We gratefully acknowledge Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands) for the kind gift of TOPflash cells.
This project was supported in part by NIH-R01DK083325 (MAH); NIH P30 DK078392 (Digestive Health Center); NIH UL1RR026314 (CTSA).

Declaração de Ética: NOTA: Todos experimentação utilizando tecidos humanos aqui descritos foi aprovado por um IRB em CCHMC (IRB # 2012-2858; # 2.014-0.427). O consentimento informado para a recolha de tecido, armazenamento e utilização das amostras foi obtida a partir dos dadores a CCHMC. 1. Preparação para a Cultura NOTA: Todos os reagentes estão listados na Tabela 1. <ol><li> Preparar a solução de estoque de EDTA como se segue: preparar 0,5 M de ácido etilenodiaminotetraacético, pH 8 (EDTA) em ultrapura H2O, esterilizada por filtração com filtros de 0,22 um. Opcionalmente, armazenar a solução de EDTA a RT indefinidamente. </li><li> Preparar tampão quelante, como segue: misturar 2% de sorbitol, 1% de sacarose, 1% de fracção V de albumina de soro bovino (BSA) e gentamicina 1x / solução de anfotericina em fosfato de Dulbecco tamponado com solução salina, sem Ca 2+ e Mg 2+ (DPBS), esterilizado por filtração com filtro de 0,22 um. Prepare o buf quelantefer fresco. </li><li> Prepare meio de Wnt-3A-condicionado como se segue: O meio de Wnt-3A-condicionado é feito em casa utilizando a linha celular de Wnt-L 3A de acordo com as instruções do fabricante (ATCC, CRL-2647). Suplementar o meio com 2 mM de glutamina, 10 mM de HEPES, 100 U / ml de penicilina, 100 g / ml de estreptomicina, 1 suplemento N2, 1 B27 suplemento, 1% de BSA e esterilizado por filtração com um filtro de 0,22? M. NOTA: Teste todos os lotes para a atividade Wnt usando um ensaio TOPflash. Utilize uma linha celular HEK293 TOPflash estável (Hans Clevers laboratório) com um kit de ensaio de luciferase de Renilla de acordo com as instruções do fabricante. Normalizar o ensaio TOPflash com 100 ng / ml de recombinante humano Wnt-3A. Confirme pelo menos uma atividade de 10 fold-change dos meios condicionados relação ao controle. Divide meio de Wnt-3A-condicionado fresco em alíquotas de 10 ml em tubos cónicos de 15 ml e congeladas a -20 ° C durante até 6 meses. Loja descongeladas aliquotas até 5 dias a 4 ° C sem perda de actividade. </li><li> Prepare meio minigut humano como se segue: Suplemento avançada meio DMEM / F12 com 2 mM de glutamina, 10 mM de HEPES, 100 U / mL de penicilina, 100 g / mL de estreptomicina, 1 suplemento N2, 1 B27 suplemento, 1% de BSA e esterilizado por filtração com 0,22 filtro de? m. NOTA: Dividir meio minigut humano fresco em 10 ml de partes alíquotas em tubos cónicos de 15 ml e congeladas a -20 ° C durante até 3 meses. Loja descongeladas aliquotas até 5 dias a 4 ° C sem perda de actividade. </li><li> Prepare meio completo minigut humana da seguinte forma: Prepare fresco antes de cultura cripta ou mudança médio médio minigut humana (ver 1.4) suplementado com 50% de Wnt-condicionado-3A meio (ver 1.3), 1 mg / ml R-espondina 1 (1: 1.000 diluição de 1 mg / ml de stock), Noggin 100 ng / ml (1: 1000 de diluição de 100 g / mL de estoque), 50 ng / mL de EGF (diluição 1: 10.000 de 500 ug / mL de estoque), 500 nM de A-83 -01 (1: 1000 de diluição de 500 M estoque), 10 uM SB202190 (1: 3000 de diluição de estoque 30 mM), 10 nM de [Leu] 15-Gastrina 1 (diluição 1: 10.000 de 100 uMestoque), 10 mM de nicotinamida (diluição 1: 100 de 1 M) e 1 mM de N-Acetilcisteína (1: 1000 de diluição de 1 M). NOTA: Loja completos media minigut humanos até 2 dias a 4 ° C, sem perda de atividade. </li></ol> 2. Crypt Isolamento da Whole Tissue NOTA: A partir da coleta de tecido, é essencial para manter a amostra em solução salina. Recomenda-se a manter o tecido em gelo durante o transporte. Preparação da amostra para o isolamento de cripta deve ser realizada o mais rapidamente possível. NOTA: Todos os reagentes estão listados na Tabela 1, ferramentas, equipamento, e materiais de consumo estão listados na Tabela 2. <ol><li> Preparar todos os reagentes antes de se iniciar a experiência. Descongelar a matriz da membrana basal em gelo e pré-incubar uma placa de 24 cavidades em uma incubadora de CO 2 a 37 ° C. NOTA: Como alternativa fazer uma fina camada de membrana basal da matriz, utilizando 15 uL / ​​cavidade no centro de um 24-bem placa e colocá-lo em uma incubadora de CO 2 a 37 ° C. Esta etapa facultativa mantém a matriz da membrana basal, como uma queda durante a polimerização. </li><li> Lavar o tecido com gelado de Dulbecco tamponada com fosfato salino sem Ca 2+ e Mg 2+ (DPBS). Continuar até que o teor de DPBS é clara. </li><li> Usando 0,2 mm de diâmetro minutien pinos, proteger o tecido sobre uma placa de Petri de vidro revestidas com silicone preenchida com DPBS gelado. Esticar e fixar o tecido plano com o lado da mucosa voltada para cima. </li><li> Sob um microscópio de dissecação, remover a mucosa sobrejacente a partir da submucosa e tecido conjuntivo usando micro-dissecação tesouras e pinças curvas do ponto fino (Figura 2A, B). </li><li> Esticar e fixar o dissecados mucosa plana no vidro placa de Petri com revestimento de silicone com o lado da mucosa voltada para cima. O restante da submucosa e tecido conjuntivo pode ser descartado ou usado para experimentos posteriores (Figura 2C). </li><li> Suavementeraspar a superfície da mucosa com pinças curvas. Este passo é necessário para melhorar a qualidade da preparação. <ol><li> Para intestino delgado, raspe a mucosa para remover as vilosidades. </li><li> Para cólon, raspe a mucosa para remover muco e detritos. </li></ol></li><li> Lava-se a mucosa 3-4 vezes com tampão arrefecido com gelo de quelação para remover detritos e vilosidades. </li><li> Cubra a mucosa com tampão de quelação EDTA 2 preparada na hora (200 mL de 0,5 M EDTA em 49,6 ml de tampão de quelação). </li><li> Coloque a placa de Petri no gelo e agitar suavemente durante 30 min num agitador orbital horizontal. </li><li> Lavar o tecido 3-4 vezes com tampão de quelação gelada sem EDTA. Após a lavagem, deixar a mucosa em tampão de quelação gelada. </li><li> Processar a mucosa sob um microscópio de dissecação usando uma pinça curva e multa. Raspe o mucosa para libertar criptas intestinais utilizando a pinça curvos. </li><li> Remova cuidadosamente a suspensão cripta da placa de Petri usando um pipette e transferi-lo para um tubo de 50 ml. NOTA: verificar o tecido para se certificar de que quase todas as criptas foram removidas a partir da mucosa. </li><li> Filtra-se a suspensão através de criptas a 150 mm de malha 2 vezes. Nota: Verifique o flow-through para o enriquecimento cripta sob um microscópio (Figura 