzntamycin/Amphotericin B solution</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>R-015-10</td><td></td></tr><tr><td>Wnt-3A conditioned medium</td><td>in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (glutamine)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotidamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>human recombinant Noggin</td><td>R&amp;amp;D</td><td>6057-NG/CF</td><td></td></tr><tr><td>human recombinant R-Spondin</td><td>Preprotech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>human recombinant EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067-5MG</td><td></td></tr><tr><td>human [Leu]15-Gastrin 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145-.1MG</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>A13713-01</td><td></td></tr><tr><td>L Wnt-3A cell line</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>Renilla luciferase assay</td><td>Promega</td><td>E2710</td><td></td></tr><tr><td>human recombinant Wnt-3A</td><td>R&amp;amp;D</td><td>5036-WN/CF</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 TOPflash cell line</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Şekil 2D, bütün doku (Şekil 2D) taze izole edilmiş kript tipik bir örneğini gösterir. Bir biyopsisi ile izole edilen kript sayısı tüm dokularda olduğundan daha düşüktür. Iğne ile standart kapasite biyopsi forseps kullanarak, genellikle tek bir geçişte iki biyopsi ısırıkları gerçekleştirmek. Biyopsi başına 50-100 kript ortalama (Şekil 2F) 10 mm2 yüzeyde Biyopsi lokma sonuçlanır. Bazal membran matris içinde kültürden sonra, kriptler kolon için ince bağırsakta ve colonospheres için enterospheres oluşturmak kadar yuvarlak. Genellikle tomurcuklanma kript tohumlama sonra, 5-6 gün içinde ortaya çıkar. (; Movie 1 Şekil 3A-C) Ancak bazal membran matrisindeki küre oluşturan ya enteroids (enteroids) veya colonoids (colonoids) görmek için alışılmadık bir durum değildir. pasajı enteroids boyutuna bağlı olarak, 7 gün sonra yapılır. enteroids veya colonoids establbiyopsilerinden ished kültüründe aynı gelişmeyi tabi tutulur. Tohumlama ile kript yoğunluğu düşük olduğu, ancak, pasajı Kültürde çoğunlukla 10-12 gün sonra yapılır (Şekil 4a, b). Enteroids ve colonoids kültürler tekrarlanabilir bir şekilde genişletebilir. Her iki enteroids ve colonoids bir lümen tarafı sunmak ve bir epitel ile kaplı (Şekil 5A, B). Proliferatif hücreler enteroids içinde görülebilir ve tomurcuk ipuçları (Şekil 5C, D) içinde yer almaktadır. E-kadherin (ecad) ile boyanmıştır enteroids Konfokal görüntüleme epitel hücrelerini (Şekil 5E) görülmektedir. Enteroids ve colonoids Hem genetik / doğuştan bozuklukları olan hastalarda elde edilen dokudan kurulabilir. Şekil 6 nedeniyle epitel hücre reklamda doğuştan mutasyon kistik fibroz (Şekil 6A) ve bir tutam takma enteropati bir hastadan alınan artan temsili enteroids göstermektedirhezyon molekülü geni (EpCAM) (Şekil 6B). Genetik kusur yanında, enteroids bazal durumda farklılık göstermezler. <img alt="Şekil 1," src="/files/ftp_upload/52483/52483fig1highres.jpg" /> Kript ayrışma ve insan enteroids ve kültür colonoids nesil Şekil 1. İş Akışı. Crypts (insan küçük bağırsak ve kolonda) EDTA şelasyon ile izole edilmiştir. Kültürlü kriptler kolon için ince