We gratefully acknowledge Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands) for the kind gift of TOPflash cells.
This project was supported in part by NIH-R01DK083325 (MAH); NIH P30 DK078392 (Digestive Health Center); NIH UL1RR026314 (CTSA).

הצהרת אתיקה:: הערה כל הניסויים באמצעות רקמות אנושיות המתוארות במסמך זה אושר על ידי IRB בCCHMC (IRB # 2012-2858; # 2,014-0,427). הסכמה מדעת לאיסוף רקמות, אחסון, ושימוש בדגימות התקבלה מהתורמים בCCHMC. 1. הכנה לתרבות הערה: כל חומרים כימיים מפורטים בטבלה 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות EDTA כדלקמן: להכין 0.5 חומצת ethylenediaminetetraacetic M, pH 8 (EDTA) בH 2 O ultrapure, המסנן מעוקר עם 0.22 מיקרומטר סינון. לחלופין, לאחסן פתרון מניות EDTA בRT ללא הגבלת זמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן חיץ chelating כדלקמן: לערבב סורביטול 2%, סוכרוז 1%, 1% V חלק אלבומין בסרום שור (BSA) ו1x גנטמיצין / פתרון Amphotericin בפוספט של Dulbecco שנאגרו מלוח ללא Ca 2 + ו Mg 2 + (DPBS), מסנן מעוקר עם 0.22 מיקרומטר סינון. הכן את buf chelatingטרי fer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן Wnt-3A מיזוג בינוני כדלקמן: בינוני מזגן Wnt-3A הוא עשה בבית באמצעות שורת תאי L Wnt-3A על פי הוראות היצרן (ATCC, CRL-2647). להשלים בינוני עם 2 גלוטמין מ&quot;מ, 10 מ&quot;מ HEPES, 100 U / ml פניצילין, 100 ג &#39;/ מיליליטר סטרפטומיצין, 1 מוסף N2, תוספת 1 B27, BSA 1% ומסנן מעוקרים עם מסנן 0.22 מיקרומטר. הערה: מבחן כל אצווה לפעילות Wnt באמצעות assay TOPflash. השתמש בשורת תאי HEK293 TOPflash יציבה (מעבדה הנס Clevers) עם ערכת assay בלוציפראז Renilla לפי הוראות היצרן. לנרמל את assay TOPflash עם 100 ng / Wnt-3A רקומביננטי האנושי מיליליטר. אשר לפחות פעילות מתקפל שינוי 10 של התקשורת המותנה בהשוואה לשליטה. לחלק בינוני מזגן Wnt-3A טרי לתוך 10 aliquots מיליליטר ב 15 מיליליטר צינורות והקפאת חרוטי ב -20 ° C עד 6 חודשים. חנות מופשרת aliquots עד 5 ימים על 4 מעלות צלזיוס ללא הפסד של פעילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prepare בינוני minigut אדם כדלקמן: תוספת מתקדם DMEM F12 בינוני / עם 2 גלוטמין מ&quot;מ, 10 מ&quot;מ HEPES, פניצילין 100 U / mL, 100 גר &#39;/ סטרפטומיצין מ&quot;ל, תוספת 1 N2, תוספת 1 B27, BSA 1% ומסנן מעוקר עם 0.22 מסנן מיקרומטר. הערה: חלק בינוניים minigut אנושי טרי לתוך 10 aliquots מיליליטר ב 15 מיליליטר צינורות והקפאת חרוטי ב -20 ° C עד 3 חודשים. חנות מופשרת aliquots עד 5 ימים על 4 מעלות צלזיוס ללא הפסד של פעילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בינוני minigut אדם שלם כדלקמן: הכן טרי לפני תרבות קריפטה או בינוני minigut האנושי שינוי בינוני (ראה 1.4) בתוספת 50% בינוניים Wnt-ממוזג 3A (ראו 1.3), 1 מיקרוגרם / מיליליטר R-spondin 1 (1: 1000 דילול של 1 מ&quot;ג / מיליליטר מניות), 100 מיליליטר Noggin / ng (1: 1,000 דילול של 100 ג &#39;/ מ&quot;ל ​​מניות), 50 ng / mL EGF (1: 10,000 דילול של 500 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​מניות), 500 ננומטר-83 -01 (1: 1,000 דילול של 500 M מלאי), 10 מיקרומטר SB202190 (1: 3,000 דילול של 30 מניות מ&quot;מ), 10 ננומטר [Leu] 15-Gastrin 1 (דילול 1: 10,000 של 100 מיקרומטרהמניה), 10 מ&quot;מ Nicotinamide (1: מניית 100 דילול של 1 M) ו -1 מ&quot;מ N-acetylcysteine ​​(1: 1,000 דילול של מניות 1 M). הערה: תקשורת חנות מלאה אדם minigut עד 2 ימים בC ° 4 ללא הפסד של פעילות. </li></ol> 2. בידוד קריפטה משלמות רקמות הערה: מתוך אוסף הרקמות, זה חיוני כדי לשמור על המדגם במלח. מומלץ לשמור על הרקמה על קרח במהלך הובלה. הכנת המדגם לבידודה של קריפטה צריכה להתבצע בהקדם האפשרי. הערה: כל המגיבים רשומים בטבלה 1, כלים, ציוד, וחומרים המפורטים בטבלה 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כל חומרים כימיים לפני תחילת הניסוי. להפשיר את מטריצת קרום במרתף על קרח ומראש דגירה צלחת 24 גם בחממה CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. הערה: לחלופין לעשות שכבה דקה של מטריצת קרום במרתף באמצעות 15 μl / גם במרכז 24צלחת &quot;טוב ולמקם אותו בחממה CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. צעד פקולטטיביים זה שומר את מטריצת הקרום במרתף כמו ירידה בפילמור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרקמה עם קרח קר פוספט של Dulbecco שנאגרו מלוח ללא Ca 2 + ו Mg 2 + (DPBS). המשך עד התוכן של DPBS ברור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 0.2 מ&quot;מ סיכות קוטר minutien, לאבטח את הרקמה על צלחת פטרי מצופי סיליקון זכוכית מלאה DPBS קר כקרח. למתוח ולהצמיד הרקמה שטוחה עם הצד הרירי פונה כלפי מעלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, להסיר את הרירית שמעליה מsubmucosa ורקמת חיבור באמצעות מספריים מיקרו לנתח ומלקחיים מעוקלים נקודה עדינה (איור 2 א, ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למתוח ולהצמיד גזור רירית שטוחה בצלחת פטרי מזכוכית מצופה סיליקון עם הצד הרירי פונה כלפי מעלה. Submucosa שנותר ורקמת חיבור יכולים להיות מושלך או המשמשים לניסויים נוספים (איור 2 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינותלגרד את פני השטח של הרירית עם מלקחיים מעוקלים. צעד זה הוא הכרחי כדי לשפר את האיכות של התכשיר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעי דק, בעדינות לגרד את הרירית להסיר את villi. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למעי גס, בעדינות לגרד את הרירית להסיר רירי ופסולת. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרירית 3-4 פעמים עם חיץ קלאציה קר כקרח כדי להסיר villi ופסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הרירית עם חיץ מוכן טרי 2 המ&quot;מ EDTA קלאציה (200 μl 0.5 M EDTA ב49.6 מיליליטר חיץ קלאציה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת פטרי על קרח וללחוץ בעדינות במשך 30 דקות על שייקר מסלולית אופקית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הרקמה 3-4 פעמים עם חיץ קלאציה קר כקרח ללא EDTA. לאחר כביסה, לעזוב את הרירית במאגר קלאציה קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את הרירית תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות מלקחיים מעוקלים ודקים. בעדינות לגרד את הרירית לשחרר מאורות מעיים באמצעות המלקחיים המעוקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא בעדינות את ההשעיה קריפטה מצלחת פטרי באמצעות pipette ולהעביר אותו לתוך צינור חרוטי 50 מיליליטר. הערה: לבדוק את הרקמות כדי לוודא שכמעט כל מאורות הוסרו מהרירית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה מאורות דרך 150 מיקרומטר רשת 2 פעמים. הערה: לבדוק את הזרימה דרך להעשרת קריפטה תחת מיקרוסקופ (איור 2 ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דקות השעיה 5 קריפטה ב 50 XG, 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב 5 מיליליטר חיץ קלאציה קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לספור את מספר מאורות לירידה של 10-μl מההשעיה מהצעד 2.15. העבר את מספר מאורות הדרושים לציפוי ל5 מיליליטר צינור מסביב לתחתית. השתמש 200 עד 500 מאורות לכל טוב של צלחת 24 גם להקים enteroids או colonoids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה חלק קריפטה במשך 10 דקות ב 150 גרם, 4 ° C. הסר את supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מאורות לתרבות שלאחר מכן. </li></ol> 3. בידוד קריפטה מביופסיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כל חומרים כימיים לפניתחילת הניסוי. להפשיר את מטריצת קרום במרתף על קרח ומראש דגירה צלחת 24 גם בחממה CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הביופסיה עם קרח קר פוספט של Dulbecco שנאגרו מלוח ללא Ca 2 + ו Mg 2 + (DPBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות 0.1 מ&quot;מ סיכות קוטר minutien, לאבטח את הביופסיה בצלחת פטרי מצופי סיליקון זכוכית מלאה DPBS קר כקרח. למתוח ולהצמיד את הרירית שטוחה עם הצד הרירי פונה כלפי מעלה (איור 2E). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לגרד את פני השטח של הרירית עם מלקחיים מעוקלים כדי להסיר villi ופסולת. צעד זה הוא הכרחי כדי לשפר את האיכות של התכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הביופסיה 3-4 פעמים עם חיץ קלאציה קר כקרח כדי להסיר villi ופסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסה את הביופסיה עם חיץ מוכן טרי 2 המ&quot;מ EDTA קלאציה (200 μl 0.5 M EDTA ב49.8 מיליליטר חיץ קלאציה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת פטרי על קרח וללחוץ בעדינות במשך 30 דקות על שייקר מסלולית אופקית. </li> &lt;li&gt; לשטוף את הביופסיה 3-4 פעמים עם חיץ קלאציה קר כקרח ללא EDTA. לאחר כביסה, לעזוב את הביופסיה במאגר קלאציה קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את הביופסיה תחת מיקרוסקופ לנתח באמצעות מלקחיים מעוקלים ודקים. בעדינות לגרד את הרירית כדי לשחרר את מאורות מעיים באמצעות מלקחיים מעוקלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא בעדינות את ההשעיה קריפטה מצלחת פטרי בעזרת פיפטה ולהעביר אותו לצינור חרוטי 50 מיליליטר. הערה: לבדוק את הרקמות כדי לוודא שכמעט כל מאורות הוסרו מהרירית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את ההשעיה קריפטה דרך ניילון 150 מיקרומטר רשת 2 פעמים. הערה: לבדוק את הזרימה דרך להעשרת קריפטה תחת מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דקות השעיה 5 קריפטה ב 50 XG, 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה במאגר קלאציה קר כקרח 1 מיליליטר. מעביר את ההשעיה קריפטה לצינור 1.5 מיליליטר microfuge. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה חלק קריפטה במשך 10 דקות ב 150 XG, 4 ° C. הסר את supernatant. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש מאורות לתרבות שלאחר מכן. </li></ol> 4. קריפטה תרבות בממברנה מטריקס מרתף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת הטיפים pipet מראש צונן, resuspend גלולה קריפטה (משלב 2.18 או 3.15) במטריצת קרום במרתף (200 עד 500 מאורות / מטריצת קרום במרתף 50 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 50 μl של ההשעיה קריפטה במטריצת קרום במרתף לכל גם על הצלחת המחוממת מראש. לאט לאט להוציא את מטריצת קרום במרתף במרכז הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת 24 גם ב37 ° C, חממה 5% CO 2 למשך 30 דקות כדי לאפשר פילמור של מטריצת הקרום במרתף מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי מטריצת הקרום במרתף עם 500 μl של מדיום minigut האנושי מלא בתוספת 2.5 מיקרומטר CHIR99021 (1: 4,000 דילול של 10 מניות מ&quot;מ) ו -2.5 מיקרומטר Thiazovivin (1: 4,000 דילול של 10 מניות מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת ב37 ° C, חממה 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את המדיום עם הומא מלא טריn minigut בינוני כל 2 ימים. </li></ol> 5. Passaging של התרבית Enteroids וColonoids. הערה: מעבר Enteroids וColonoids כל 7 עד 10 ימים לאחר ציפוי ראשוני. בדרך כלל, לפצל אחד גם לתוך 3-4 בארות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את כל חומרים כימיים לפני תחילת הניסוי. להפשיר את מטריצת קרום במרתף על קרח ומראש דגירה צלחת 24 גם בחממה CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה באמצעות טיפים וכיסוי סטרילי עם 1 מיליליטר של DPBS קר כקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה הלוך ושוב עם קצה 1,000 μl. מעביר את הפתרון בצינור חרוטי 15 מיליליטר חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של מדיום minigut אדם בתוספת 5% FBS לכל 1 מיליליטר של מדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הפתרון במשך 5 דקות ב 50 XG, 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה עם 2 מיליליטר של אנזים התא דיסוציאציה בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 (דילול 1: 1000 של 10 מניות מ&quot;מ). דגירה של 5 מ &#39;בשעת 37 ° C במי אמבטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את גושי תאים באמצעות מזרק 3 מיליליטר luer נעילה מצויד במילוי / מחט קהה 18-G. בעדינות פיפטה הפתרון קדימה ואחורה באמצעות המזרק 10 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ההשעיה למשך 5 דקות ב 500 XG, 4 מעלות צלזיוס. בטל supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת הטיפים pipet מראש צונן, resuspend התא גלולה במטריצת קרום במרתף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל 50 μl של ההשעיה קריפטה במטריצת קרום במרתף לכל גם על הצלחת המחוממת מראש. לאט לאט להוציא את מטריצת קרום במרתף במרכז הבאר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת 24 גם ב37 ° C, חממה 5% CO 2 במשך 20 דקות, כדי לאפשר פילמור של מטריצת הקרום במרתף מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסוי מטריצת הקרום במרתף עם 500 μl של מדיום minigut האנושי מלא בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 (דילול 1: 1000 של 10 מניות מ&quot;מ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת ב37 ° C, חממה 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 2 ימים, להחליף בינוני עם בינוני minigut אדם שלם טרי בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632 (1: 1,000 דילול של 10 מניות מ&quot;מ). לאחר מכן, להחליף בינוני עם בינוני טרי, מלא minigut אדם בכל יום אחר. </li></ol> 6. ההקפאה המתורבתת Enteroids וColonoids הערה: בדרך כלל להקפיא גם אחד ל2-3 cryovials. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 5.1-5.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה עם מדיום הקפאה קר. העברה 1 מיליליטר של הקפאת פתרון לכותרת cryovial. הנח את cryovial במכל הקפאה המכיל 500 מיליליטר של אלכוהול איזופרופיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את מיכל ההקפאה במקפיא C ° 80 במשך 24 שעות, ולאחר מכן להעביר cryovial לאחסון חנקן נוזלי. הערה: Enteroids החנות וColonoids עד 1 שנה. </li></ol>