2D). </li><li> Centrifugar a suspensão cripta 5 min a 50 xg, 4 ° C. Descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em 5 ml de tampão arrefecido com gelo de quelação. </li><li> Contar o número de criptas por queda de 10 ul da suspensão do passo 2.15. Transferir o número de criptas necessários para chapeamento de um tubo de 5 mL de fundo redondo. Use 200 a 500 criptas por poço de um prato de 24 cavidades para estabelecer enteroids ou colonoids. </li><li> Centrifugar a fracção cripta durante 10 min a 150 g, 4 ° C. Remover o sobrenadante. </li><li> Use criptas para a cultura subseqüente. </li></ol> 3. Crypt Isolamento de Biópsia <ol><li> Prepare todos os reagentes antes dainício da experiência. Descongelar a matriz da membrana basal em gelo e pré-incubar uma placa de 24 cavidades em uma incubadora de CO 2 a 37 ° C. </li><li> Lava-se a biópsia com gelado de Dulbecco tamponada com fosfato salino sem Ca 2+ e Mg 2+ (DPBS). </li><li> Utilizando 0,1 mm de diâmetro minutien pinos, garantir a biópsia sobre uma placa de Petri de vidro revestidas com silicone preenchida com DPBS gelado. Esticar e fixar a mucosa plana com o lado da mucosa voltada para cima (Figura 2E). </li><li> Raspe a superfície da mucosa com pinças curvas para remover detritos e vilosidades. Este passo é necessário para melhorar a qualidade da preparação. </li><li> Lava-se a biópsia 3-4 vezes com tampão arrefecido com gelo de quelação para remover detritos e vilosidades. </li><li> Cubra a biópsia com tampão de quelação EDTA 2 preparada na hora (200 mL de 0,5 M EDTA em 49,8 ml de tampão de quelação). </li><li> Coloque a placa de Petri no gelo e agitar suavemente durante 30 min num agitador orbital horizontal. </li> &lt;li&gt; Lavar a biópsia 3-4 vezes com tampão de quelação gelada sem EDTA. Após a lavagem, deixar a biópsia em tampão de quelação gelada. </li><li> Processar a biópsia sob um microscópio de dissecação usando uma pinça curva e multa. Raspe a mucosa para liberar as criptas intestinais usando uma pinça curva. </li><li> Remova cuidadosamente a suspensão cripta da placa de Petri com uma pipeta e transferi-lo para um tubo de 50 ml. NOTA: verificar o tecido para se certificar de que quase todas as criptas foram removidas a partir da mucosa. </li><li> Filtra-se a suspensão através de uma cripta de nylon de 150 um de malha 2 vezes. Nota: Verifique o flow-through para o enriquecimento cripta sob um microscópio. </li><li> Centrifugar a suspensão cripta 5 min a 50 xg, 4 ° C. Descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão arrefecido com gelo de quelação. Transferir a suspensão cripta de um tubo de 1,5 mL de microcentrífuga. </li><li> Centrifugar a fracção cripta durante 10 minutos a 150 xg, a 4 ° C. Remover o sobrenadante. &lt;/ Li&gt; <li> Use criptas para a cultura subseqüente. </li></ol> 4. Crypt Cultura em Basement Membrane Matrix <ol><li> Usando pontas de pipetas pré-refrigerados, colocar o agregado de crypt (a partir do passo 2.18 ou 3.15) na matriz da membrana basal (200 a 500 criptas / matriz da membrana basal 50 ul). </li><li> Aplicar 50 ul de suspensão cripta na matriz da membrana basal por poço na placa pré-aquecida. Lentamente ejectar a matriz da membrana basal no centro do poço. </li><li> Colocar a placa de 24 cavidades em uma de 37 ° C, 5% de CO2 durante 30 min para permitir uma polimerização completa da matriz da membrana basal. </li><li> Overlay a matriz da membrana basal com 500 mL de meio minigut humano completo suplementado com 2,5 mM CHIR99021 (1: 4000 diluição de 10 estoque mM) e 2,5 mM Thiazovivin (1: 4000 diluição de estoque 10 mM). </li><li> Incubar a placa em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Substituir o meio com huma completo frescon minigut média a cada 2 dias. </li></ol> 5. Passaging de Cultivadas Enteroids e Colonoids. NOTA: Passage Enteroids e Colonoids cada 7 a 10 dias após o início do cultivo. Geralmente, dividir um bem em 3-4 poços. <ol><li> Preparar todos os reagentes antes do início da experiência. Descongelar a matriz da membrana basal em gelo e pré-incubar uma placa de 24 cavidades em uma incubadora de CO 2 a 37 ° C. </li><li> Remova a mídia usando dicas estéreis e sobreposição com 1 ml de DPBS geladas. </li><li> Pipeta para trás e para a frente com uma ponta de 1.000 l. Transferir a solução em um novo tubo cónico de 15 ml. </li><li> Adicionar 2 ml de meio minigut humano suplementado com 5% de FBS por 1 ml de meio. </li><li> Centrifuga-se a solução durante 5 min a 50 xg, 4 ° C. Descartar o sobrenadante. </li><li> Ressuspender o sedimento com 2 mL de enzima de dissociação de células suplementadas com 10 uM Y-27632 (1: 1000 de diluição de estoque 10 mM). Incubar por 5 mno a 37 ° C em um banho de água. </li><li> Dissociar os aglomerados de células usando a 3 ml Luer-Lock seringa equipada com um 18-G enchimento / agulha romba. Pipeta suavemente a solução para trás e para a frente utilizando a seringa 10 vezes. </li><li> Centrifuga-se a suspensão durante 5 minutos a 500 xg, a 4 ° C. Descartar o sobrenadante. </li><li> Usando pontas de pipetas de pré-refrigerada, ressuspender o sedimento celular em matriz de membrana basal. </li><li> Aplicar 50 ul de suspensão cripta na matriz da membrana basal por poço na placa pré-aquecida. Lentamente ejectar a matriz da membrana basal no centro do poço. </li><li> Colocar a placa de 24 cavidades em uma de 37 ° C, 5% de CO2 durante 20 min para permitir uma polimerização completa da matriz da membrana basal. </li><li> Overlay a matriz da membrana basal com 500 mL de meio minigut humano completo suplementado com 10 mM Y-27632 (1: 1000 diluição de estoque 10 mM). </li><li> Incubar a placa em uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2. </li><li> Após 2 dias, Substituir o meio com meio completo minigut humano fresco suplementado com 10 uM Y-27632 (1: 1000 de diluição de estoque 10 mM). Depois disso, substituir o meio com fresco, meio completo minigut humano todos os dias. </li></ol> 6. Congelamento de Cultivadas Enteroids e Colonoids NOTA: Normalmente, congelar um poço em 2-3 cryovials. <ol><li> Repita os passos de 5,1-5,8. </li><li> Ressuspender o sedimento com meio frio. Transferir 1 ml de solução em um frasco de congelação congelando marcado. Inserir o frasco de congelação num recipiente de congelamento contendo 500 ml de álcool isopropílico. </li><li> Transferir o recipiente de congelamento a 80 ° C um congelador durante 24 h, em seguida, transferir criotubo para armazenamento em azoto líquido. NOTA: Loja Enteroids e Colonoids por até 1 ano. </li></ol>

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</ol>

The authors have nothing to disclose.