bağırsakta ve colonoids için enteroids oluşturur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52483/52483fig2highres.jpg" /> Crypt izolasyonu için Şekil 2. Diseksiyon işlemi. (A) ince bağırsak specimen gergin ve silikon kaplı Petri kabı içine düz bir tutturulmuş. (B), mukoza altında yatan alt mukozada ayrılır. (C) disseke mukoza gergin ve silikon kaplı Petri kabı içine düz bir tutturulmuş. EDTA şelasyon sonra (D) kript dokudan izole edilmiştir. (E) Bir biyopsi gergin ve silikon kaplı Petri kabı içine düz bir tutturulmuş. (F) EDTA şelasyon sonra, kriptler biyopsi izole edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52483/52483fig3highres.jpg" /> Şekil 3. Crypt kültürü ve bütün dokusundaki insan enteroid ve colonoid üretimi. (A), izole edildikten sonra taban membran matrisi kaplanmıştır jejunal kript. kriptler 3-4 saat sonra kapanış ve bu zamanın ötesine enterospheres oluşturmak üzere balon başlar edilmektedir. 7 gün sonra, ince barsak enteroids oluşturulur. Izolasyon ve kültür sonra (B), ileal kriptler jejunum kriptlerde gibi davranır ve ileal enteroids oluştururlar. (C) Kolon kript izolasyonundan sonra bazal membran matris içinde kaplanır. 7 gün (Ölçek çubukları: 100 mikron) sonra kriptler yakın ve form colonoids. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52483/52483fig4highres.jpg" /> Biyopsi gelen Şekil 4. Crypt kültürü ve insan enteroid ve colonoid nesil. (A) izolasyondan sonra bazal membran matris içinde kaplı duodenal kriptler. kriptler 4 saat 3 ila sonra kapanış ve Beyo kadar balon başlatmak edilirnd bu kez enterospheres oluşturulur. 7 gün sonra, enteroids oluşturulur. (B) izole edilmesi ve kültürün ardından, kolon kript bazal membran matris içinde kaplanır. .: kriptler sonra 7 gün (100 mikron Ölçek çubukları) sonra colonoids colonospheres oluşturmak kadar yakın <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig4large.jpg" target="_blank">bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52483/52483fig5highres.jpg" /> Kültür içinde 6 günden sonra, Şekil 5, insan enteroids Bağırsak soyları (A). İnsan enteroid. (B) (A) astar epitelyum göstermek içinde enteroids arasında Hematoksilen-eozin bölümleri (Ölçek çubukları: 100 mikron). (CD) edu boyama (kırmızı) sonra enteroids Konfokal görüntüleme proliferatif hücrelerin varlığını gösterir. (E </strepitel hücreleri (ECAD, yeşil) (Ölçek çubuğu için E-kaderin: ong&gt;) enteroids Konfokal görüntüleme varlığını göstermektedir. 50 mikron) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52483/52483fig6highres.jpg" /> Hastalıklı dokudan Şekil 6. Crypt kültürü ve insan enteroid üretimi. (A), kistik fibroz örnekten kurulmuş Enteroids. (B) Enteroids doğuştan tufting enteropatisi örneğinden kurulan (Ölçek çubukları: 100 mikron). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Film 1. Enterosphere kültüründe insan enteroid oluşturan. 32 saat zaman turE film kültüründe bir enteroid oluşturmak için retracting insan ince bağırsaktan kurulmuş bir enterosphere gösterir. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/Movie1_v2.mp4" target="_blank">Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Çözücü </td><td> Hazır Konsantrasyon </td><td> Nihai Konsantrasyon </td><td> Yorum </td></tr><tr><td> Dulbecco Fosfat tuzlu Ca 2+, Mg 2+ ücretsiz (DPBS) tamponlu </td><td> Hayat teknolojileri; Gıbco </td><td> 14190-144 </td><td> - </td><td> - </td><td> 1x </td><td></td></tr><tr><td> Etilendiamin tetraasetik asit (EDTA), </td><td> Sigma-AIdrich </td><td> 431.788 </td><td> Ultrasaf dH 2 O </td><tD&gt; 0.5 M </td><td> 2 mM </td><td></td></tr><tr><td> Sorbitol </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP439-500 </td><td> DPBS </td><td> Toz </td><td> % 2 </td><td></td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP220-1 </td><td> DPBS </td><td> Toz </td><td> % 1 </td><td></td></tr><tr><td> Sığır serum albümini (BSA) Fraksiyon V </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td> DPBS </td><td> Toz </td><td> % 1 </td><td></td></tr><tr><td> Gzntamycin / Amfoterisin B çözeltisi </td><td> Hayat teknolojileri; Gıbco </td><td> R 015-10 </td><td> - </td><td> 500x </td><td> 1x </td><td></td></tr><tr><td> Wnt-3A orta conditionned </td><td> evde </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> Gelişmiş DMEM / F12 </td><td> Hayat teknolojileri; Gıbco </td><td> 12634-028 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Hayat teknolojileri; Gıbco </td><td> 15630-080 </td><td> - </td><td> 1M </td><td> 10 mM </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX (glutamin) </td><td> Hayat teknolojileri; Gıbco </td><td> 35050-061 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin (10,000 U / mL) </td><td> Hayat teknolojileri; Gıbco </td><td> 15140-148 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> N2 Ek </td><td> Hayat teknolojileri; Gıbco </td><td> 17502-048 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> B27 Ek </td><td> Hayat teknolojileri; Gıbco </td><td> 17504-044 </td><td> - </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> N-Asetilsistein </td><td> Sigma-AIdrich </td><td> A9165-5G </td><td> DPBS </td><td> 1M </td><td> 1 mM </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Nicotidamide </td><td> Sigma-AIdrich </td><td> N0636 </td><td> DPBS </td><td> 1M </td><td> 10 mM </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel, GFH, Fenol ücretsiz (bazal membran matris) </td><td> Corning </td><td> 356.231 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> GEREKLİ </td></tr><tr><td> İnsan yeniden birleştirici Noggin </td><td> Ar-Ge </td><td> 6057-NG / CF </td><td> DPBS </td><td> 100 ug / ml </td><td> 100 ng / ml </td><td rowspan="3"> Diğer tedarikçiler: Ar-Ge; AnaSpec ve Preprotech </td></tr><tr><td> İnsan yeniden birleştirici R Spondin </td><td> Preprotech </td><td> 120-38 </td><td> DPBS </td><td> 1 mg / ml </td><td> 1 ug / ml </td></tr><tr><td> İnsan yeniden birleştirici EGF </td><td> Sigma-AIdrich </td><td> E9644-.2MG </td><td> HAA </td><td> 500 ug / ml </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td> Y-27632 </td><td> Sigma-AIdrich </td><td> Y0503-1MG </td><td> DPBS </td><td> 10 mM </td><td> 10 uM </td><td></td></tr><tr><td> A-83-01 </td><td> Tocris </td><td> 2939 </td><td> DMSO </td><td> 500 uM </td><td> 500 nM </td><td></td></tr><tr><td> SB202190 </td><td> Sigma-AIdrich </td><td> S7067-5MG </td><td> DMSO </td><td> 30 mM </td><td> 10 uM </td><td></td></tr><tr><td> İnsan [Leu] 15-gastrin 1 </td><td> Sigma-AIdrich </td><td> G9145-.1MG </td><td> DPBS </td><td> 100 uM </td><td> 10 nM </td><td></td></tr><tr><td> CHIR99021 </td><td> Stemgent </td><td> 04-0004 </td><td> DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 2.5 uM </td><td></td></tr><tr><td> Thiazovivin </td><td> Stemgent </td><td> 04-0017 </td><td> DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 2.5 uM </td><td></td></tr><tr><td> TrypLE Hızlı Enzim (1X), fenol kırmızısı (hücre ayrışma enzim) </td><td> Hayat teknolojileri; Gıbco </td><td> 12605-010 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Geçirilmesi için </td></tr><tr><td> Fetal Sığır Serumu </td><td> Hayat teknolojileri; Gıbco </td><td> 10082-147 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Geçirilmesi için </td></tr><tr><td> CTS Synth-a-Freeze Orta (donma orta) </td><td> Hayat teknolojileri; Gıbco </td><td> A13713-01 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Donma için </td></tr><tr><td> L Wnt-3A hücre hattı </td><td> ATCC </td><td> CRL-2647 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Wnt-3A medya üretimini conditionned </td></tr><tr><td> Renilla lusiferaz deneyi </td><td> Promega </td><td> E2710 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Wnt-3A ortam etkinliğini conditionned </td></tr><tr><td> İnsan yeniden birleştirici Wnt-3A </td><td> Ar-Ge </td><td> 5036-WN / CF </td><td> DPBS </td><td> 100 ug / ml </td><td> 100 ng / ml </td><td&gt; Wnt-3A conditionned medya etkinliği </td></tr><tr><td> HEK293 TOPflash, hücre çizgisi </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Wnt-3A ortam etkinliğini conditionned; Hans Clevers laboratuvar Hediye </td></tr></tbody></table> Tercih üretici ve katalog numarası ile Tablo 1. Detaylı reaktif listesi. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Ekipman </td><td> Tüketilir </td><td> Araçlar </td></tr><tr><td> Laminer akış kaputu </td><td> 15 ve 50 ml konik tüp </td><td> Dumont # 5 standart forseps (FST; # 11251-20) </td></tr><tr><td> CO 2 İnkübatör </td><td> Mikrofüj tüplerine </td><td> Dumont 7., kavisli ince forseps (FST; # 11274-20) </td></tr><tr><td> Stereo mikroskop </td><td> 24 oyuklu plakalar </td><td> İnce makaslar (FST; # 14060-09) </td></tr><tr&gt; <td> Santrifüj </td><td> 0.22 mikron filtreler (Sartorius) </td><td> Vannas yaylı makas (FST; # 15018-10) </td></tr><tr><td> Orbital çalkalayıcı </td><td> Serolojik pipetler </td><td> 0.2 mm çapında minutien pim (FST; # 26002-20) </td></tr><tr><td> Donma kap (Nalgene) </td><td> Mikropipet ipuçları </td><td> 0.1 mm çapında minutien pimleri (FST; # 26002-10) </td></tr><tr><td> Sylgard 184 Silikon (Dow Corning) </td><td> 150 mikron örgü açıklıklar, naylon tarama (Dinamik Aqua-arz) </td><td></td></tr><tr><td> Cam petri </td><td> 5 ml&#39;lik yuvarlak dipli bir polipropilen tüpler (Falcon) </td><td></td></tr><tr><td> Serolojik pipet </td><td> 18G künt dolgu iğnesi (BD) </td><td></td></tr><tr><td> Mikropipet </td><td> Luer-Lock ipuçları 3 ml&#39;lik lsyringes (BD) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Cryovials </td><td></td></tr></tbody></table><scrypt izolasyonu ve kültürü için gerekli trong&gt; Tablo 2. Ayrıntılı sarf malzemeleri, araçları, ekipmanları ve.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy at JoVE.com