<ol>
	<li>Noah, T. K., Donahue, B., Shroyer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+development+and+differentiation.">Intestinal development and differentiation.</a> Exp Cell Res. 317 (19), 2702-2710 (2011).</li><li>Shroyer, N. F., Kocoshis, S., Hyams, J. R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pediatric Gastrointestinal and Liver Diseases. , 324-336 (2010).</li><li>Leushacke, M., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+the+intestinal+epithelium:+strategies+and+applications.">Ex vivo culture of the intestinal epithelium: strategies and applications.</a> Gut. , (2014).</li><li>Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+models+of+intestinal+epithelial+cell+differentiation.">In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation.</a> Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).</li><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5(+ve)+stem+cells+drive+self-renewal+in+the+stomach+and+build+long-lived+gastric+units+in+vitro.">Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro.</a> Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche.">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li><li>Mahe, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+Gastrointestinal+Epithelial+Organoids.">Establishment of Gastrointestinal Epithelial Organoids.</a> Current Protocols in Mouse Biology. 3, 217-240 (2013).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+self-organizing+mini-guts+from+a+single+intestinal+stem+cell:+mechanism+and+applications.">Growing self-organizing mini-guts from a single intestinal stem cell: mechanism and applications.</a> Science. 340 (6137), 1190-1194 (2013).</li><li>Stelzner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nomenclature+for+intestinal+in+vitro+cultures.">A nomenclature for intestinal in vitro cultures.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (12), G1359-G1363 (2012).</li><li>Ramalingam, S., Daughtridge, G. W., Johnston, M. J., Gracz, A. D., Magness, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+levels+of+Sox9+expression+mark+colon+epithelial+stem+cells+that+form+colonoids+in+culture.">Distinct levels of Sox9 expression mark colon epithelial stem cells that form colonoids in culture.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (1), G10-G20 (2012).</li><li>Furstenberg, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorting+mouse+jejunal+epithelial+cells+with+CD24+yields+a+population+with+characteristics+of+intestinal+stem+cells.">Sorting mouse jejunal epithelial cells with CD24 yields a population with characteristics of intestinal stem cells.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300 (3), G409-G417 (2011).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+Intestinal+Stem+Cells+Based+on+Surface+Marker+Combinations+and+Colony-Formation+Assay.">Isolation and Characterization of Intestinal Stem Cells Based on Surface Marker Combinations and Colony-Formation Assay.</a> Gastroenterology. , (2013).</li><li>Yan, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intestinal+stem+cell+markers+Bmi1+and+Lgr5+identify+two+functionally+distinct+populations.">The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (2), 466-471 (2012).</li><li>Es, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dll1++secretory+progenitor+cells+revert+to+stem+cells+upon+crypt+damage.">Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage.</a> Nat Cell Biol. 14 (10), 1099-1104 (2012).</li><li>Yui, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+engraftment+of+colon+epithelium+expanded+in+vitro+from+a+single+adult+Lgr5(+)+stem+cell.">Functional engraftment of colon epithelium expanded in vitro from a single adult Lgr5(+) stem cell.</a> Nat Med. 18 (4), 618-623 (2012).</li><li>Durand, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+intestinal+stem+cells+after+Paneth+cell+ablation+induced+by+the+loss+of+transcription+factor+Math1+(Atoh1).">Functional intestinal stem cells after Paneth cell ablation induced by the loss of transcription factor Math1 (Atoh1).</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (23), 8965-8970 (2012).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts.">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469 (7330), 415-418 (2011).</li><li>Akcora, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CSF-1+receptor+fashions+the+intestinal+stem+cell+niche.">The CSF-1 receptor fashions the intestinal stem cell niche.</a> Stem Cell Res. 10 (2), 203-212 (2013).</li><li>Farin, H. F., Van Es, J. H., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redundant+sources+of+Wnt+regulate+intestinal+stem+cells+and+promote+formation+of+Paneth+cells.">Redundant sources of Wnt regulate intestinal stem cells and promote formation of Paneth cells.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1518-1529 (2012).</li><li>Rothenberg, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+cKit(+)+colonic+crypt+base+secretory+cell+that+supports+Lgr5(+)+stem+cells+in+mice.">Identification of a cKit(+) colonic crypt base secretory cell that supports Lgr5(+) stem cells in mice.</a> Gastroenterology. 142 (5), 1195-1205 (2012).</li><li>Lau, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peyer's+patch+M+cells+derived+from+Lgr5(+)+stem+cells+require+SpiB+and+are+induced+by+RankL+in+cultured+'miniguts.">Peyer's patch M cells derived from Lgr5(+) stem cells require SpiB and are induced by RankL in cultured 'miniguts.</a> Mol Cell Biol. 32 (18), 3639-3647 (2012).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Jung, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+in+vitro+expansion+of+human+colonic+stem+cells.">Isolation and in vitro expansion of human colonic stem cells.</a> Nat Med. 17 (10), 1225-1227 (2011).</li><li>Schwank, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+repair+of+CFTR+by+CRISPR/Cas9+in+intestinal+stem+cell+organoids+of+cystic+fibrosis+patients.">Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients.</a> Cell Stem Cell. 13 (6), 653-658 (2013).</li><li>VanDussen, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+enhanced+human+gastrointestinal+epithelial+culture+system+to+facilitate+patient-based+assays.">Development of an enhanced human gastrointestinal epithelial culture system to facilitate patient-based assays.</a> Gut. , (2014).</li><li>Fuller, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+stem+cells+remain+viable+after+prolonged+tissue+storage.">Intestinal stem cells remain viable after prolonged tissue storage.</a> Cell Tissue Res. 354 (2), 441-450 (2013).</li><li>Ootani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sustained+in+vitro+intestinal+epithelial+culture+within+a+Wnt-dependent+stem+cell+niche.">Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche.</a> Nat Med. 15 (6), 701-706 (2009).</li><li>Miyoshi, H., Ajima, R., Luo, C. T., Yamaguchi, T. P., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt5a+potentiates+TGF-beta+signaling+to+promote+colonic+crypt+regeneration+after+tissue+injury.">Wnt5a potentiates TGF-beta signaling to promote colonic crypt regeneration after tissue injury.</a> Science. 338 (6103), 108-113 (2012).</li><li>Koo, B. K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cells+Marked+by+the+R-Spondin+Receptor+Lgr5.">Stem Cells Marked by the R-Spondin Receptor Lgr5.</a> Gastroenterology. , (2014).</li><li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rat+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+by+combining+genetic+reprogramming+and+chemical+inhibitors.">Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining genetic reprogramming and chemical inhibitors.</a> Cell Stem Cell. 4 (1), 16-19 (2009).</li><li>Tojo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ALK-5+inhibitor+A-83-01+inhibits+Smad+signaling+and+epithelial-to-mesenchymal+transition+by+transforming+growth+factor-beta.">The ALK-5 inhibitor A-83-01 inhibits Smad signaling and epithelial-to-mesenchymal transition by transforming growth factor-beta.</a> Cancer Sci. 96 (11), 791-800 (2005).</li><li>Gafni, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+novel+human+ground+state+naive+pluripotent+stem+cells.">Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells.</a> Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).</li><li>Gracz, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brief+report:+CD24+and+CD44+mark+human+intestinal+epithelial+cell+populations+with+characteristics+of+active+and+facultative+stem+cells.">Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells.</a> Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).</li><li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract.">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Exp Biol Med (Maywood). , (2014).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+CFTR+assay+using+primary+cystic+fibrosis+intestinal+organoids.">A functional CFTR assay using primary cystic fibrosis intestinal organoids.</a> Nat Med. 19 (7), 939-945 (2013).</li><li>Kovbasnjuk, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+enteroids:+preclinical+models+of+non-inflammatory+diarrhea.">Human enteroids: preclinical models of non-inflammatory diarrhea.</a> Stem Cell Res Ther. 4, S3 (2013).</li><li>Fujii, M., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+intestinal+stem+cells:+applications+for+colorectal+cancer+research.">Culturing intestinal stem cells: applications for colorectal cancer research.</a> Front Genet. 5, 169 (2014).</li><li>Koo, B. K., Sasselli, V., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retroviral+gene+expression+control+in+primary+organoid+cultures.">Retroviral gene expression control in primary organoid cultures.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 27 (Unit 5A), 6 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