Este método oferece um sistema completo de reprodução de linhagens epiteliais do intestino e dinâmicas epiteliais, que constituem uma ferramenta útil para estudar biologia epitelial intestinal. O método aqui apresentado foi adaptado a partir do estudo original de murino por Sato e Clevers 22, que de forma eficiente resulta em enteroids humanos e colonoids. Aqui, nós colhidos manualmente até as criptas por microdissection para evitar quaisquer contaminantes celulares. Este método permite uma visualização direta das criptas e leva a horas extras consistência em relação à coleta cripta original por &quot;agitação&quot;. Outros grupos desenvolveram técnicas similares usando abordagens ligeiramente diferentes especialmente substituindo a quelação pelo EDTA com colagenase 25. Além das diferenças de recolha cripta, essas técnicas usam um meio definido que é necessário para crescer as enteroids humanos em cultura 22. Para aumentar a eficiência de crescimento a cripta semeadura, nós adicionamos um inibidor da GSK3 (CHIR99021)para os dois primeiros dias 12. A manipulação do tecido ou biópsias é importante e o isolamento cripta deve ser realizado logo que o tecido chega ao laboratório. No entanto, o isolamento e cultura cripta retardada pode ser realizada até 24 horas após a recolha de tecidos (dados não mostrados) tal como anteriormente descrito para o tecido 26 de murino. O tecido intestinal deve ser colocada num tubo cónico completamente preenchido com DPBS para evitar a ruptura de tecido e deve ser mantida a 4 ° C. A preparação atrasada permite o transporte do tecido, mas a variação de temperatura deve ser evitada durante o transporte. O tempo total necessário para o plaqueamento inicial cripta é de aproximadamente 2 horas com 15 a 30 min para processar o tecido e 1 a 2 horas para isolar e placa da cripta. O microdissection do tecido é um determinante crítico e predicado de uma preparação cripta limpo. No entanto, a liberação cripta por mão-agitando como descrito em vários protocolos é possível 22,23. Apesar das semelhanças com o sistema enteroid murino (enteroids), os enteroids humanos exigem moléculas específicas para aumentar e sustentar seu crescimento ao longo do tempo. Os factores de crescimento, EGF, Noggin, R-espondina são utilizados de forma semelhante para os Organóides epiteliais murino. No entanto, o uso de Wnt-3A é crítica. Observou-se que a formação, bem como a eficiência do crescimento é maior utilizando um meio condicionado de Wnt-3A do que a proteína humana recombinante. Concomitantemente, que demonstrou melhoria das condições de cultura utilizando um inibidor da glicogénio sintase quinase 3 (CHIR99021) 12. Factores de crescimento recombinantes que podem ser substituídos por Wnt-3A, R-espondina, e Noggin condicionado meios. Uma linha de células L expressando Wnt-3A-se comercialmente disponível (ATCC). Outros grupos desenvolveram R-1- espondina 23,27, Noggin- 19, e Wnt-3A / R-spondin3 / Noggin- 28 linhas celulares que expressam. Dois inibidores de moléculas pequenas são utilizadas na cultura mediâmetro e são necessários para a manutenção da cultura 29. A-83-01 é um inibidor selectivo do factor de transformação de crescimento β e receptores de Activina / nodais (activina-quinase semelhante a 4, 5, 7) e SB202190 é um inibidor de proteína quinase p38 mitogen-activated (MAPK). Ambos os inibidores foram utilizados, respectivamente, para sustentar humana induzida células-tronco pluripotentes auto-renovação e estabelecer células pluripotentes ingênuos humanos tronco 30-32. Além disso, a nicotinamida, um precursor de dinucleótido nicotinamida adenina, é necessária para manter enteroids e expansão colonoids de forma a longo prazo 22,29. A quelação de EDTA é um passo importante, uma vez que determina o rendimento a partir da preparação da cripta. Temos sido bem sucedidos com 2 tratamento EDTA mM. No entanto, a concentração de EDTA pode ser modificado a partir de 2 mM a 15 mM em relação ao tipo de tecido. Nesse caso, o tempo de incubação tem que ser determinado empiricamente. Após a colocação inicial, a cripta vai arredondar-up e, eventualmente, formar enteroids. No entanto, os enteroids ou colonoids muitas vezes demonstram um fenótipo &quot;tronco&quot;, formando esferas com pouco ou nenhum células diferenciadas. Nesse caso, a diferenciação pode ser iniciada através da retirada de Wnt-3A, nicotinamida e o inibidor de p38 MAPK. O uso de inibidor de Notch, como DAPT ou DBZ ajuda a reforçar a diferenciação dentro dos enteroids 22. Este modelo recapitula a fisiologia intestinal com eventos de brotamento cripta contínuas decorrentes de um compartimento de células estaminais, bem como domínios epiteliais vilo-como contendo tanto de absorção e secreção diferenciadas linhagens. Curiosamente, este sistema não contém células mesenquimais e usa condições de mídia específicos para atender às exigências de sinal nicho. Como o modelo de murino, enteroids humanos podem ser gerados a partir de células epiteliais intestinais isoladas para testar a capacidade das referidas células para funcionar como uma célula estaminal. Several estudos usaram conjunto de marcadores de diferenciação (CD44, CD24 ou CD166) e células positivas EphB2 para enriquecimento em células estaminais com propriedades 12,23,33. Juntos, estes estudos demonstram a utilidade de enteroids humanos culturas para testar a stemness. Outros pesquisadores estão usando esse modelo para investigar doenças intestinais, como doenças infecciosas diarréicas, fibrose cística, ou câncer colorretal 22,34-37. Estes estudos demonstram que enteroids humanos constituem um modelo da doença humana confiável, com uma possibilidade de avançar para uma triagem personalizado. Enteroids humanos podem ser geneticamente modificadas utilizando transfecção de DNA ou a infecção com 38 partículas virais. Isto proporciona uma ferramenta poderosa para estudar as funções específicas do gene dentro das Organóides epiteliais humanas ou corrigir mutações genéticas. Recentemente, Cambaleas e colegas demonstraram a possibilidade de modificar o genoma com o sistema CRISPR / Cas9 e corrigir a mutação no gene de CFTR causando acfibrose ystic 24. Enteroids Humanos constituem um sistema valioso para estudar células-tronco intestinal e biologia da mucosa epitelial e servir como um sistema experimental novela para estudar fisiologia gastrointestinal normal e anormal.