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Tüm Doku ve Biyopsi İnsan Epitelyal Enteroids ve Colonoids kurulması

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

establishment-human-epithelial-enteroids-colonoids-from-whole-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

34.7K Görüntüleme.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Video: Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted in sophisticated in vitro models of the intestinal mucosa. Leveraging these emerging model systems will require adaptation of tools and techniques developed for 2D culture systems and animals. Here, we describe a technique for measuring epithelial barrier permeability in human intestinal organoids in real-time. This is accomplished by microinjection of fluorescently-labeled dextran and imaging on an inverted microscope fitted with epifluorescent filters. Real-time measurement of the barrier permeability in intestinal organoids facilitates the generation of high-resolution temporal data in human intestinal epithelial tissue, although this technique can also be applied to fixed timepoint imaging approaches. This protocol is readily adaptable for the measurement of epithelial barrier permeability following exposure to pharmacologic agents, bacterial products or toxins, or live microorganisms. With minor modifications, this protocol can also serve as a general primer on microinjection of intestinal organoids and users may choose to supplement this protocol with additional or alternative downstream applications following microinjection.

This protocol describes the measurement of epithelial barrier permeability in real-time following pharmacologic treatment in human intestinal organoids using fluorescent microscopy and live cell microscopy.

Gerçek zamanlı insan bağırsak Organoids epitel bariyer geçirgenliği ölçümü

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Gelişim Biyolojisi

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human intestinal epithelium, leading to increased intestinal permeability, impaired restitution, and increased cell death. Although there are numerous animal models of NEC, response to injury and therapeutic interventions may be highly variable between species. Furthermore, it is ethically challenging to study disease pathophysiology or novel therapeutic agents directly in human subjects, especially children. Therefore, it is highly desirable to develop a novel model of NEC using human tissue. Enteroids are 3-dimensional organoids derived from intestinal epithelial cells. They are ideal for the study of complex physiologic interactions, cell signaling, and host-pathogen defense. In this manuscript we describe a protocol that cultures human enteroids after isolating intestinal stem cells from patients undergoing bowel resection. The crypt cells are cultured in media containing growth factors that encourage differentiation into the various cell types native of the human intestinal epithelium. These cells are grown in a synthetic, collagenous mix of proteins that serve as a scaffold, mimicking the extra-cellular basement membrane. As a result, enteroids develop apical-basolateral polarity. Co-administration of lipopolysaccharide (LPS) in media causes an inflammatory response in the enteroids, leading to histologic, genetic, and protein expression alterations similar to those seen in human NEC. An experimental model of NEC using human tissue may provide a more accurate platform for drug and treatment testing prior to human trials, as we strive to identify a cure for this disease.

Enteroids are emerging as a novel model in the study of human disease. The protocol describes how to simulate an enteroid model of human necrotizing enterocolitis using lipopolysaccharide (LPS) treatment of enteroids generated from neonatal tissue. Collected enteroids demonstrate inflammatory changes akin to those seen in human necrotizing enterocolitis.

Bir roman insan epitel Enteroid nekrotizan enterokolit modeli

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Patojenler, Commensals ve ana bilgisayar bağırsak epitel arasındaki etkileşimler çalışmaya insan Colonoid Monolayers

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have recently emerged as a promising system to model gastrointestinal pathologies. However, currently utilized methods for enteroid manipulation either lack access to the apical surface of the epithelium (three-dimensional [3D]) or are time-consuming and resource-intensive (two-dimensional [2D] monolayers). These methods often require additional steps, such as microinjection, for the model to become physiologically translatable. Here, we describe a physiologically relevant and inexpensive protocol for studying NEC in vitro by reversing enteroid polarity, resulting in the apical surface facing outward (apical-out). An immunofluorescent staining protocol to examine enteroid barrier integrity and junctional protein expression following exposure to tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) or lipopolysaccharide (LPS) under normoxic or hypoxic conditions is also provided. The viability of 3D apical-out enteroids exposed to normoxic or hypoxic LPS or TNF-&#945; for 24 h is also evaluated. Enteroids exposed to either LPS or TNF-&#945;, in combination with hypoxia, exhibited disruption of epithelial architecture, a loss of adherens junction protein expression, and a reduction in cell viability. This protocol describes a new apical-out NEC-in-a-dish model which presents a physiologically relevant and cost-effective platform to identify potential epithelial targets for NEC therapies and study the preterm intestinal response to therapeutics.

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

This protocol describes an apical-out necrotizing enterocolitis (NEC)-in-a-dish model utilizing small intestinal enteroids with reversed polarity, allowing access to the apical surface. We provide an immunofluorescent staining protocol to detect NEC-related epithelial disruption and a method to determine the viability of apical-out enteroids subjected to the NEC-in-a-dish protocol.