שיטה זו מספקת מערכת שלמה להתרבות שושלות מעיים אפיתל ודינמיקת האפיתל המהוות כלי שימושי ללמוד ביולוגיה אפיתל במעי. השיטה המוצגת במסמך זה הותאמה מהמחקר העכברי המקורי על ידי סאטו ו -22 Clevers שיעילות התוצאות בenteroids וcolonoids האנושיים. כאן, אנו ידני הרימו את מאורות ידי microdissection להימנע מכל מזהמים סלולריים. שיטה זו מאפשרת הדמיה ישירה של מאורות ומובילה לשעות נוספות עקביות בהשוואה לאוסף קריפטה המקורי על ידי &quot;רועד&quot;. קבוצות אחרות פיתחו טכניקה דומה תוך שימוש בגישות שונות במקצת במיוחד החלפת קלאציה על ידי EDTA עם collagenase 25. מלבד ההבדלים באוסף קריפטה, טכניקה אלה להשתמש בתקשורת מוגדרת שנדרש לגדול enteroids האדם בתרבות 22. כדי להגביר את יעילות צמיחה בזריעת קריפטה, אנו מוסיפים מעכב GSK3 (CHIR99021)ביומיים הראשונים 12. הטיפול ברקמה או הביופסיות חשוב ובידוד קריפטה צריכה להתבצע בהקדם הרקמה מגיעה במעבדה. עם זאת, בידוד קריפטה מתעכב ותרבות יכולים להתבצע עד 24 שעות לאחר איסוף רקמות (מידע לא מוצג) כפי שתואר לעיל לרקמה עכברית 26. רקמת המעי צריכה להיות ממוקמת בצינור חרוטי מלאים לחלוטין עם DPBS על מנת למנוע פגיעה ברקמות ויש לשמור על 4 מעלות צלזיוס. ההכנה מתעכבת מאפשרת משלוח רקמות אך יש להימנע וריאציה הטמפרטורה במהלך הובלה. הזמן הכולל נדרש לציפוי קריפטה הראשוני הוא כ 2 שעות עם 15 עד 30 דקות כדי לעבד את הרקמה ו1-2 שעות לבודד וצלחת קריפטה. Microdissection של הרקמה הוא הקובע ונשוא קריטיים של הכנת קריפטה נקייה. עם זאת, שחרור קריפטה ביד רועדת, כמתואר בפרוטוקולים שונים אפשרי 22,23. למרות קווי הדמיון עם מערכת enteroid העכברי (enteroids), enteroids האדם דורש מולקולות ספציפיות כדי לשפר ולשמר את הצמיחה שלהם לאורך זמן. גורמי הגדילה, EGF, Noggin, R-spondin משמשים באופן דומה לorganoids אפיתל העכברי. עם זאת, השימוש בWnt-3A הוא קריטי. שציינו כי ההיווצרות כמו גם את יעילות הצמיחה גדולה באמצעות מדיום מותנה Wnt-3A מאשר חלבון רקומביננטי האנושי. במקביל, הפגנו תנאי תרבות משופרים באמצעות מעכבי של קינאז synthase גליקוגן 3 (CHIR99021) 12. גורמי גדילת רקומביננטי יכולים להיות מוחלפים על ידי Wnt-3A, R-spondin, וNoggin מזגן תקשורת. קו L-תא Wnt-להביע 3A הוא זמין באופן מסחרי (ATCC). קבוצות אחרות פיתחו R-spondin 1 23,27, Noggin- 19, וWnt-3A / R-spondin3 / Noggin- 28 להביע שורות תאים. שני מעכבי מולקולה קטנים המשמשים בתרבותיdia ונחוץ לשמירה על התרבות 29. -83-01 הוא מעכב סלקטיבי של הפיכת β גורם הגדילה וActivin / קולטנים קטרים ​​(כמו Activin-kinase 4, 5, 7) וSB202190 הוא מעכב החלבון kinase מופעל-mitogen p38 (MAPK). שני המעכבים שימשו בהתאמה לקיים אנושי תאי גזע עצמי והתחדשות pluripotent מושרה ולהקים תאים אנושיים נאיביים pluripotent גזע 30-32. כמו כן, nicotinamide, מבשר של dinucleotide nicotinamide אדנין, נדרש לשמור enteroids והרחבת colonoids באופן ארוך טווח 22,29. קלאציה EDTA הוא צעד חשוב שיקבע את התשואה מהכנת קריפטה. אנחנו כבר מוצלחים עם 2 טיפול mM EDTA. עם זאת, ריכוז EDTA יכול להיות שונה מ2 מ&quot;מ עד 15 מ&quot;מ לגבי הסוג של רקמה. במקרה זה, זמן דגירה צריך להיקבע באופן אמפירי. לאחר הציפוי הראשוני, קריפטה תעגל u-p וסופו של דבר יוצר enteroids. עם זאת, enteroids או colonoids לעתים קרובות להפגין פנוטיפ &quot;גזע&quot; על ידי יצירת התחומים עם לא מעט תאים מובחנים. במקרה זה, בידול יכול להיות יזם על ידי נסיגת Wnt-3A, nicotinamide ומעכב MAPK p38. השימוש במעכבי Notch כגון DAPT או DBZ עוזר לשפר את הבידול בתוך enteroids 22. מודל זה מסכם את הפיסיולוגיה מעיים עם אירועים מתמשכים ניצנים-קריפטה הנובעים מתא בתאי גזע, כמו גם תחומים כמו אפיתל-סיסי המכילים את שני הקליטה ושושלות הפרשה מובחנת. מעניין, מערכת זו אינה מכילה את כל תאי mesenchymal ומשתמשת תנאי תקשורת ספציפיים כדי לעמוד בדרישות אות נישה. כמו המודל העכברי, יכול להיות שנוצר מתאי אפיתל במעי מבודדים enteroids אדם כדי לבדוק את יכולתם של תאים אלה לתפקד כתאי גזע. Seveמחקרי RAL השתמשו מקבץ של סמני בידול (CD44, CD24 או CD166) ותאים חיוביים EPHB2 להעשיר לתאים עם תכונות גזע 12,23,33. יחד, מחקרים אלה להדגים את התועלת של תרבויות enteroids אדם לבדיקת stemness. חוקרים אחרים משתמשים במודל זה כדי לחקור מחלות מעיים כגון מחלות זיהומיות שלשולים, סיסטיק פיברוזיס, או סרטן מעי גס 22,34-37. מחקרים אלה מראים כי enteroids האנושי מהווה מודל מחלה אנושי אמין עם אפשרות לנוע לעבר הקרנה אישית. enteroids אדם יכול להיות מהונדס גנטי באמצעות transfection DNA או זיהום בחלקיקים נגיפיים 38. זה מספק כלי רב עוצמה כדי ללמוד פונקציות גן ספציפי בתוך organoids אפיתל האדם או מוטציות גנטיות נכונות. לאחרונה, שוונק ועמיתים הדגימו את האפשרות לערוך את הגנום עם CRISPR / מערכת Cas9 ולתקן את המוטציה בגן CFTR ac גורםסיסטיק ystic 24. enteroids האנושי מהווה מערכת רבת ערך כדי ללמוד בתאי גזע במעי וביולוגיה רירית אפיתל וישמש כמערכת ניסיונית רומן ללמוד פיזיולוגיה של מערכת העיכול הן נורמלית ולא נורמלית.