O epitélio de revestimento do trato gastrointestinal está em constante renovação. Este processo é desencadeado por proliferação de células estaminais intestinais (ISC), que produzem continuamente descendência para substituir rapidamente o epitélio intestinal, uma vez que se vira. O compartimento proliferativa compreendendo os ISC está confinada à parte inferior das criptas. As ISC dar origem a descendência que eventualmente se diferenciar em linhagens de absorção ou secreção. Saindo da cripta e para o vilo ou superfície do epitélio, as células diferenciam-se progressivamente à medida que migram para cima antes de esfoliação para o lúmen 1. ISC dar origem a todos os tipos de células epiteliais do intestino incluindo enterócitos, células microfold, células enteroendócrinas, células caliciformes, células topete e células de Paneth. O cólon é caracterizada por criptas alongadas composta principalmente de colonócitos e células caliciformes, com enteroendï¿½rina dispersa e células topete 2. Ex vivo culsistemas tura constituem ferramenta promissora para o estudo de manutenção ISC e homeostase do tecido intestinal. No entanto, é difícil contar com técnicas de cultura de tecidos como condições fisiológicas não são inteiramente reproduzida e o microambiente epitelial, muitas vezes alterados 3,4. Um grande avanço no campo ISC foi o estabelecimento de técnicas de cultura de tecidos para manter e expandir ISC murino individuais utilizando fatores de crescimento definidas para substituir os sinais de nicho intestinal normal. Condições de cultura a longo prazo foram descritos por Sato et al., Em que criptas individuais ou isolados a partir de células estaminais do epitélio intestinal crescer para formar estruturas epiteliais 3-dimensional, incluindo vários domínios das criptas do tipo 5-7. Estas estruturas tridimensionais sofrer eventos de fissão para expandir continuamente. Curiosamente, todos os tipos de células intestinais específicas para o tecido de origem são produzidos e assim são extrudidas em um lúmen 8. Utilizando modificações deste sistema, epitelialOrganóides pode ser gerado a partir do estômago, intestino delgado e cólon. Mais especificamente, Organóides epiteliais do intestino delgado são enteroids 9, e os do cólon são colonoids 9,10. Esses sistemas de cultura organï¿½de epiteliais foram usadas para testar a capacidade das células individuais isoladas funcionar como células estaminais in vitro, testando assim a &quot;stemness&quot; de células isoladas 5,6,10-15. Outros pesquisadores utilizaram ambos enteroids e colonoids para estudar a função das células epiteliais individuais 16-21. Assim, culturas enteroid colonoid e pode ser utilizado para avaliar ambas as funções estaminais e células não estaminais e dar uma nova visão em interacções celulares fundamentais dentro dos intestinos. Em 2011, Sato e colegas gerado cultura de longo prazo de Organóides epiteliais derivadas do intestino delgado e cólon 22,23 humano. Além das diferenças na composição da mídia, os enteroids epiteliais humanase colonoids apresentam as mesmas características que o seu homólogo murino. Além disso, eles podem ser gerados a partir de tecidos doentes, tais como esófago, adenoma ou adenocarcinoma de Barrett, e fibrose cística 22,24. Enteroids humanos constituem um sistema valioso para estudar de células-tronco da mucosa intestinal e da biologia epitelial e servir como um novo sistema experimental para estudar a fisiologia gastrointestinal tanto normal como anormal 3. Aqui, descrevemos métodos para estabelecer enteroids e colonoids de intestino delgado humano e criptas do cólon (Figura 1). Nesta revisão metodológica, enfatizamos a coleção cripta do tecido inteiro e biópsias. Nós recapitular as modalidades de cultura que são essenciais para o crescimento bem sucedido e manutenção de enteroids e colonoids humanos e as possíveis estratégias experimentais realizados por este modelo.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate buffered saline Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;, Mg&lt;sup&gt;2+ &lt;/sup&gt;free (DPBS)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td></td></tr><tr><td>Sorbitol</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP439-500</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Gzntamycin/Amphotericin B solution</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>R-015-10</td><td></td></tr><tr><td>Wnt-3A conditioned medium</td><td>in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>12634-028</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (glutamine)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>15140-148</td><td></td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>N-Acetylcysteine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165-5G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotidamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, GFR, Phenol free (basement membrane matrix)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>human recombinant Noggin</td><td>R&amp;amp;D</td><td>6057-NG/CF</td><td></td></tr><tr><td>human recombinant R-Spondin</td><td>Preprotech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>human recombinant EGF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9644-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>A-83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067-5MG</td><td></td></tr><tr><td>human [Leu]15-Gastrin 1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9145-.1MG</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red (cell dissociation enzyme)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>CTS Synth-a-Freeze Medium (freezing medium)</td><td>Life technologies; Gibco</td><td>A13713-01</td><td></td></tr><tr><td>L Wnt-3A cell line</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>Renilla luciferase assay</td><td>Promega</td><td>E2710</td><td></td></tr><tr><td>human recombinant Wnt-3A</td><td>R&amp;amp;D</td><td>5036-WN/CF</td><td></td></tr><tr><td>HEK293 TOPflash cell line</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) and progeny that progressively migrate and differentiate toward the tip of the villi. These processes, essential for gastrointestinal homeostasis, have been extensively studied using multiple approaches. Ex vivo technologies, especially primary cell cultures have proven to be promising for understanding intestinal epithelial functions. A long-term primary culture system for mouse intestinal crypts has been established to generate 3-dimensional epithelial organoids. These epithelial structures contain crypt- and villus-like domains reminiscent of normal gut epithelium. Commonly, termed &#8220;enteroids&#8221; when derived from small intestine and &#8220;colonoids&#8221; when derived from colon, they are different from organoids that also contain mesenchyme tissue. Additionally, these enteroids/colonoids continuously produce all cell types found normally within the intestinal epithelium. This in vitro organ-like culture system is rapidly becoming the new gold standard for investigation of intestinal stem cell biology and epithelial cell physiology. This technology has been recently transferred to the study of human gut. The establishment of human derived epithelial enteroids and colonoids from small intestine and colon has been possible through the utilization of specific culture media that allow their growth and maintenance over time. Here, we describe a method to establish a small intestinal and colon crypt-derived system from human whole tissue or biopsies. We emphasize the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