İn Vitro Nekrotizan Enterokolitin Apikal-Out Enteroid Modeli

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Tıp

Testing Epithelial Permeability in Fetal Tissue-Derived Enteroids

Human fetal tissue-derived enteroids are emerging as a promising in vitro model to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids exhibit polarity, consisting of a lumen with an apical border, tight junctions, and a basolateral outer layer exposed to growth media. The consequences of intestinal injuries include mucosal inflammation and increased permeability. Testing intestinal permeability in vulnerable preterm human subjects is often not feasible. Thus, an in vitro fetal tissue-derived intestinal model is needed to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids can be used to test changes in epithelial permeability regulated by tight junction proteins. In enteroids, intestinal stem cells differentiate into all epithelial cell types and form a three-dimensional structure on a basement membrane matrix secreted by mouse sarcoma cells. In this article, we describe the methods used for establishing enteroids from fetal intestinal tissue, characterizing the enteroid tight junction proteins with immunofluorescent imaging, and testing epithelial permeability. As gram-negative dominant bacterial dysbiosis is a known risk factor for intestinal injury, we used lipopolysaccharide (LPS), an endotoxin produced by gram-negative bacteria, to induce permeability in the enteroids. Fluorescein-labeled dextran was microinjected into the enteroid lumen, and serial dextran concentrations leaked into the culture media were measured to quantify the changes in paracellular permeability. The experiment showed that apical exposure to LPS induces epithelial permeability in a concentration-dependent manner. These findings support the hypothesis that gram-negative dominant dysbiosis contributes to the mechanism of intestinal injury in preterm infants.

This protocol details the establishment of enteroids, a three-dimensional intestinal model, from fetal intestinal tissue. Immunofluorescent imaging of epithelial biomarkers was used for model characterization. Apical exposure of lipopolysaccharides, a bacterial endotoxin, using microinjection technique induced epithelial permeability in a dose-dependent manner measured by the leakage of fluorescent dextran.

Fetal Doku Kaynaklı Enteroidlerde Epitel Geçirgenliğinin Test Edilmesi

Human fetal tissue-derived enteroids are emerging as a promising in vitro model to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids exhibit ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

Organoid Kaynaklı Epitel Tek Katmanlı: Bağırsak Bariyer Fonksiyonu için Klinik Olarak İlgili Bir In Vitro Model

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Biyoloji

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

Bağırsak Mezarlarından Murine Primer Kolon Epitel Monolayerlerinin Üretimi

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

Bağırsak Organoid Modellerini Kullanarak Apikal Spesifik Etkileşimleri İncelemek için Kültür Yöntemleri

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Generation and Characterization of Murine Oral Mucosal Organoid Cultures

The mucous lining covering the inside of our mouth, the oral mucosa, is a highly compartmentalized tissue and can be subdivided into the buccal mucosa, gingiva, lips, palate, and tongue. Its uppermost layer, the oral epithelium, is maintained by adult stem cells throughout life. Proliferation and differentiation of adult epithelial stem cells have been intensively studied using in vivo mouse models as well as two-dimensional (2D) feeder-cell based in vitro models. Complementary to these methods is organoid technology, where adult stem cells are embedded into an extracellular matrix (ECM)-rich hydrogel and provided with a culture medium containing a defined cocktail of growth factors. Under these conditions, adult stem cells proliferate and spontaneously form three-dimensional (3D) cell clusters, the so-called organoids. Organoid cultures were initially established from murine small intestinal epithelial stem cells. However, the method has since been adapted for other epithelial stem cell types. Here, we describe a protocol for the generation and characterization of murine oral mucosal organoid cultures. Primary epithelial cells are isolated from murine tongue tissue, embedded into an ECM hydrogel, and cultured in a medium containing: epidermal growth factor (EGF), R-spondin, and fibroblast growth factor (FGF) 10. Within 7 to 14 days of initial seeding, the resulting organoids can be passaged for further expansion and cryopreservation. We additionally present strategies for the characterization of established organoid cultures via 3D whole-mount imaging and gene-expression analysis. This protocol may serve as a tool to investigate oral epithelial stem cell behavior ex vivo in a reductionist manner.

We present a method for the generation and characterization of oral mucosal organoid cultures derived from the tongue epithelium of adult mice.

The mucous lining covering the inside of our mouth, the oral mucosa, is a highly compartmentalized tissue and can be subdivided into the buccal mucosa, ...