אפיתל הרירית של מערכת העיכול הוא בהתחדשות מתמדת. תהליך זה מופעל על ידי התפשטות של תאי גזע במעי (ISCs) אשר ברציפות לייצר צאצאים להחליף במהירות אפיתל במעי כפי שמתברר מעל. תא השגשוג המרכיב את ISCs מוגבל לחלקו התחתון של מאורות. ISCs להצמיח צאצאים שסופו של דבר להתמיין הקליטה או שושלות הפרשה. נע אל מחוץ לקריפטה ועל האפיתל הסיסי או משטח, תאים להבחין בהדרגה כפי שהם נודדים כלפי מעלה לפני הקילוף לתוך הלום 1. ISCs להצמיח כל סוגי תאי אפיתל במעי כוללים enterocytes, תאי microfold, תאי enteroendocrine, תאי גביע, תאי ציצה ותאי פנט. המעי הגס מאופיין מאורות מוארכים מורכבים בעיקר מcolonocytes ותאי גביע, עם enteroendocrine המפוזר ותאי ציצה 2. Vivo לשעבר רחוב ללא מוצאמערכות מכשור מהוות כלי מבטיח ללימוד תחזוקת ISC והומאוסטזיס רקמת מעי. עם זאת, קשה להסתמך על טכנולוגיות תרבית רקמה כתנאים פיסיולוגיים אינם לשכפל באופן מלא ומייקרו-סביבת אפיתל לעתים קרובות שינה 3,4. התקדמות גדולה בתחום ISC הייתה הקמתה של טכניקות תרבית רקמה כדי לשמור ולהרחיב ISCs העכברי בודד באמצעות גורמי גדילה הגדירו להחליף את אותות נישה מעיים הרגילים. תנאי תרבות לטווח ארוך תוארו על ידי אל סאטו et., שבו מאורות בודדים או תאי גזע מבודדים מאפיתל במעי לגדול כדי ליצור מבני אפיתל 3 ממדים כוללים תחומים כמו קריפטה-מרובים 5-7. מבני tridimensional אלה עוברים אירועי ביקוע להרחיב ברציפות. מעניין, כל סוגי תאי המעיים ספציפיים לרקמת המוצא מיוצרים וגם נמתחים לתוך לומן 8. באמצעות שינויים במערכת זו, אפיתליכול להיות שנוצר organoids מהקיבה, המעי הדק והמעי הגס. באופן ספציפי יותר, organoids אפיתל מהמעי הדק הם enteroids 9, ואלה מהמעי הגס הם colonoids 9,10. מערכות התרבות אלה אפיתל organoid היו בשימוש על מנת לבחון את היכולת של תאים בודדים מבודדים לתפקד כתאי גזע במבחנה, ובכך בודקים את &quot;stemness&quot; של תאים מבודדים 5,6,10-15. חוקרים אחרים השתמשו בשני enteroids וcolonoids ללמוד את הפונקציה של תאי האפיתל פרט 16-21. כך, ניתן להשתמש בתרבויות enteroid וcolonoid להעריך את שני פונקציות הגזע ותאים הלא-גזע ולתת תובנה חדשה אינטראקציות הסלולר יסודיות בתוך המעיים. בשינה 2011, סאטו ועמיתים נוצרו תרבות לטווח הארוך של organoids אפיתל נגזר ממעי דק ומעי גס אנושיים 22,23. מלבד הבדלים בהרכב תקשורת, enteroids אפיתל האדםוcolonoids להפגין את אותן תכונות כמו עמיתו העכברי שלהם. יתר על כן, הם יכולים להיות שנוצרו מרקמות חולות כגון הוושט, אדנומה בארט או אדנוקרצינומה, וסיסטיק פיברוזיס 22,24. enteroids האנושי מהווה מערכת רבת ערך כדי ללמוד בתאי גזע במעי וביולוגיה רירית אפיתל וישמש כמערכת ניסיונית רומן ללמוד פיזיולוגיה של מערכת העיכול הן נורמלית ולא נורמלית 3. כאן אנו מתארים שיטות להקים enteroids וcolonoids ממעי דק אנושי ומאורות מעי גס (איור 1). בסקירה מתודולוגית זו, אנו מדגישים את אוסף קריפטה מכל רקמה וביופסיות. אנחנו לשחזר את שיטות התרבות שהם חיוניים לצמיחה והתחזוקה של enteroids האדם וcolonoids והאסטרטגיות הניסיוניות האפשריים שבוצעו על ידי מודל זה מצליח.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate buffered saline Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;free (DPBS)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP439-500</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Gzntamycin/Amphotericin B solution</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>R-015-10</td><td></td></tr><tr><td>Wnt-3A conditioned medium</td><td>in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (glutamine)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotidamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>human recombinant Noggin</td><td>R&amp;amp;D</td><td>6057-NG/CF</td><td></td></tr><tr><td>human recombinant R-Spondin</td><td>Preprotech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>human recombinant EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067-5MG</td><td></td></tr><tr><td>human [Leu]15-Gastrin 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145-.1MG</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>A13713-01</td><td></td></tr><tr><td>L Wnt-3A cell line</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>Renilla luciferase assay</td><td>Promega</td><td>E2710</td><td></td></tr><tr><td>human recombinant Wnt-3A</td><td>R&amp;amp;D</td><td>5036-WN/CF</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 TOPflash cell line</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