A Figura 2D mostra um exemplo típico de criptas recentemente isoladas a partir de tecido inteiro (Figura 2D). O número de criptas isolados a partir de uma biópsia é mais baixa do que no tecido todo. Utilizando uma pinça de biópsia capacidade padrão com agulha, que costumam fazer duas mordidas de biópsia em uma única passagem. Cada biopsia de mordida resulta numa superfície de 10 milímetros 2 com uma média de 50 a 100 criptas por biópsia (Figura 2F). Depois de cultura na matriz da membrana basal, as criptas completam para formar enterospheres para intestino delgado e colonospheres para dois pontos. A cripta brotamento geralmente ocorre dentro de 5 a 6 dias, após a semeadura. No entanto, não é incomum ver tanto enteroids (enteroids) ou colonoids (colonoids) formando esferas na matriz da membrana basal (Figura 3A-C; Filme 1). O passaging pode ser feito depois de 7 dias, dependendo do tamanho dos enteroids. O enteroids ou colonoids establtada a partir de biópsias de submeter o mesmo desenvolvimento em cultura. No entanto, como a densidade cripta de sementeira é menor, o passaging é feito geralmente após 10 a 12 dias de cultura (Figura 4a, b). Enteroids colonoids culturas e expandir de uma maneira reprodutível. Ambos os enteroids e colonoids apresentar um lado luminal e são revestidas com um epitélio (Figura 5A, B). Células proliferativas pode ser observado dentro dos enteroids e está localizado dentro das pontas de gemas (Figura 5C, D). Imagem confocal de enteroids manchadas de E-caderina (Ecad) mostra as células epiteliais (Figura 5E). Ambos enteroids e colonoids pode ser estabelecida a partir de tecido obtidos de pacientes com doenças genéticas / congênitas. A Figura 6 mostra enteroids representativos que crescem de uma paciente com fibrose cística (Figura 6A) e uma enteropatia acolchoamento devido a uma mutação congênita no anúncio de células epiteliaisgene da molécula hesion (EpCAM) (Figura 6B). Ao lado do defeito genético, as enteroids não apresentam diferenças na condição basal. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig1highres.jpg" /> Figura 1. Fluxo de Trabalho de criptas dissociação e geração de enteroids humanos e colonoids em cultura. Crypts (do intestino delgado ou do cólon humano) são isolados por quelante EDTA. Criptas cultivadas formar enteroids para o intestino delgado e colonoids para o cólon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig2highres.jpg" /> Figura 2. Processo de dissecação para o isolamento cripta. (A) O intestino pequeno specimen é esticado e preso plana em uma placa de Petri com revestimento de silicone. (B) A mucosa é separada a partir da submucosa subjacente. (C) A mucosa dissecada é esticado e preso liso para um prato de Petri com revestimento de silicone. (D) Depois quelante EDTA, as criptas são isoladas a partir do tecido. (E) Uma biópsia é esticado e preso plana em uma placa de Petri com revestimento de silicone. (F) Depois de quelante EDTA, criptas são isolados da biópsia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig2large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig3highres.jpg" /> Figura 3. cultura Crypt e enteroid humano e geração colonoid a partir de tecido inteiro. (A) criptas Jejuno banhados na matriz da membrana basal após isolamento. As criptas estão fechando-se depois de 3 a 4 horas e começar a inflar-se para formar enterospheres além deste tempo. Aos 7 dias, os enteroids jejunais são formados. (B) Após o isolamento e cultura, as criptas do íleo se comportam como as criptas do jejuno e íleo formar enteroids. (C) criptas colônicas são banhados em matriz da membrana basal após o isolamento. As criptas próximos e formulário colonoids após 7 dias (barras de escala: 100 m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig4highres.jpg" /> Figura 4. cultura Crypt e enteroid humano e geração colonoid de biópsia. (A) criptas duodenais banhados em matriz da membrana basal após o isolamento. As criptas estão fechando-se depois de 3 a 4 horas e começar a inflar-se Beyond este tempo para formar enterospheres. Aos 7 dias, os enteroids são formados. (B) Após o isolamento e cultura, criptas do cólon são plaqueadas em matriz de membrana basal. As criptas fechar-se para formar colonospheres então colonoids após 7 dias (barras de escala: 100 m). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig5highres.jpg" /> Figura 5. linhagens intestinais dos enteroids humanos. (A) enteroid humano após 6 dias em cultura. (B) secções com Hematoxilina-eosina dos enteroids em (A) demonstram o revestimento epitelial (Barras de escala: 100 uM). (CD) de imagem confocal de enteroids após coloração EdU (magenta) mostra a presença de células proliferativas. (E </strong&gt;) imagem confocal de enteroids demonstra a presença de: E-caderina em células epiteliais (ECAD, verde) (Escala:. 50 mm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig5large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52483/52483fig6highres.jpg" /> Figura 6. cultura cripta e geração enteroid humano a partir de tecido doente. (A) Enteroids estabelecida a partir de um espécime de fibrose cística. (B) Enteroids estabelecida a partir de uma amostra congênitas acolchoamento enteropatia (barras de escala: 100 mm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/52483fig6large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> Filme 1. Enterosphere formando enteroid humano em cultura. 32 hr de tempo voltase filme mostra um enterosphere estabelecida a partir de intestino delgado humano retraindo para formar um enteroid na cultura. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/52483/Movie1_v2.mp4" target="_blank">Por favor clique aqui para ver este vídeo.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Nome do Reagente </td><td> Companhia </td><td> Número de Catálogo </td><td> Solvente </td><td> Da Concentração </td><td> Concentração final </td><td> Comentário </td></tr><tr><td> Fosfato de Dulbecco solução salina tamponada Ca 2+, Mg 2+ livre (DPBS) </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> 14190-144 </td><td> - </td><td> - </td><td> 1x </td><td></td></tr><tr><td> Etilenodiamina ácido tetra-acético (EDTA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 431788 </td><td> Ultrapura dH2O </td><td&gt; 0,5 M </td><td> 2 mM </td><td></td></tr><tr><td> Sorbitol </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP439-500 </td><td> DPBS </td><td> Pó </td><td> 2% </td><td></td></tr><tr><td> Sacarose </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP220-1 </td><td> DPBS </td><td> Pó </td><td> 1% </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino (BSA) Fracção V </td><td> Fischer Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td> DPBS </td><td> Pó </td><td> 1% </td><td></td></tr><tr><td> Solução Gzntamycin / Anfotericina B </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> R-015-10 </td><td> - </td><td> 500x </td><td> 1x </td><td></td></tr><tr><td> Wnt-3A conditionned médio </td><td> em casa </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> Avançada DMEM / F12 </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> 12634-028 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> HEPES 1M </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> 15630-080 </td><td> - </td><td> 1 H </td><td> 10 mM </td><td></td></tr><tr><td> GlutaMAX (glutamina) </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> 35050-061 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina (10.000 U / ml) </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> 15140-148 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> N2 Suplemento </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> 17502-048 </td><td> - </td><td> 100X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> B27 Supplement </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> 17504-044 </td><td> - </td><td> 50X </td><td> 1X </td><td></td></tr><tr><td> N-Acetilcisteína </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A9165-5G </td><td> DPBS </td><td> 1 H </td><td> 1 mM </td><td> &lt;/ Td&gt; </tr><tr><td> Nicotidamide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N0636 </td><td> DPBS </td><td> 1 H </td><td> 10 mM </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel, GFR, Fenol (matriz da membrana basal) livre </td><td> Corning </td><td> 356231 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> NECESSÁRIO </td></tr><tr><td> Noggin humana recombinante </td><td> R &amp; D </td><td> 6057-NG / CF </td><td> DPBS </td><td> 100 ug / ml </td><td> 100 ng / ml </td><td rowspan="3"> Outros fornecedores: I &amp; D; Anaspec e PreproTech </td></tr><tr><td> humano recombinante R-espondina </td><td> PreproTech </td><td> 120-38 </td><td> DPBS </td><td> 1 mg / ml </td><td> 1 ug / ml </td></tr><tr><td> EGF humano recombinante </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E9644-.2MG </td><td> DBPS </td><td> 500 ug / ml </td><td> 50 ng / mL </td></tr><tr><td> Y-27632 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> Y0503-1MG </td><td> DPBS </td><td> 10 mM </td><td> 10 uM </td><td></td></tr><tr><td> A-83-01 </td><td> Tocris </td><td> 2939 </td><td> DMSO </td><td> 500 uM </td><td> 500 nM </td><td></td></tr><tr><td> SB202190 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S7067-5MG </td><td> DMSO </td><td> 30 mM </td><td> 10 uM </td><td></td></tr><tr><td> humano [Leu] 15 1-Gastrina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G9145-.1MG </td><td> DPBS </td><td> 100 uM </td><td> 10 nM </td><td></td></tr><tr><td> CHIR99021 </td><td> Stemgent </td><td> 04-0004 </td><td> DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 2,5 uM </td><td></td></tr><tr><td> Thiazovivin </td><td> Stemgent </td><td> 04-0017 </td><td> DMSO </td><td> 10 mM </td><td> 2,5 uM </td><td></td></tr><tr><td> TrypLE expresso Enzima (1X), vermelho de fenol (enzima de dissociação de células) </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> 12605-010 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Para passaging </td></tr><tr><td> Soro Bovino Fetal </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> 10082-147 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Para passaging </td></tr><tr><td> CTS Synth-a-Freeze (meio de congelamento) Medium </td><td> Tecnologias da vida; Gibco </td><td> A13713-01 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Para congelamento </td></tr><tr><td> Linha de células L Wnt-3A </td><td> ATCC </td><td> CRL-2647 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Wnt-3A conditionned produção de mídia </td></tr><tr><td> Ensaio de luciferase de Renilla </td><td> Promega </td><td> E2710 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Wnt-3A conditionned atividade de mídia </td></tr><tr><td> humano recombinante Wnt-3A </td><td> R &amp; D </td><td> 5036-WN / CF </td><td> DPBS </td><td> 100 ug / ml </td><td> 100 ng / ml </td><td&gt; Wnt-3A conditionned atividade de mídia </td></tr><tr><td> Linha celular HEK293 TOPflash </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> Wnt-3A conditionned atividade de mídia; Presente de Hans Clevers laboratório </td></tr></tbody></table> Tabela 1. lista detalhada com reagente fabricante preferido e número de catálogo. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Equipamento </td><td> Consumível </td><td> Ferramentas </td></tr><tr><td> Câmara de fluxo laminar </td><td> 15 e 50 ml tubos cônicos </td><td> Dumont # 5 fórceps padrão (FST; # 11251-20) </td></tr><tr><td> CO 2 Incubadora </td><td> Tubos de microcentrífuga </td><td> Dumont # 7, uma pinça fina curvas (FST; # 11274-20) </td></tr><tr><td> Stereo-microscópio </td><td> Placas de 24 poços </td><td> Tesoura fina (FST; # 14060-09) </td></tr><tr&gt; <td> Centrifugador </td><td> Filtros de 0,22 um (Sartorius) </td><td> Tesoura primavera Vannas (FST; # 15018-10) </td></tr><tr><td> Shaker Orbital </td><td> Pipetas sorológicas </td><td> Minutien diâmetro dos pinos 0,2 milímetros (FST; # 26002-20) </td></tr><tr><td> Recipiente de congelamento (Nalgene) </td><td> Dicas micropipeta </td><td> Diâmetro minutien pinos 0,1 milímetros (FST; # 26002-10) </td></tr><tr><td> Sylgard 184 de silicone (Dow Corning) </td><td> 150 mm aberturas de malha, uma triagem de nylon (Aqua-fornecimento dinâmico) </td><td></td></tr><tr><td> Vidro placa de Petri </td><td> 5 ml tubos de polipropileno de fundo redondo (Falcon) </td><td></td></tr><tr><td> Pipeta sorológica </td><td> 18G agulha de preenchimento sem corte (BD) </td><td></td></tr><tr><td> Micropipeta </td><td> 3 ml lsyringes com pontas Luer-Lock (BD) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> Cryovials </td><td></td></tr></tbody></table><strong&gt; Tabela 2. detalhada de consumo, ferramentas e equipamentos necessários para o isolamento das criptas e da cultura.