איור 2 ד מציג דוגמא טיפוסית של מאורות מבודדים טרי מכל הרקמה (איור 2 ד). מספר מאורות המבודדים מביופסיה הוא נמוך יותר מאשר בכל רקמות. בעזרת מלקחיים ביופסית היכולת תקניים עם מחט, אנחנו בדרך כלל לבצע שתי עקיצות ביופסיה במעבר אחד. כל תוצאות ביופסית נגיסה בשטח 10 מ&quot;מ 2 עם ממוצע של 50 עד 100 מאורות לביופסיה (איור 2F). אחרי התרבות במטריצת קרום במרתף, מאורות לאסוף כדי ליצור enterospheres למעי דק ומעי גס colonospheres ל. קריפטה ניצנים מתרחשת בדרך כלל בתוך 5-6 ימים, לאחר זריעה. עם זאת, הוא לא יוצא דופן לראות גם enteroids (enteroids) או colonoids (colonoids) יוצר כדורים במטריצת הקרום במרתף (איור 3 א-C; 1 סרט). Passaging יכול להיעשות לאחר 7 ימים, תלוי בגודל של enteroids. Establ enteroids או colonoidsished מביופסיות לעבור את אותו פיתוח בתרבות. עם זאת, כפי שצפיפות קריפטה בזריעה נמוכה, passaging נעשה בדרך כלל לאחר 10 עד 12 ימים בתרבות (איור 4 א, ב). Enteroids ותרבויות colonoids להרחיב באופן לשחזור. enteroids וcolonoids שניהם להציג צד luminal וצופה אפיתל (איור 5 א &#39;, ב&#39;). ניתן להבחין בתאי שגשוג בתוך enteroids ונמצאים בתוך הטיפים הניצן (איור 5 ג, ד). הדמיה של Confocal enteroids מוכתם בE-cadherin (ECAD) מציגה את תאי אפיתל (איור 5E). ניתן להקים מהרקמה המתקבלת מחולים עם הפרעות גנטיות / מולדים enteroids וcolonoids שניהם. איור 6 מציג enteroids נציג גובר מצד מטופל עם סיסטיק פיברוזיס (איור 6 א) וenteropathy tufting עקב מוטציה מולדת במודעת תאי אפיתלגן מולקולת hesion (EpCAM) (איור 6). ליד הפגם הגנטי, enteroids אינו מציג הבדלים במצב בסיסי. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig1highres.jpg" /> איור 1. Workflow של דיסוציאציה מאורות ודור של enteroids וcolonoids בתרבות האנושי. מאורות (ממעי דק או מעי גס אנושיים) מבודדים על ידי קלאציה EDTA. מאורות תרבותיים יוצרים enteroids למעי הדק וcolonoids למעי הגס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig2highres.jpg" /> תהליך איור 2. Dissection לבידוד קריפטה. () specime המעי הדקn נמתח והצמיד שטוח לתוך צלחת פטרי מצופי סיליקון. (ב) הרירית מופרדת מsubmucosa הבסיסי. הרירית גזור (C) נמתחה והצמידה שטוח לתוך צלחת פטרי מצופי סיליקון. (ד) לאחר קלאציה EDTA, מאורות מבודדים מהרקמה. (E) ביופסיה אחת נמתחה והצמידה שטוח לתוך צלחת פטרי מצופי סיליקון. (F) לאחר קלאציה EDTA, מאורות מבודדים מהביופסיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig3highres.jpg" /> איור 3. תרבות קריפטה וenteroid אדם ודור colonoid מכל רקמה. () מאורות Jejunal מצופים במטריצת קרום במרתף לאחר בידוד. מאורות סוגרים אחרי 3 עד 4 שעות ולהתחיל לבלון עד ליצירת enterospheres מעבר לכך זמן. בשעת 7 ימים, enteroids jejunal נוצרים. (ב) לאחר בידוד ותרבות, מאורות ileal מתנהגים כמו מאורות jejunal ויוצרים enteroids ileal. מאורות מעי גסים (C) הם מצופים במטריצת קרום במרתף לאחר בידוד. מאורות colonoids הקרוב וצורה לאחר 7 ימים (ברים בקנה מידה: 100 מיקרומטר). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig4highres.jpg" /> איור 4. תרבות קריפטה וenteroid אדם ודור colonoid מביופסיה. () מאורות התריסריון מצופים במטריצת קרום במרתף לאחר בידוד. מאורות סוגרים אחרי 3 עד 4 שעות ולהתחיל לבלון עד beyond זה זמן ליצור enterospheres. בשעת 7 ימים, enteroids נוצרים. (ב) לאחר בידוד ותרבות, מאורות מעי הגס הם מצופים במטריצת קרום במרתף. מאורות מקרוב כדי ליצור colonospheres אז colonoids לאחר 7 ימים (ברים בקנה מידה: 100 מיקרומטר). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig5highres.jpg" /> איור 5. שושלות מעיים של enteroids האנושי. () Enteroid אדם לאחר 6 ימים בתרבות. (ב) סעיפי Hematoxylin-eosin של enteroids ב() להדגים את האפיתל המצפה (ברים בקנה מידה: 100 מיקרומטר). (CD) ההדמיה Confocal של enteroids לאחר צביעת edu (מגנטה) מראה את הנוכחות של תאי שגשוג. (E </strאונג&gt;) ההדמיה Confocal של enteroids מדגימה את הנוכחות של: E-cadherin לתאי האפיתל (ECAD, ירוק) (בר סולם:. 50 מיקרומטר) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig6highres.jpg" /> איור 6. תרבות קריפטה ודור enteroid אדם מהרקמה חולה. () Enteroids הוקמו מדגימת סיסטיק פיברוזיס. Enteroids (B) שהוקם מדגימת enteropathy tufting מולדת (ברים בקנה מידה: 100 מיקרומטר). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> הסרט 1. Enterosphere להרכיב enteroid אדם בתרבות. בזמן הקפות 32 שעותסרט דואר תערוכות enterosphere הוקם ממעי הדק אדם חוזר בי כדי ליצור enteroid בתרבות. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/Movie1_v2.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון זה.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> ממס </td><td> ריכוז המניה </td><td> ריכוז סופי </td><td> תגובה </td></tr><tr><td> פוספט של Dulbecco שנאגרו מלוח Ca 2 +, Mg 2 + חופשי (DPBS) </td><td> טכנולוגיות חיים; Gibco </td><td> 14190-144 </td><td> - </td><td> - </td><td> 1x </td><td></td></tr><tr><td> Ethylenediamine חומצת tetraacetic (EDTA) </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 431,788 </td><td> Ultrapure DH 2 O </td><tד&gt; 0.5 M </td><td> 2 מ&quot;מ </td><td></td></tr><tr><td> סורביטול </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP439-500 </td><td> DPBS </td><td> אבקה </td><td> 2% </td><td></td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP220-1 </td><td> DPBS </td><td> אבקה </td><td> 1% </td><td></td></tr><tr><td> אלבומין בסרום שור (BSA) V Fraction </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> BP1600-100 </td><td> DPBS </td><td> אבקה </td><td> 1% </td><td></td></tr><tr><td> Gzntamycin / Amphotericin B פתרון </td><td> טכנולוגיות חיים; Gibco </td><td> R-015-10 </td><td> - </td><td> 500x </td><td> 1x </td><td></td></tr><tr><td> Wnt-3A conditionned בינוני </td><td> בבית </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> מתקדם DMEM / F12 </td><td> טכנולוגיות חיים; Gibco </td><td> 12634-028 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> טכנולוגיות חיים; Gibco </td><td> 15630-080 </td><td> - </td><td> 1 M </td><td> 10 מ&quot;מ </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax (גלוטמין) </td><td> טכנולוגיות חיים; Gibco </td><td> 35050-061 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> פניצילין, סטרפטומיצין (10,000 U / mL) </td><td> טכנולוגיות חיים; Gibco </td><td> 15140-148 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> מוסף N2 </td><td> טכנולוגיות חיים; Gibco </td><td> 17502-048 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> מוסף B27 </td><td> טכנולוגיות חיים; Gibco </td><td> 17504-044 </td><td> - </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> N-acetylcysteine </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> A9165-5G </td><td> DPBS </td><td> 1 M </td><td> 1 מ&quot;מ </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Nicotidamide </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> N0636 </td><td> DPBS </td><td> 1 M </td><td> 10 מ&quot;מ </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel, GFR, (מטריצת קרום במרתף) החופשי פנול </td><td> קורנינג </td><td> 356,231 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> נדרש </td></tr><tr><td> Noggin רקומביננטי אדם </td><td> R &amp; D </td><td> 6057-NG / CF </td><td> DPBS </td><td> 100 מיקרוגרם / מיליליטר </td><td> 100 ng / ml </td><td rowspan="3"> ספקים אחרים: R &amp; D; Anaspec וPreprotech </td></tr><tr><td> R-Spondin רקומביננטי אדם </td><td> Preprotech </td><td> 120-38 </td><td> DPBS </td><td> 1 מ&quot;ג / מיליליטר </td><td> 1 מיקרוגרם / מיליליטר </td></tr><tr><td> EGF רקומביננטי אדם </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> E9644-.2MG </td><td> DBPS </td><td> 500 מיקרוגרם / מיליליטר </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td> Y-27632 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> Y0503-1MG </td><td> DPBS </td><td> 10 מ&quot;מ </td><td> 10 מיקרומטר </td><td></td></tr><tr><td> -83-01 </td><td> Tocris </td><td> 2,939 </td><td> DMSO </td><td> 500 מיקרומטר </td><td> 500 ננומטר </td><td></td></tr><tr><td> SB202190 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> S7067-5MG </td><td> DMSO </td><td> 30 מ&quot;מ </td><td> 10 מיקרומטר </td><td></td></tr><tr><td> אדם [Leu] 15-Gastrin 1 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> G9145-.1MG </td><td> DPBS </td><td> 100 מיקרומטר </td><td> 10 ננומטר </td><td></td></tr><tr><td> CHIR99021 </td><td> Stemgent </td><td> 04-0004 </td><td> DMSO </td><td> 10 מ&quot;מ </td><td> 2.5 מיקרומטר </td><td></td></tr><tr><td> Thiazovivin </td><td> Stemgent </td><td> 04-0017 </td><td> DMSO </td><td> 10 מ&quot;מ </td><td> 2.5 מיקרומטר </td><td></td></tr><tr><td> TrypLE Express אנזים (1X), פנול אדום (אנזים תא דיסוציאציה) </td><td> טכנולוגיות חיים; Gibco </td><td> 12605-010 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> לpassaging </td></tr><tr><td> בסרום שור עוברי </td><td> טכנולוגיות חיים; Gibco </td><td> 10082-147 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> לpassaging </td></tr><tr><td> CTS-Synth-הקפאה (מדיום הקפאה) בינונית </td><td> טכנולוגיות חיים; Gibco </td><td> A13713-01 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> להקפאה </td></tr><tr><td> שורת תאי L Wnt-3A </td><td> ATCC </td><td> CRL-2,647 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Wnt-3A conditionned ייצור תקשורת </td></tr><tr><td> assay בלוציפראז Renilla </td><td> Promega </td><td> E2710 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Wnt-3A conditionned פעילות תקשורת </td></tr><tr><td> Wnt-3A רקומביננטי אדם </td><td> R &amp; D </td><td> 5036-WN / CF </td><td> DPBS </td><td> 100 מיקרוגרם / מיליליטר </td><td> 100 ng / ml </td><td&gt; פעילות תקשורת Wnt-3A conditionned </td></tr><tr><td> שורת תאי HEK293 TOPflash </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Wnt-3A conditionned פעילות תקשורת; מתנה ממעבדת הנס Clevers </td></tr></tbody></table> רשימת 1. מגיב מפורט בטבלה עם יצרן מועדף ומספר קטלוג. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> ציוד </td><td> מתכלה </td><td> כלים </td></tr><tr><td> הזרימה למינרית </td><td> 15 ו -50 מיליליטר צינורות חרוטי </td><td> דומון # 5 מלקחיים סטנדרטיים (FST; # 11,251-20) </td></tr><tr><td> CO 2 חממה </td><td> צינורות microfuge </td><td> דומון # 7, מלקחיים בסדר מעוקלים (FST; # 11,274-20) </td></tr><tr><td> סטריאו-מיקרוסקופ </td><td> 24 גם צלחות </td><td> מספריים פיין (FST; # 14,060-09) </td></tr><tr&gt; <td> צנטריפוגה </td><td> 0.22 מיקרומטר מסננים (Sartorius) </td><td> מספריים אביב Vannas (FST; # 15,018-10) </td></tr><tr><td> ייקר מסלולית </td><td> טפטפות סרולוגיות </td><td> סיכות קוטר minutien 0.2 מ&quot;מ (FST; # 26,002-20) </td></tr><tr><td> מיכל הקפאה (Nalgene) </td><td> טיפים micropipette </td><td> סיכות קוטר minutien 0.1 מ&quot;מ (FST; # 26,002-10) </td></tr><tr><td> סיליקון Sylgard 184 (Dow Corning) </td><td> 150 מיקרומטר פתחי רשת, סינון ניילון (Dynamic Aqua-אספקה) </td><td></td></tr><tr><td> צלחת פטרי מזכוכית </td><td> 5 מיליליטר צינורות פוליפרופילן מסביב לתחתית (Falcon) </td><td></td></tr><tr><td> pipettor סרולוגיות </td><td> מחט מילוי הבוטה 18G (BD) </td><td></td></tr><tr><td> Micropipette </td><td> 3 מיליליטר lsyringes עם טיפים Luer-Lock (BD) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Cryovials </td><td></td></tr></tbody></table><strong&gt; טבלת 2. מתכלה, כלים, וציוד מפורטים דרוש לבידוד קריפטה והתרבות.

Watch this Scientific Journal Video about Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy at JoVE.com

Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

הקמתו של ארגון Human אפיתל Enteroids וColonoids מרקמות שלמות וביופסיה

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

establishment-human-epithelial-enteroids-colonoids-from-whole-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

34.7K Views.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Video: Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted in sophisticated in vitro models of the intestinal mucosa. Leveraging these emerging model systems will require adaptation of tools and techniques developed for 2D culture systems and animals. Here, we describe a technique for measuring epithelial barrier permeability in human intestinal organoids in real-time. This is accomplished by microinjection of fluorescently-labeled dextran and imaging on an inverted microscope fitted with epifluorescent filters. Real-time measurement of the barrier permeability in intestinal organoids facilitates the generation of high-resolution temporal data in human intestinal epithelial tissue, although this technique can also be applied to fixed timepoint imaging approaches. This protocol is readily adaptable for the measurement of epithelial barrier permeability following exposure to pharmacologic agents, bacterial products or toxins, or live microorganisms. With minor modifications, this protocol can also serve as a general primer on microinjection of intestinal organoids and users may choose to supplement this protocol with additional or alternative downstream applications following microinjection.

This protocol describes the measurement of epithelial barrier permeability in real-time following pharmacologic treatment in human intestinal organoids using fluorescent microscopy and live cell microscopy.