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Establishment of Human Epithelial Enteroids and Colonoids from Whole Tissue and Biopsy

We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

Estabelecimento de epiteliais humanas Enteroids e Colonoids de tecido inteiro e biópsia

The epithelium of the gastrointestinal tract is constantly renewed as it turns over. This process is triggered by the proliferation of intestinal stem ...

establishment-human-epithelial-enteroids-colonoids-from-whole-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

34.8K visualizações.  Cincinnati Children's Hospital Medical Center. We describe a method to establish human enteroids from small intestinal crypts and colonoids from colon crypts collected from both surgical tissue and biopsies. In this methodological article, we present the culture modalities that are essential for the successful growth and maintenance of human enteroids and colonoids.

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Real-time Measurement of Epithelial Barrier Permeability in Human Intestinal Organoids

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted in sophisticated in vitro models of the intestinal mucosa. Leveraging these emerging model systems will require adaptation of tools and techniques developed for 2D culture systems and animals. Here, we describe a technique for measuring epithelial barrier permeability in human intestinal organoids in real-time. This is accomplished by microinjection of fluorescently-labeled dextran and imaging on an inverted microscope fitted with epifluorescent filters. Real-time measurement of the barrier permeability in intestinal organoids facilitates the generation of high-resolution temporal data in human intestinal epithelial tissue, although this technique can also be applied to fixed timepoint imaging approaches. This protocol is readily adaptable for the measurement of epithelial barrier permeability following exposure to pharmacologic agents, bacterial products or toxins, or live microorganisms. With minor modifications, this protocol can also serve as a general primer on microinjection of intestinal organoids and users may choose to supplement this protocol with additional or alternative downstream applications following microinjection.

This protocol describes the measurement of epithelial barrier permeability in real-time following pharmacologic treatment in human intestinal organoids using fluorescent microscopy and live cell microscopy.

Medição em tempo real da permeabilidade da barreira epitelial no Organoids Intestinal humana

Advances in 3D culture of intestinal tissues obtained through biopsy or generated from pluripotent stem cells via directed differentiation, have resulted ...

Biologia do Desenvolvimento

A Novel Human Epithelial Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human intestinal epithelium, leading to increased intestinal permeability, impaired restitution, and increased cell death. Although there are numerous animal models of NEC, response to injury and therapeutic interventions may be highly variable between species. Furthermore, it is ethically challenging to study disease pathophysiology or novel therapeutic agents directly in human subjects, especially children. Therefore, it is highly desirable to develop a novel model of NEC using human tissue. Enteroids are 3-dimensional organoids derived from intestinal epithelial cells. They are ideal for the study of complex physiologic interactions, cell signaling, and host-pathogen defense. In this manuscript we describe a protocol that cultures human enteroids after isolating intestinal stem cells from patients undergoing bowel resection. The crypt cells are cultured in media containing growth factors that encourage differentiation into the various cell types native of the human intestinal epithelium. These cells are grown in a synthetic, collagenous mix of proteins that serve as a scaffold, mimicking the extra-cellular basement membrane. As a result, enteroids develop apical-basolateral polarity. Co-administration of lipopolysaccharide (LPS) in media causes an inflammatory response in the enteroids, leading to histologic, genetic, and protein expression alterations similar to those seen in human NEC. An experimental model of NEC using human tissue may provide a more accurate platform for drug and treatment testing prior to human trials, as we strive to identify a cure for this disease.

Enteroids are emerging as a novel model in the study of human disease. The protocol describes how to simulate an enteroid model of human necrotizing enterocolitis using lipopolysaccharide (LPS) treatment of enteroids generated from neonatal tissue. Collected enteroids demonstrate inflammatory changes akin to those seen in human necrotizing enterocolitis.

Um novo modelo Enteroid epitelial humana de enterocolite necrosante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease of newborn infants. It is characterized by multiple pathophysiologic alterations in the human ...

Imunologia e Infecção

Human Colonoid Monolayers to Study Interactions Between Pathogens, Commensals, and Host Intestinal Epithelium

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal epithelium. Due to their closed structures and significant supporting extracellular matrix, 3D cultures are not ideal for host-pathogen studies. Enteroids or colonoids can be grown as epithelial monolayers on permeable tissue culture membranes to allow manipulation of both luminal and basolateral cell surfaces and accompanying fluids. This enhanced luminal surface accessibility facilitates modeling bacterial-host epithelial interactions such as the mucus-degrading ability of enterohemorrhagic E. coli (EHEC) on colonic epithelium. A method for 3D culture fragmentation, monolayer seeding, and transepithelial electrical resistance (TER) measurements to monitor the progress towards confluency and differentiation are described. Colonoid monolayer differentiation yields secreted mucus that can be studied by the immunofluorescence or immunoblotting techniques. More generally, enteroid or colonoid monolayers enable a physiologically-relevant platform to evaluate specific cell populations that may be targeted by pathogenic or commensal microbiota.

Here, we present a protocol to culture human enteroid or colonoid monolayers that have intact barrier function to study host epithelial-microbiota interactions at the cellular and biochemical level.

Colonoid humana monocamadas para estudar interações entre epitélio Intestinal do hospedeiro, comensais e patógenos

Human 3-dimensional (3D) enteroid or colonoid cultures derived from crypt base stem cells are currently the most advanced ex vivo model of the intestinal ...

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Co-Cultura de Organoides Epiteliais do Intestino Delgado Murine com Células Linfoides Inatas

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have recently emerged as a promising system to model gastrointestinal pathologies. However, currently utilized methods for enteroid manipulation either lack access to the apical surface of the epithelium (three-dimensional [3D]) or are time-consuming and resource-intensive (two-dimensional [2D] monolayers). These methods often require additional steps, such as microinjection, for the model to become physiologically translatable. Here, we describe a physiologically relevant and inexpensive protocol for studying NEC in vitro by reversing enteroid polarity, resulting in the apical surface facing outward (apical-out). An immunofluorescent staining protocol to examine enteroid barrier integrity and junctional protein expression following exposure to tumor necrosis factor-alpha (TNF-&#945;) or lipopolysaccharide (LPS) under normoxic or hypoxic conditions is also provided. The viability of 3D apical-out enteroids exposed to normoxic or hypoxic LPS or TNF-&#945; for 24 h is also evaluated. Enteroids exposed to either LPS or TNF-&#945;, in combination with hypoxia, exhibited disruption of epithelial architecture, a loss of adherens junction protein expression, and a reduction in cell viability. This protocol describes a new apical-out NEC-in-a-dish model which presents a physiologically relevant and cost-effective platform to identify potential epithelial targets for NEC therapies and study the preterm intestinal response to therapeutics.

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

This protocol describes an apical-out necrotizing enterocolitis (NEC)-in-a-dish model utilizing small intestinal enteroids with reversed polarity, allowing access to the apical surface. We provide an immunofluorescent staining protocol to detect NEC-related epithelial disruption and a method to determine the viability of apical-out enteroids subjected to the NEC-in-a-dish protocol.

In vitro Modelo enteróide apical-out de enterocolite necrotizante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Medicina

Testing Epithelial Permeability in Fetal Tissue-Derived Enteroids

Human fetal tissue-derived enteroids are emerging as a promising in vitro model to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids exhibit polarity, consisting of a lumen with an apical border, tight junctions, and a basolateral outer layer exposed to growth media. The consequences of intestinal injuries include mucosal inflammation and increased permeability. Testing intestinal permeability in vulnerable preterm human subjects is often not feasible. Thus, an in vitro fetal tissue-derived intestinal model is needed to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids can be used to test changes in epithelial permeability regulated by tight junction proteins. In enteroids, intestinal stem cells differentiate into all epithelial cell types and form a three-dimensional structure on a basement membrane matrix secreted by mouse sarcoma cells. In this article, we describe the methods used for establishing enteroids from fetal intestinal tissue, characterizing the enteroid tight junction proteins with immunofluorescent imaging, and testing epithelial permeability. As gram-negative dominant bacterial dysbiosis is a known risk factor for intestinal injury, we used lipopolysaccharide (LPS), an endotoxin produced by gram-negative bacteria, to induce permeability in the enteroids. Fluorescein-labeled dextran was microinjected into the enteroid lumen, and serial dextran concentrations leaked into the culture media were measured to quantify the changes in paracellular permeability. The experiment showed that apical exposure to LPS induces epithelial permeability in a concentration-dependent manner. These findings support the hypothesis that gram-negative dominant dysbiosis contributes to the mechanism of intestinal injury in preterm infants.

This protocol details the establishment of enteroids, a three-dimensional intestinal model, from fetal intestinal tissue. Immunofluorescent imaging of epithelial biomarkers was used for model characterization. Apical exposure of lipopolysaccharides, a bacterial endotoxin, using microinjection technique induced epithelial permeability in a dose-dependent manner measured by the leakage of fluorescent dextran.