בזמן אמת מדידה של מחסום האפיתל חדירות ב Organoids מעיים אנושיים

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Developmental Biology

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human intestinal epithelium, leading to increased intestinal permeability, impaired restitution, and increased cell death. Although there are numerous animal models of NEC, response to injury and therapeutic interventions may be highly variable between species. Furthermore, it is ethically challenging to study disease pathophysiology or novel therapeutic agents directly in human subjects, especially children. Therefore, it is highly desirable to develop a novel model of NEC using human tissue. Enteroids are 3-dimensional organoids derived from intestinal epithelial cells. They are ideal for the study of complex physiologic interactions, cell signaling, and host-pathogen defense. In this manuscript we describe a protocol that cultures human enteroids after isolating intestinal stem cells from patients undergoing bowel resection. The crypt cells are cultured in media containing growth factors that encourage differentiation into the various cell types native of the human intestinal epithelium. These cells are grown in a synthetic, collagenous mix of proteins that serve as a scaffold, mimicking the extra-cellular basement membrane. As a result, enteroids develop apical-basolateral polarity. Co-administration of lipopolysaccharide (LPS) in media causes an inflammatory response in the enteroids, leading to histologic, genetic, and protein expression alterations similar to those seen in human NEC. An experimental model of NEC using human tissue may provide a more accurate platform for drug and treatment testing prior to human trials, as we strive to identify a cure for this disease.

Enteroids are emerging as a novel model in the study of human disease. The protocol describes how to simulate an enteroid model of human necrotizing enterocolitis using lipopolysaccharide (LPS) treatment of enteroids generated from neonatal tissue. Collected enteroids demonstrate inflammatory changes akin to those seen in human necrotizing enterocolitis.

הרומן האנושי אפיתל Enteroid דגם של דלקת מעי נמקית

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

Immunology and Infection

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Monolayers Colonoid האדם ללמוד אינטראקציות בין גורמי מחלה, Commensals אפיתל המעי מארח

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

תרבית משותפת של אורגנואידים אפיתליאליים של המעי הדק של מורין עם תאי לימפה מולדים

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have recently emerged as a promising system to model gastrointestinal pathologies. However, currently utilized methods for enteroid manipulation either lack access to the apical surface of the epithelium (three-dimensional [3D]) or are time-consuming and resource-intensive (two-dimensional [2D] monolayers). These methods often require additional steps, such as microinjection, for the model to become physiologically translatable. Here, we describe a physiologically relevant and inexpensive protocol for studying NEC in vitro by reversing enteroid polarity, resulting in the apical surface facing outward (apical-out). An immunofluorescent staining protocol to examine enteroid barrier integrity and junctional protein expression following exposure to tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) or lipopolysaccharide (LPS) under normoxic or hypoxic conditions is also provided. The viability of 3D apical-out enteroids exposed to normoxic or hypoxic LPS or TNF-&#945; for 24 h is also evaluated. Enteroids exposed to either LPS or TNF-&#945;, in combination with hypoxia, exhibited disruption of epithelial architecture, a loss of adherens junction protein expression, and a reduction in cell viability. This protocol describes a new apical-out NEC-in-a-dish model which presents a physiologically relevant and cost-effective platform to identify potential epithelial targets for NEC therapies and study the preterm intestinal response to therapeutics.

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

This protocol describes an apical-out necrotizing enterocolitis (NEC)-in-a-dish model utilizing small intestinal enteroids with reversed polarity, allowing access to the apical surface. We provide an immunofluorescent staining protocol to detect NEC-related epithelial disruption and a method to determine the viability of apical-out enteroids subjected to the NEC-in-a-dish protocol.

במבחנה מודל אנטרואיד אפיקלי-אאוט של אנטרוקוליטיס נמקית

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Testing Epithelial Permeability in Fetal Tissue-Derived Enteroids

Human fetal tissue-derived enteroids are emerging as a promising in vitro model to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids exhibit polarity, consisting of a lumen with an apical border, tight junctions, and a basolateral outer layer exposed to growth media. The consequences of intestinal injuries include mucosal inflammation and increased permeability. Testing intestinal permeability in vulnerable preterm human subjects is often not feasible. Thus, an in vitro fetal tissue-derived intestinal model is needed to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids can be used to test changes in epithelial permeability regulated by tight junction proteins. In enteroids, intestinal stem cells differentiate into all epithelial cell types and form a three-dimensional structure on a basement membrane matrix secreted by mouse sarcoma cells. In this article, we describe the methods used for establishing enteroids from fetal intestinal tissue, characterizing the enteroid tight junction proteins with immunofluorescent imaging, and testing epithelial permeability. As gram-negative dominant bacterial dysbiosis is a known risk factor for intestinal injury, we used lipopolysaccharide (LPS), an endotoxin produced by gram-negative bacteria, to induce permeability in the enteroids. Fluorescein-labeled dextran was microinjected into the enteroid lumen, and serial dextran concentrations leaked into the culture media were measured to quantify the changes in paracellular permeability. The experiment showed that apical exposure to LPS induces epithelial permeability in a concentration-dependent manner. These findings support the hypothesis that gram-negative dominant dysbiosis contributes to the mechanism of intestinal injury in preterm infants.

This protocol details the establishment of enteroids, a three-dimensional intestinal model, from fetal intestinal tissue. Immunofluorescent imaging of epithelial biomarkers was used for model characterization. Apical exposure of lipopolysaccharides, a bacterial endotoxin, using microinjection technique induced epithelial permeability in a dose-dependent manner measured by the leakage of fluorescent dextran.

בדיקת חדירות אפיתל באנטרוידים שמקורם ברקמות עובריות

Human fetal tissue-derived enteroids are emerging as a promising in vitro model to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids exhibit ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

מונו-שכבת אפיתל שמקורה באורגנואידים: מודל במבחנה רלוונטי מבחינה קלינית לתפקוד מחסום המעי

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Biology

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

דור של מונוליירים אפיתל המעי הגס הראשי מורין מקריפטות מעיים

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

שיטות תרבות לחקר אינטראקציות ספציפיות לאפיקליות באמצעות מודלים אורגנויד מעיים

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Generation and Characterization of Murine Oral Mucosal Organoid Cultures

The mucous lining covering the inside of our mouth, the oral mucosa, is a highly compartmentalized tissue and can be subdivided into the buccal mucosa, gingiva, lips, palate, and tongue. Its uppermost layer, the oral epithelium, is maintained by adult stem cells throughout life. Proliferation and differentiation of adult epithelial stem cells have been intensively studied using in vivo mouse models as well as two-dimensional (2D) feeder-cell based in vitro models. Complementary to these methods is organoid technology, where adult stem cells are embedded into an extracellular matrix (ECM)-rich hydrogel and provided with a culture medium containing a defined cocktail of growth factors. Under these conditions, adult stem cells proliferate and spontaneously form three-dimensional (3D) cell clusters, the so-called organoids. Organoid cultures were initially established from murine small intestinal epithelial stem cells. However, the method has since been adapted for other epithelial stem cell types. Here, we describe a protocol for the generation and characterization of murine oral mucosal organoid cultures. Primary epithelial cells are isolated from murine tongue tissue, embedded into an ECM hydrogel, and cultured in a medium containing: epidermal growth factor (EGF), R-spondin, and fibroblast growth factor (FGF) 10. Within 7 to 14 days of initial seeding, the resulting organoids can be passaged for further expansion and cryopreservation. We additionally present strategies for the characterization of established organoid cultures via 3D whole-mount imaging and gene-expression analysis. This protocol may serve as a tool to investigate oral epithelial stem cell behavior ex vivo in a reductionist manner.

<meta charset="utf8"></head><body>יצירה ואפיון של תרביות אורגנואידים ברירית הפה של עכברים

We present a method for the generation and characterization of oral mucosal organoid cultures derived from the tongue epithelium of adult mice.

יצירה ואפיון של תרביות אורגנואידים ברירית הפה של עכברים

The mucous lining covering the inside of our mouth, the oral mucosa, is a highly compartmentalized tissue and can be subdivided into the buccal mucosa, ...