Testando a permeabilidade epitelial em enteroides derivados de tecido fetal

Human fetal tissue-derived enteroids are emerging as a promising in vitro model to study intestinal injuries in preterm infants. Enteroids exhibit ...

Organoid-Derived Epithelial Monolayer: A Clinically Relevant In Vitro Model for Intestinal Barrier Function

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations as the former do not faithfully represent original tissue physiology, and the availability of the latter is limited. Hence, their application hampers fundamental and drug development research. Adult stem-cell-based organoids (henceforth referred to as organoids) are miniatures of normal or diseased epithelial tissue from which they are derived. They can be established very efficiently from different gastrointestinal (GI) tract regions, have long-term expandability, and simulate tissue- and patient-specific responses to treatments in vitro. Here, the establishment of intestinal organoid-derived epithelial monolayers has been demonstrated along with methods to measure epithelial barrier integrity, permeability and transport,&#160;antimicrobial protein secretion, as well as histology. Moreover, intestinal organoid-derived monolayers can be enriched with proliferating stem and transit-amplifying cells as well as with key differentiated epithelial cells. Therefore, they represent a model system that can be tailored to study the effects of compounds on target cells and their mode of action. Although organoid cultures are technically more demanding than cell lines, once established, they can reduce failures in the later stages of drug development as they truly represent in vivo epithelium complexity and interpatient heterogeneity.

Here, we describe the preparation of human organoid-derived intestinal epithelial monolayers for studying intestinal barrier function, permeability, and transport. As organoids represent original epithelial tissue response to external stimuli, these models combine the advantages of expandability of cell lines and the relevance and complexity of primary tissue.

Monocameira epitelial derivada organoide: um modelo in vitro clinicamente relevante para a função da barreira intestinal

In the past, intestinal epithelial model systems were limited to transformed cell lines and primary tissue. These model systems have inherent limitations ...

Biologia

Generation of Murine Primary Colon Epithelial Monolayers from Intestinal Crypts

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in the continuity of this barrier can result in inflammatory disorders such as inflammatory bowel disease. One of the limitations in the study of intestinal epithelial biology has been the lack of primary cell culture models, which has obliged researchers to use model cell lines derived from carcinomas. The advent of three dimensional (3D) enteroids has given epithelial biologists a powerful tool to generate primary cell cultures, nevertheless, these structures are embedded in extracellular matrix and lack the maturity characteristic of differentiated intestinal epithelial cells. Several techniques to generate intestinal epithelial monolayers have been published, but most are derived from established 3D enteroids making the process laborious and expensive. Here we describe a protocol to generate primary epithelial colon monolayers directly from murine intestinal crypts. We also detail experimental approaches that can be used with this model such as the generation of confluent cultures on permeable filters, confluent monolayer for scratch wound healing studies and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

In this protocol, we describe how to generate murine primary epithelial colon monolayers directly from intestinal crypts. We provide experimental approaches to generate confluent monolayers on permeable filters, confluent monolayers for scratch wound healing and biochemical studies, and sparse and confluent monolayers for immunofluorescence analysis.

Geração de Monócamas Epiteliais de Cólon Primário Murine de Criptas Intestinais

The intestinal epithelium is comprised of a single layer of cells that act as a barrier between the gut lumen and the interior of the body. Disruption in ...

Culture Methods to Study Apical-Specific Interactions using Intestinal Organoid Models

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to external cues. Recent optimization of in vitro culture conditions allows for the re-creation of the intestinal stem cell niche and the development of advanced 3-dimensional (3D) culture systems that recapitulate the cell composition and the organization of the epithelium. Intestinal organoids embedded in an extracellular matrix (ECM) can be maintained for long-term and self-organize to generate a well-defined, polarized epithelium that encompasses an internal lumen and an external exposed basal side. This restrictive nature of the intestinal organoids presents challenges in accessing the apical surface of the epithelium in vitro and limits the investigation of biological mechanisms such as nutrient uptake and host-microbiota/host-pathogen interactions. Here, we describe two methods that facilitate access to the apical side of the organoid epithelium and support the differentiation of specific intestinal cell types. First, we show how ECM removal induces an inversion of the epithelial cell polarity and allows for the generation of apical-out 3D organoids. Second, we describe how to generate 2-dimensional (2D) monolayers from single cell suspensions derived from intestinal organoids, comprised of&#160;mature and differentiated cell types. These techniques provide novel tools to study apical-specific interactions of the epithelium with external cues in vitro and promote the use of organoids as a platform to facilitate precision medicine.

Here we present two protocols that allow the modeling of intestinal apical-specific interactions. Organoid-derived intestinal monolayers and Air-Liquid Interface (ALI) cultures facilitate the generation of well-differentiated epithelia accessible from both luminal and basolateral sides, whereas polarity-inverted intestinal organoids expose their apical side and are amenable to high throughput assays.

Métodos culturais para estudar interações específicas apical usando modelos organoides intestinais

The lining of the gut epithelium is made up of a simple layer of specialized epithelial cells that expose their apical side to the lumen and respond to ...

Generation and Characterization of Murine Oral Mucosal Organoid Cultures

The mucous lining covering the inside of our mouth, the oral mucosa, is a highly compartmentalized tissue and can be subdivided into the buccal mucosa, gingiva, lips, palate, and tongue. Its uppermost layer, the oral epithelium, is maintained by adult stem cells throughout life. Proliferation and differentiation of adult epithelial stem cells have been intensively studied using in vivo mouse models as well as two-dimensional (2D) feeder-cell based in vitro models. Complementary to these methods is organoid technology, where adult stem cells are embedded into an extracellular matrix (ECM)-rich hydrogel and provided with a culture medium containing a defined cocktail of growth factors. Under these conditions, adult stem cells proliferate and spontaneously form three-dimensional (3D) cell clusters, the so-called organoids. Organoid cultures were initially established from murine small intestinal epithelial stem cells. However, the method has since been adapted for other epithelial stem cell types. Here, we describe a protocol for the generation and characterization of murine oral mucosal organoid cultures. Primary epithelial cells are isolated from murine tongue tissue, embedded into an ECM hydrogel, and cultured in a medium containing: epidermal growth factor (EGF), R-spondin, and fibroblast growth factor (FGF) 10. Within 7 to 14 days of initial seeding, the resulting organoids can be passaged for further expansion and cryopreservation. We additionally present strategies for the characterization of established organoid cultures via 3D whole-mount imaging and gene-expression analysis. This protocol may serve as a tool to investigate oral epithelial stem cell behavior ex vivo in a reductionist manner.

<meta charset="utf8"></head><body>Geração e caracterização de culturas organoides da mucosa oral murina

We present a method for the generation and characterization of oral mucosal organoid cultures derived from the tongue epithelium of adult mice.

Geração e caracterização de culturas organoides da mucosa oral murina

The mucous lining covering the inside of our mouth, the oral mucosa, is a highly compartmentalized tissue and can be subdivided into the buccal mucosa, ...